曾燕，郭蘭萍，王繼永*，黃璐琦*

(1.中國中藥公司，北京 102600；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

基于微量量熱法的不同來源黃芩抑菌活性對比研究△

曾燕1，郭蘭萍2，王繼永1*，黃璐琦2*

(1.中國中藥公司，北京 102600；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

目的構(gòu)建基于生物熱技術(shù)的不同來源黃芩抑菌活性區(qū)分方法，基于生物熱技術(shù)考察不同來源黃芩的抑菌活性差異。方法采用微量量熱技術(shù)，研究不同來源黃芩對大腸桿菌生長代謝的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，考察栽培區(qū)域、采收期、生長年限和種質(zhì)等的差異對黃芩抑菌活性的影響。結(jié)果不同產(chǎn)地黃芩熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)特征差異較大，其抑制率在24.3%～129.5%，其中河北承德和內(nèi)蒙古武川黃芩抑菌活性顯著高于山東莒縣和山西運(yùn)城；隨著藥材采收月份的變化(7—11月)，黃芩的抑菌活性出現(xiàn)了先下降后急劇增加的現(xiàn)象，且在11月份抑菌活性達(dá)到最強(qiáng)；對比不同生長年限的黃芩(2～5年)，總體上黃芩藥材的抑菌活性隨著藥材生長年限的增加而增強(qiáng)；多點(diǎn)試驗(yàn)考察不同種質(zhì)黃芩藥材抑菌活性發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)黃芩抑菌活性差異較大，其表現(xiàn)出來的抑菌活性與緯度跨越有關(guān)。結(jié)論不同產(chǎn)地黃芩抑菌活性存在一定的差異，藥材的采收時(shí)間、生長年限以及種質(zhì)等的差異均能對黃芩抑菌率產(chǎn)生影響。基于生物熱技術(shù)的微量量熱技術(shù)用于不同來源藥材的區(qū)分，較傳統(tǒng)的藥理、化學(xué)和形態(tài)學(xué)方法具有一定的便捷性和快速性，可作為進(jìn)一步區(qū)分不同來源藥材藥效差異的依據(jù)之一。

黃芩；微量量熱法；生物活性；品質(zhì)區(qū)分

在生命體生長、繁殖、衰亡過程中，伴隨代謝有熱量釋放，釋放的熱量隨生長期的變化關(guān)系就是熱活性譜線圖(簡稱“熱譜圖”)。生物熱動(dòng)學(xué)參數(shù)可對生物體在生長代謝過程中的相關(guān)信息進(jìn)行定性、定量分析，有較強(qiáng)的專屬性、靈敏性和重現(xiàn)性[1]。

隨著生物熱理論和技術(shù)的日趨完善和成熟，微量量熱法在藥物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用也日益廣泛，如藥物穩(wěn)定性研究、藥物抗腫瘤、藥物制劑研究、藥物活性的定量構(gòu)效關(guān)系、抗菌藥物活性篩選研究以及聯(lián)合用藥等方面[2]。目前，基于生物熱的微量量熱技術(shù)在中藥藥性的科學(xué)闡釋、中藥活性成分的活性評價(jià)、中藥注射劑的安全性評價(jià)等方面多有探討，這是對中醫(yī)藥傳統(tǒng)研究思路和研究方法的拓展。具有高靈敏度的微量量熱儀可以直接、連續(xù)地測量生物體生長過程中的熱量變化，進(jìn)一步反映生物體的整個(gè)生長代謝過程能量的轉(zhuǎn)移。該技術(shù)為解決中藥質(zhì)量控制和藥效評價(jià)等復(fù)雜性難題提供了一些思路，并具有一些優(yōu)越性[3]。

在中藥材質(zhì)量評價(jià)中，單一的化學(xué)評價(jià)方法越來越受到質(zhì)疑，而傳統(tǒng)的藥理學(xué)評價(jià)方法又較為繁瑣?；谖⒘苛繜峒夹g(shù)的中藥材質(zhì)量評價(jià)方法或可作為中藥材質(zhì)量區(qū)分的依據(jù)之一，如不同產(chǎn)地藥材品質(zhì)對比[4-6]、不同種質(zhì)活性評價(jià)[7-8]、不同生長年限藥材的活性評價(jià)[9]、中藥材不同藥效部位的活性評價(jià)等方面有過一些研究[10-11]。

黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi為唇形科多年生藥用植物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃芩具有抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、抗炎、抗菌等作用，并對免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等具有一定的有保護(hù)和治療作用[12-14]。不同來源黃芩，包括產(chǎn)地、生長年限等方面的差異將導(dǎo)致黃芩質(zhì)量差異[15-17]。這些差異不僅體現(xiàn)在藥材外觀性狀上的差異和化學(xué)成分上的差異，也應(yīng)體現(xiàn)在生物活性和臨床功效上的差異，而相關(guān)研究非常之少[18]?；诖耍覀兪占煌a(chǎn)區(qū)、不同生長年限、不同采收期的黃芩進(jìn)行生物熱對比研究；同時(shí)進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)，考察黃芩種質(zhì)差異對黃芩藥材生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)和抑菌活性的影響。采用微量量熱法評價(jià)不同黃芩的“活性”，為黃芩道地藥材研究提供更豐富的信息，同時(shí)也拓展新技術(shù)、新方法在中藥材質(zhì)量評價(jià)方面的應(yīng)用。

1 材料與儀器

黃芩藥材：于2013年采集河北、內(nèi)蒙古、山西和山東不同產(chǎn)地栽培黃芩。藥材來源包括不同產(chǎn)區(qū)商品田藥材，田間受控試驗(yàn)藥材，不同采收期、不同生長年限藥材樣品共計(jì)50份，另外收集1份黃芩栓皮樣本1份，樣品信息見表1，樣品采集后55 ℃烘干，粉碎，過四號(hào)篩備用。

黃芩浸膏制備：取黃芩粉末10 g，加80 mL 70% 乙醇，超聲提取1 h，抽濾，80 ℃水浴揮發(fā)24 h，80 ℃烘箱烘40 h，研磨粉碎，80 ℃烘箱烘干8 h，即得黃芩浸膏粉末樣品。

菌株：根據(jù)生物熱力學(xué)研究特點(diǎn)和本研究所選中藥的主要生物活性，擬選取在分子生物學(xué)和基因工程中體外培養(yǎng)技術(shù)成熟、代謝功率較大的大腸桿菌作為本研究主要的生物模型。大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)由解放軍302醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心提供，自行傳代于第四代，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基，準(zhǔn)確稱取10.0 g胰蛋白胨、5.0 g酵母浸膏、10.0 g氯化鈉混合均勻，加入1000 mL超純水溶解，調(diào)pH 7.2～7.4，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min，放置空氣中冷卻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Thermometric 3114/3236 TAM Air Isothermal Calorimeter8通道微量量熱儀(美國TA公司)。

表1 51份黃芩樣品信息

表1(續(xù))

注：*表示黃芩栓皮。

2 方法

2.1 微量量熱法實(shí)驗(yàn)條件

根據(jù)前期技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，本研究確定不同黃芩樣品生物熱動(dòng)力學(xué)測定條件：37 ℃等溫條件下，培養(yǎng)至3～5代的大腸桿菌(菌號(hào)為44103)，接種量為1×106個(gè)·mL-1，LB培養(yǎng)基，安瓿法(2.5 mL)。同時(shí)本研究在以上的實(shí)驗(yàn)條件下，對微量量熱法進(jìn)行了方法學(xué)考察。

2.2 不同檢測通道等同性考察

本部分實(shí)驗(yàn)測定在上述相同條件下，以大腸桿菌為生物模型，LB為培養(yǎng)基對置于TAM Air微量量熱儀8個(gè)通道中的大腸桿菌代謝同時(shí)進(jìn)行監(jiān)測，記錄熱譜曲線，并進(jìn)行各熱譜曲線相似度(S)評價(jià)。結(jié)果表明，不同通道所測得的熱譜曲線相似度均大于0.8，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下TAM Air微量量熱儀的各個(gè)通道所測定結(jié)果具有高度的等同性。

2.3 生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)的抽提

功率-時(shí)間(P-t)曲線和對數(shù)lnP-t曲線的獲?。簩碴称糠湃牒銣赜?7 ℃的八通道微量量熱儀中，儀器自動(dòng)跟蹤記錄大腸桿菌生長代謝過程中的熱功率變化，記錄結(jié)束提取實(shí)驗(yàn)時(shí)間和熱功率數(shù)據(jù)，使用Origin 8.0軟件(OriginLab公司，美國)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，功率為縱坐標(biāo)作圖，得到P-t曲線(Ⅰ)和對數(shù)lnP-t曲線(Ⅱ)。

