張玲，虞旻珍，張欣，萬意佳，宣麗華

(浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

穴位貼敷對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠IL-4、LTC4的影響

張玲，虞旻珍，張欣，萬意佳，宣麗華*

(浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

目的：觀察采用本院治未病貼膏進(jìn)行穴位貼敷治療對(duì)AR模型大鼠的治療效應(yīng)及對(duì)IgE、IL-4、LTC4的影響。方法：選用40只SPF級(jí)健康SD大鼠，鹽水對(duì)照組、模型組、貼敷治療組、丙酸氟替卡松組，采用OVA與氫氧化鋁腹腔注射及OVA滴鼻誘發(fā)制備AR模型，鹽水對(duì)照組予以同樣劑量的生理鹽水。觀察大鼠鼻部癥狀，記錄嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)血IgE、IL-4水平及鼻腔灌洗液LTC4表達(dá)。 結(jié)果：1.與對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中EOS數(shù)量顯著上升(P<0.01)；穴位貼敷組、丙酸氟替卡松組與模型組比較， EOS數(shù)量顯著降低(P<0.01)；2.與鹽水對(duì)照組比較，模型組大鼠外周血清IgE、IL-4含量顯著升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，貼敷治療組與丙酸氟替卡松對(duì)照組血清IgE、IL-4含量均顯著降低(P<0.05)；3.與鹽水組比較, 模型組大鼠鼻腔灌洗液中的LTC4含量明顯增高(P<0.01)；模型組比較，穴位貼敷組鼻腔灌洗液中的LTC4含量減低(P<0.05)。結(jié)論：采用治未病貼膏穴位貼敷治療可調(diào)節(jié)IgE、IL-4 、LTC4水平，顯著改善AR大鼠變應(yīng)性反應(yīng)。

穴位貼敷;變應(yīng)性鼻炎;IL-4;LTC4

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)也稱過敏性鼻炎，臨床表現(xiàn)以鼻癢、打噴嚏、流清涕等為主要癥狀，為接觸變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)的炎癥而引起的鼻部癥狀性疾病。變應(yīng)性鼻炎發(fā)病率高，具有反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的特點(diǎn)，臨床實(shí)踐顯示三伏天行穴位貼敷治療對(duì)AR有良好的防治效果，具有副作用小、遠(yuǎn)期療效好的特點(diǎn)[1-3]。本課題組在多年臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上制成治未病貼膏，前期研究結(jié)果顯示，“治未病”貼膏穴位貼敷可顯著改善對(duì)變應(yīng)原性物質(zhì)的反應(yīng)及哮喘、噴嚏、鼻癢等癥狀，減少發(fā)作次數(shù)，具有良好療效。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究穴位貼敷治療對(duì)免疫因子IL-4、LTC4的影響，以研究其靶點(diǎn)與作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守“3R”原則(Reduction，Replacement，Refinement)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷和使用的指導(dǎo)原則。共選用40只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為180～230g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016，隨機(jī)分為4組：鹽水對(duì)照組、AR模型組(以下簡(jiǎn)稱模型組)、穴位貼敷組、丙酸氟替卡松組。

1.2 主要儀器與試劑

天平：上海醫(yī)療器械廠；4℃冰箱：杭州華日電冰箱廠；移液器：德國(guó)Epperdorf公司；Rnase-free槍頭：Axygen公司；魚躍空氣壓縮式霧化器：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。卵清蛋白(OVA)：美國(guó)Sigma公司；AlCl3：阿拉丁試劑上海分公司；NaOH：杭州蕭山化學(xué)試劑廠；0.9%氯化鈉注射液：上海百特醫(yī)療用品有限公司；丙酸氟替卡松鼻噴霧劑：英國(guó)葛蘭素史克制藥集團(tuán)；穴位貼敷中藥：浙江省中醫(yī)院中藥房提供。

1.3 模型制備

模型組、穴位貼敷組、丙酸氟替卡松組的SD大鼠采用OVA結(jié)合氫氧化鋁致敏法建立AR模型，方法如下：(1)基礎(chǔ)致敏：腹腔注射由OVA 0.3 mg、氫氧化鋁30 mg和生理鹽水1 mL制成的混懸液，隔日1次，共 7 次。(2)激發(fā)：完成腹腔注射OVA后，每日予5%OVA滴鼻50 μL(側(cè)/d)及1%OVA的超聲霧化吸入(5 min/天)，連續(xù)7 d。鹽水組每日給予注射及吸入同等劑量的生理鹽水。

1.4 治療方法

穴位貼敷組的穴位選擇：選取大椎及雙側(cè)的肺俞、脾俞、腎俞(李宗仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠穴位)。大椎：第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。肺俞：第三胸椎下兩旁肋間。脾俞：第12胸椎下兩旁肋間。腎俞：第二腰椎下兩旁。穴位貼敷組的藥物選擇：選用生白芥子、延胡索、生甘遂、細(xì)辛、冰片按1∶1∶0.5∶0.5∶0.1的比例研細(xì)末，混勻后用水調(diào)和制成糊狀；并將中藥貼膏制成直徑為0.5 cm，厚約0.1 cm規(guī)格的藥餅。操作：造模成功后，將大鼠皮膚脫毛后選取相應(yīng)的大椎、肺俞、脾俞、腎俞進(jìn)行穴位貼敷治療。每次貼敷時(shí)間為2 h，隔日1次，連續(xù)治療2周。

丙酸氟替卡松組：造模成功后，選取丙酸氟替卡松滴鼻，單側(cè)鼻孔，每次50 μg，每天1次，連續(xù)治療2周。

鹽水對(duì)照組與模型組：造模成功后，選取生理鹽水滴鼻，單側(cè)鼻孔，每次50 μg，每天1次，連續(xù)2周。

1.5 觀察指標(biāo)

行為學(xué)觀察：觀察治療后大鼠鼻癢、噴嚏、流涕等行為的變化。

治療結(jié)束后取大鼠鼻腔灌洗液及鼻中隔，檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞、IgE及LTC4各項(xiàng)指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠體征觀察

造模成功評(píng)價(jià)指標(biāo)采用行為學(xué)評(píng)分(趙秀杰等[20]的癥狀評(píng)分表)判定：末次激發(fā)后0.5 h及給藥后2 h觀察動(dòng)物的搔鼻、打噴嚏、流涕三項(xiàng)癥狀，進(jìn)行量化評(píng)分，評(píng)分>5分表示造模成功。見表1。

表1 癥狀評(píng)分表

2.2 大鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)

模型組與鹽水對(duì)照組比較，大鼠鼻黏膜組織中的EOS數(shù)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；穴位貼敷組、丙酸氟替卡松組與模型組比較，大鼠鼻黏膜組織中的EOS數(shù)量明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；穴位貼敷組與丙酸氟替卡松組比較，大鼠鼻黏膜組織中的EOS未見明顯差異(P>0.05)。見圖1。

表2 各組大鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)

注：與鹽水對(duì)照組比較，△P<0.01;與模型組比較，*P<0.01

圖1 各組大鼠鼻黏膜HE染色圖

2.3 外周血IgE、IL-4含量

與鹽水對(duì)照組比較，模型組大鼠外周血清IgE、IL-4含量明顯升高(P<0.05)；與AR模型組比較，貼敷治療組和丙酸氟替卡松對(duì)照組IgE、IL-4含量顯著降低(P<0.05)；與丙酸氟替卡松對(duì)照組比較，穴位貼敷組與丙酸氟替卡松組未見顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 外周血IgE、IL-4含量

注：與鹽水對(duì)照組比較，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.4 大鼠鼻腔灌洗液白三烯C4(LTC4)

與鹽水對(duì)照組比較, 模型組大鼠鼻腔灌洗液中的LTC4含量明顯增高(P<0.01)；模型組比較，穴位貼敷組鼻腔灌洗液中的LTC4含量減低(P<0.05)；與丙酸氟替卡松組比較，穴位貼敷組大鼠鼻腔灌洗液中的LTC4含量差異未見顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 大鼠鼻腔灌洗液白三烯C4(LTC4)結(jié)果

注：與鹽水對(duì)照組比較，△P<0.01;與模型組比較，*P<0.05

3 討論

變應(yīng)性鼻炎(AR)發(fā)病率占鼻科疾病首位，具有反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的特點(diǎn)。目前西醫(yī)治療采用脫敏、免疫及激素等方法，雖短期療效良好但停藥后效果難以維持，且部分藥物副作用明顯。多項(xiàng)研究報(bào)道證實(shí)中醫(yī)藥、針灸治療對(duì)AR有良好的治療效果，且具有副作用小、遠(yuǎn)期療效好的特點(diǎn)。穴位貼敷療法是中藥治療結(jié)合經(jīng)絡(luò)腧穴理論，采用的防病治病的一種療法。以中藥制劑貼敷于相關(guān)臟腑腧穴可振奮陽氣，從而達(dá)到預(yù)防及治療因陽虛衛(wèi)外不固而易患之“鼻鼽、哮病、喘病”等疾病的目的，方法簡(jiǎn)便易行，治療時(shí)間短，臨床治療中已應(yīng)用多年。