大腸桿菌代謝分期和生長速率常數(shù)k：正常大腸桿菌的生長代謝過程由P-t曲線形狀可以看出分為4個(gè)時(shí)期：第一指數(shù)生長期(a-b)、停滯期(b-c)、第二指數(shù)生長期(c-d)和衰亡期(d-e)。同時(shí)，從P-t曲線中得到反映細(xì)菌生長代謝的熱力學(xué)參數(shù)：細(xì)菌在指數(shù)生長期的最大產(chǎn)熱功率P1、P2，達(dá)峰時(shí)間t1、t2及不同時(shí)期的細(xì)菌代謝熱Q。

通過lnP-t曲線，得到關(guān)于指數(shù)生長期的lnP與t的線性方程：

lnP=lnP0+kt

(1)

式中：P為t時(shí)所對應(yīng)的產(chǎn)熱功率，P0為t=0時(shí)所對應(yīng)的產(chǎn)熱功率。

從方程(1)中得到細(xì)菌在指數(shù)生長期生長速率常數(shù)k1、k2。

抑菌率I計(jì)算公式為：

I=[(t2-t0)/t0]×100%

(2)

式中：t0為空白組第二指數(shù)生長期達(dá)峰時(shí)間，t2為給藥組第二指數(shù)生長期的達(dá)峰時(shí)間。

圖1 大腸桿菌生長代謝的熱譜曲線：P-t曲線(Ⅰ)和對數(shù)lnP-t曲線(Ⅱ)(T=37 ℃，n=3)

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SPSS 19.0對樣品熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，用Excel 2013進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)和統(tǒng)計(jì)圖形的制作。

3 結(jié)果

3.1 黃芩樣品劑量的確定

以1號(hào)樣品為研究對象進(jìn)行劑量考察。精密稱取1號(hào)樣品270 mg，在無菌條件下，加入18 mL的LB培養(yǎng)基混合均勻，使供試品母液終濃度為15 mg·mL-1。配制接種用大腸桿菌培養(yǎng)液25 mL。將藥液、大腸桿菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)基按表2體積數(shù)加入安瓿瓶中，使終體積10 mL。加蓋瓶塞，密封，混合均勻，將安瓿瓶轉(zhuǎn)移至微量量熱儀通道中，跟蹤記錄大腸桿菌生長熱譜曲線，見圖 2。

表2 八通道加入體積數(shù)和樣品濃度

圖2 不同濃度黃芩1號(hào)樣品作用下大腸桿菌生長代謝熱譜曲線

從圖2可以看出，在0.9～6.3 mg·mL-1內(nèi)，黃芩1號(hào)樣品可明顯抑制大腸桿菌生長代謝。以空白組為參照，0.9、1.8、2.7、3.6、4.5、5.4、6.3 mg·mL-17個(gè)不同質(zhì)量濃度樣品對大腸桿菌的抑制率依次為11.5%、17.7%、22.3%、26.1%、30.8%、36.1%、41.5%。從抑制率可以看出，隨著藥物劑量增加，對大腸桿菌生長代謝的抑制作用不斷增強(qiáng)。為避免藥物濃度過大而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，控制抑制率在合理范圍內(nèi)(相當(dāng)于1號(hào)樣品質(zhì)量濃度5 mg·mL-1)，結(jié)合藥材浸膏得率，擬選取相當(dāng)于原藥材110 mg進(jìn)行不同產(chǎn)地黃芩樣品抑制大腸桿菌活性對比研究。

3.2 不同黃芩樣品抑菌活性比較

3.2.1 不同黃芩樣品抑菌活性總體比較 將處理好的黃芩樣品移到微量量熱儀通道中，儀器自動(dòng)記錄熱譜曲線，如圖 3。不同樣品的抑菌率見表 3。

表3 不同產(chǎn)地黃芩樣品作用下的大腸桿菌生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)(T=37 ℃，n=3)

注：A.1～7號(hào)樣品；B.8～14號(hào)樣品；C.15～21號(hào)樣品；D.22～28號(hào)樣品；E.29～35號(hào)樣品；F.36～42號(hào)樣品；G.43～49號(hào)樣品；H.50～51號(hào)樣品。圖3 相同劑量不同黃芩樣品作用下大腸桿菌的生長代謝熱譜曲線(T=37 ℃，n=3)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地黃芩大腸桿菌抑菌率在24.3%～129.5%，各樣品抑菌活性存在較大差異。

3.2.2 不同栽培區(qū)黃芩藥材的抑菌活性對比 對來自河北承德、內(nèi)蒙古武川、山東莒縣和山西運(yùn)城的黃芩藥材進(jìn)行抑菌活性對比發(fā)現(xiàn)(見圖 4)：承德樣品和武川樣品的抑菌活性均顯著高于莒縣和運(yùn)城樣品，承德樣品分別比莒縣和運(yùn)城樣品高出69.14%和113.69%。

注：a、b表示不同樣品彼此之間的差異，P <0.05；下同。圖4 不同來源黃芩藥材抑菌活性比較(n=3～10)

3.2.3 不同采收期黃芩藥材抑菌活性對比 本實(shí)驗(yàn)中的黃芩材料來源于河北承德黃芩基地。于2012年4月份種子直播，2013年7月中旬—11月中旬，分5次分別取樣，制備提取物用于生物活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總體上7—11月份黃芩提取物抑菌活性出現(xiàn)了先下降后增加的趨勢，8—10月份抑菌活性逐漸降到最低，在11月份最高(見圖5)。

注：分別取1份混合樣品，每份樣品30～40株。圖5 不同采收時(shí)間黃芩藥材抑菌活性比較

3.2.4 不同生長年限黃芩藥材抑菌活性對比 本實(shí)驗(yàn)的黃芩材料分別取自河北承德縣和內(nèi)蒙古武川縣的黃芩藥材商品田，藥材提取物用于生物活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總體上兩個(gè)區(qū)域黃芩藥材的抑菌活性均呈現(xiàn)隨藥材生長年限增加而增強(qiáng)的趨勢；2年生藥材的抑菌活性分別增加了32.55%和36.20%(見圖 6)。

注：A.內(nèi)蒙古樣品；B.河北承德樣品；每份樣品為30～40株的混合樣品。圖6 不同生長年限黃芩藥材抑菌活性比較

3.2.5 黃芩栓皮和黃芩藥材的抑菌活性對比 對比黃芩栓皮和黃芩根部的抑菌活性發(fā)現(xiàn)(見圖 7)，所有測試樣品抑菌活性在24.3%～129.5%，黃芩藥材平均抑菌率為62.96%，黃芩外栓皮為111.90%，高出藥材平均值的77.73%。

3.2.6 不同種質(zhì)對黃芩抑菌活性的影響 對不同種質(zhì)黃芩2年生藥材進(jìn)行抑菌活性對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在承德實(shí)驗(yàn)區(qū)中(見圖8A)，河北種質(zhì)和內(nèi)蒙古種質(zhì)抑菌活性無差異，山東種質(zhì)抑菌活性顯著高于河北和內(nèi)蒙古種質(zhì)；在內(nèi)蒙古實(shí)驗(yàn)區(qū)中(見圖8C)，承德種質(zhì)和內(nèi)蒙古種質(zhì)黃芩抑菌活性接近。在山東實(shí)驗(yàn)區(qū)中(見圖8B)，承德種質(zhì)抑菌活性高出山東近2倍。

注：每份樣品為30～50株的混合樣品。圖7 不同生長年限黃芩藥材抑菌活性比較

注：A.承德試驗(yàn)區(qū)(n=4)；B.山東試驗(yàn)區(qū)；C.內(nèi)蒙古試驗(yàn)區(qū)；每個(gè)試驗(yàn)區(qū)均取1份樣品，每份樣品為30～40株的混合樣品。圖8 不同種質(zhì)黃芩抑菌活性比較

4 結(jié)論與討論

本研究采用微量量熱法考察了不同來源黃芩抑菌活性的差異，對不同黃芩的抑菌活性進(jìn)行對比，得出如下結(jié)論：1)不同來源黃芩藥材的抑菌活性存在較大差異；2)河北和內(nèi)蒙古樣品的抑菌活性顯著高于山東和山西樣品；3)不同采收期黃芩抑菌活性出現(xiàn)了先下降后增加的趨勢，11月份抑菌活性最強(qiáng)；4)黃芩藥材的抑菌活性隨著藥材生長年限的增加而出現(xiàn)增強(qiáng)；5)不同試驗(yàn)區(qū)中不同種質(zhì)黃芩抑菌活性差異較大，黃芩移栽到不同栽培區(qū)后，其抑菌活性出現(xiàn)了顯著的增加，其抑菌活性可能與緯度跨越有關(guān)。