變應(yīng)性鼻炎中醫(yī)稱之為“鼻鼽”，首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“鼽者，鼻出清涕也”“鼽者，鼻中癢而氣嚏作于聲也”。唐代孫思邈從肺、腎虛論治本病，東垣認(rèn)為其屬虛、屬寒，明清醫(yī)家則多從“肺脾氣虛”辨治。本課題組采用貼膏是在中醫(yī)“冬病夏治”“治未病”理論指導(dǎo)下，吸取現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與透皮給藥系統(tǒng)理論制成，其中諸藥作用為：白芥子性辛溫，善走散；甘遂具有瀉水飲、破積聚功效；細(xì)辛溫化寒飲，生姜辛溫解表，眾藥合用散寒化飲，益氣固表。本課題組對(duì)藥物制備方法進(jìn)行改良制成現(xiàn)有藥劑，貼敷于肺脾腎相關(guān)背俞穴，臨床實(shí)踐證明對(duì)患者皮膚刺激及不良反應(yīng)較小，安全有效[2-3]。

AR是指機(jī)體在接觸應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的致敏介質(zhì)釋放，引起大量免疫細(xì)胞因子參與的鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)性疾病。嗜酸粒細(xì)胞是炎癥變化的特征標(biāo)志，病理過程伴有血清IgE升高與嗜酸性粒細(xì)胞增多[4]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明穴位貼敷可有效降低IgE水平，減少嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，從而控制致敏介質(zhì)引起的鼻黏膜反應(yīng)，減輕臨床癥狀。

目前研究多認(rèn)為AR發(fā)生與 Th1/Th2 免疫失衡密切相關(guān)，可見其炎癥病理過程中表現(xiàn)出鼻黏膜Th2免疫反應(yīng)占顯著優(yōu)勢(shì)[5]。IL-4有利于Th2細(xì)胞的分化,是AR病理過程中重要的炎性因子，可明顯增強(qiáng)免疫球蛋白類物質(zhì)轉(zhuǎn)換為 IgG 及IgE，誘發(fā)IgE 的基因重組及啟動(dòng)信使RNA 的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)IgE 產(chǎn)生[6-7]，在少量抗原刺激下顯著增強(qiáng)免疫應(yīng)答，發(fā)生變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[8]。白三烯(LTs)是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物之一，包括LTC4、LTD4和LTE4。目前研究顯示在哮喘與AR發(fā)病過程中，當(dāng)機(jī)體受到致敏物質(zhì)刺激時(shí)LT尤其是LTC4釋放增加[9]，促進(jìn)炎癥細(xì)胞向氣道集聚，引起氣道平滑肌收縮[10-11]，血管通透性增加及黏液分泌，增加鼻的氣道阻力，加重鼻堵塞，引起呼吸道炎癥與氣道高反應(yīng)性，在變應(yīng)性鼻炎的病理過程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AR模型大鼠IL-4、LTC4表達(dá)升高，與鹽水組有顯著差異，經(jīng)穴位貼敷后明顯降低，可證實(shí)穴位貼敷可通過調(diào)節(jié)IL-4、LTC4水平控制鼻黏膜炎癥。

本課題組所改良中藥制劑治療氣道炎癥已有多年臨床經(jīng)驗(yàn)，并已獲得國(guó)家專利，而目前生物學(xué)機(jī)制尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)本制劑可有效改善鼻炎癥狀，調(diào)控鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞水平，此作用是通過調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子如IL-4、LTC4，影響TH1/TH2免疫平衡起效，其系統(tǒng)機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

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ImpactofAcupointApplicationonIL-4andLTC4inRatswithAllergicRhinitis

ZHANG Ling, YU Min-zhen, ZHANG Xin, WAN Yi-jia, XUAN Li-hua

(ZhejiangProvincialHospitalofTCM,Hangzhou310006,China)

Objective: To study the effect of acupoint application therapy with Zhiweibing(preventive treatment of disease) patch on AR(allergic rhinitis) rats, and its influence to serum IgE, IL-4 and LTC4. Methods:40 SD rats were randomly divided into the blank control group, AR model group, acupoint application group, and fluticasone propionate group. AR models were established by injecting OVA and aluminium hydroxide, and nasal inhalation of OVA. The blank control group was given normal saline. Nasal symptoms, eosinophils(EOS) amount, levels of IgE and IL-4, and expression of LTC4 were observed and tested. Results: In terms of EOS amount, it was significantly increased in the model group compared to the blank control group(P<0.01); and it was decreased greatly after the treatment(P<0.01); in terms of serum IgE and IL-4, they were both became higher after modeling(P<0.05), and they were reduced obviously in the acupoint application group and fluticasone propionate group(P<0.05); in terms of LTC4 expression, it was increased significantly in the model group compared to the blank control group(P<0.01), it was decreased greatly in the acupoint application group compared to the model group. Conclusion: Acupoint application can regulate IgE, IL-4 and LTC4 to improve allergic reaction in AR rats.

Acupoint application; Allergic rhinitis; IL-4; LTC4

R245.9

A

1002-2392(2017)06-0037-03

2016-10-24

2017-09-01

浙江省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃(2014C03046-2)

張玲(1978-),女,博士，主治醫(yī)師，研究方向：針灸神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

*通訊作者：宣麗華(1960-)，女，教授，主任醫(yī)師，研究方向：針灸的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。