基于微量量熱法的中藥生物熱活性檢測技術(shù)具有實(shí)時(shí)在線、靈敏、準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)、普適性好的特點(diǎn)，符合中藥藥效評價(jià)的客觀現(xiàn)實(shí)和發(fā)展方向，在理論上比現(xiàn)行的中藥指標(biāo)性成分定性定量分析具一定優(yōu)勢[2，19-26]。如采用微量量熱法研究粉防己中防己堿金屬配合物的生物活性[27]，對甘草中的多糖組分進(jìn)行了抑菌活性研究[28]，另外在茵陳、麻黃、草烏、麥冬、板藍(lán)根、人工牛黃等中藥材研究上也有應(yīng)用，研究人員認(rèn)為微量量熱法是一種有效的體外篩選藥物的方法，可以指導(dǎo)藥物設(shè)計(jì)、揭示藥物與微生物間的相互作用機(jī)制，并且在指導(dǎo)臨床上合理使用抗菌藥等方面具有重要的應(yīng)用和理論價(jià)值[29-34]。

本研究試圖探索一種基于化學(xué)成分與臨床藥效評價(jià)之間的技術(shù)方法，解決一些中藥材研究過程的共性問題。包括如何更科學(xué)地指導(dǎo)中藥材的適時(shí)采收，對不同產(chǎn)地和種質(zhì)的藥材進(jìn)行身份鑒定，對不同生長年限的藥材進(jìn)行區(qū)分，也包括用于建立道地藥材評價(jià)體系等。

總之，從某種意義上來講，生物活性測定與化學(xué)成分測定相比，在某種程度上體現(xiàn)了中藥的整體效應(yīng)，符合中醫(yī)藥的整體觀[9]，可作為中藥藥效評價(jià)的“預(yù)評價(jià)”方法，對于構(gòu)建中藥材道地性研究評價(jià)體系具有一定的借鑒作用。

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ComparativeStudyonBacteriostaticActivityofdifferentScutellariabaicalensisBasedonMicrocalorimetricTechnique

ZENG Yan1，GUO Lanping2，WANG Jiyong1*，HUANG Luqi2*

(1.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation,Beijing100195，China； 2.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700，China)

Objective： To study the bacteriostatic activity of differentScutellariabaicalensisbased on the microcalorimetric technique.MethodsThe effects of differentS.baicalensison the thermokinetics parameters ofEscherichiacolimetabolism were studied by using the technology of microcalorimetric, and the differences of bacteriostatic activity ofS.baicalensison different cultivation area, harvesting time, growing year and germplasm were compered.ResultsThe results showed the differences about thermokinetics parameters among the differences cultivation area. The bacteriostatic activity changed between 24.3% and 129.5%, and the samples root from Hebei and Neimeng showed stronger bacteriostatic activity than those from Shangdong and Shangxi. It exhibited the first declining later increasing of bacteriostatic activity with the harvesting time changing (from the July to the November), and the strongest bacteriostatic activity occurred in November. There were also the trends of gradually increase on the bacteriostatic activity with the increasing years of planting (from two years to five years). The experimental result of multi-site testes showed a big difference among the different plant germplasm, it should be a relevance between bacteriostatic activity and the spanning of latitude across.ConclusionThere exist some differences among these samples from difference cultivated area and the harvesting time, growing years and germplasm should also affect the bacteriostatic activity. It is concluded that the method based on the microcalorimetric technique could be used to distinguish the differentS.baicalensis, and is more convenient and faster, also provide more information for distinguish pharmacological activity of different drug sources.

ScutellariabaicalensisGeorgi; microcalorimetric; biological activity; quality distinguish

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.010

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201407005-5，201507002)；中國中藥公司博士后專項(xiàng)(2012)；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(2013)；

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王繼永，研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：wangjiyong75@163.com；黃璐琦，中國工程院院士，研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：huangluqi01@126.com

2015-03-02)