宋思佳， 呂 健， 劉懷高， 羅永康

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083；2國(guó)肽生物科技(北京)有限公司，北京，100011)

鰱魚(yú)魚(yú)皮蛋白肽的制備與抗氧化活性評(píng)價(jià)

宋思佳1， 呂 健1， 劉懷高2， 羅永康1

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083；2國(guó)肽生物科技(北京)有限公司，北京，100011)

為制備抗氧化活性良好的鰱魚(yú)魚(yú)皮蛋白肽，采用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶等4種常見(jiàn)的商業(yè)酶對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)皮進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解物的ABTS自由基清除力和Fe2+螯合力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，并用超濾及凝膠層析對(duì)酶解物進(jìn)行分離，以期得到活性更好的酶解物分離組分。酶解后產(chǎn)物的抗氧化活性均有所提高，其中堿性蛋白酶酶解2 h產(chǎn)物活性較強(qiáng)。對(duì)此酶解物用截留分子量為10 kDa、5 kDa和3 kDa的中空纖維超濾膜進(jìn)行超濾，得到的4個(gè)組分中，分子量越小的組分抗氧化活性越強(qiáng)。分子量小于3 kDa的組分經(jīng)Sephadex G-15凝膠層析得到3個(gè)組分，其中分子量最大的組分活性較好，在0.51 mg/mL質(zhì)量濃度下測(cè)定其ABTS自由基清除率和Fe2+螯合力分別為(79.65±0.87)%和(93.40±0.20)%。該研究成果對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)皮抗氧化肽的開(kāi)發(fā)具有較好的指導(dǎo)作用。

鰱魚(yú)魚(yú)皮；酶解；抗氧化活性；超濾；凝膠層析

抗氧化劑研究對(duì)人體健康和食物品質(zhì)保持具有重要意義[1-3]。合成抗氧化劑活性強(qiáng)，但存在一定的副作用，如丁基羥基苯甲醚(BHA)會(huì)誘導(dǎo)DNA損傷[4]，威脅人體健康，尋找安全有效的天然抗氧化劑已成為研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，魚(yú)皮蛋白可以作為一種良好的活性肽來(lái)源，具有包括抗氧化活性在內(nèi)的多種生物活性。如酶解綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮，其產(chǎn)物具有較好的DPPH·、HO·和O2-·清除能力[5]；用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解史氏鱘魚(yú)皮，酶解物可作為抗氧化劑和冷凍保護(hù)劑加入絞碎的魚(yú)肉中[6]；酶解斑鱵皮膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解物兼具較好的抗氧化、抗菌及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性[7]。

鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)是我國(guó)主要養(yǎng)殖淡水魚(yú)之一，2016年全國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)450萬(wàn) t，位居淡水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量第二[8]。因缺乏有效的加工利用手段，其加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量魚(yú)皮下腳料，如果不加以利用會(huì)造成資源浪費(fèi)[9]。用鰱魚(yú)魚(yú)皮生產(chǎn)生物活性肽，不僅可提高魚(yú)皮的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還能在一定程度上減少資源浪費(fèi)與環(huán)境污染。本文以鰱魚(yú)魚(yú)皮為原料制備抗氧化活性肽。選用堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶4種來(lái)源與酶學(xué)特性均不同的商業(yè)蛋白酶進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解物的ABTS自由基清除力及Fe2+螯合力，分析抗氧化活性與蛋白酶種類(lèi)及酶解時(shí)間的關(guān)系，挑選出活性較佳的酶解物，用超濾及凝膠層析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離純化，以期得到活性更強(qiáng)的分離組分，為鰱魚(yú)魚(yú)皮的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚(yú)魚(yú)皮由武漢梁子湖水產(chǎn)品加工有限公司提供，胰蛋白酶來(lái)自丹麥諾維信公司，Alcalase 2.4 L、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶來(lái)自南寧龐博生物工程有限公司，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、菲咯嗪來(lái)自美國(guó)Sigma公司，其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器設(shè)備包括：TGL-16A冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)，F(xiàn)E-20 pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，F(xiàn)D-1PF冷凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)，UNICO-2800A紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，CLW-002中空纖維超濾膜組件、3 kDa超濾膜、5 kDa超濾膜、10 kDa超濾膜(北京旭邦膜設(shè)備有限公司)，BS-100A自動(dòng)部分收集器、HL-2B恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)，Sephadex G-15(美國(guó)Pharmacia公司)，Waters 600高效液相色譜、Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器、XBridge C18高效液相色譜分析柱(美國(guó)Waters公司)。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚(yú)魚(yú)皮酶解物制備

冷凍魚(yú)皮在室溫下流水解凍，去除殘留魚(yú)鱗及魚(yú)肉并剪碎，魚(yú)皮按1∶4(質(zhì)量/體積，w/V)加入去離子水，在90℃下加熱20 min對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)皮內(nèi)源酶進(jìn)行滅活，用勻漿機(jī)2 000 r/min 均質(zhì)1 min，制得勻漿液。將勻漿液加熱至各蛋白酶的最適作用溫度，用2 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至各蛋白酶的最適pH，按5 000 U/g蛋白比例加入菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，酶活參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009[10]測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。各蛋白酶的酶解物均在0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，快速取樣后再在90℃下加熱20 min滅酶，5 000 g離心20 min后吸除上層油脂，取其余上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到酶解物凍干粉。

表1選用蛋白酶的最適作用條件及酶活力

Tab.1 The optimum conditions and enzyme activity for the selected proteases

蛋白酶種類(lèi)酶活實(shí)測(cè)值kU/g溫度/℃pH菠蘿蛋白酶180506．5堿性蛋白酶500507．5木瓜蛋白酶320556．5胰蛋白酶890507．5

1.3.2 鰱魚(yú)魚(yú)皮酶解物抗氧化活性測(cè)定

(1)酶解物ABTS自由基清除力測(cè)定。參照相關(guān)方法[11]并略作修改，將2.45 mmol/L K2S2O8溶液和7 mmol/L ABTS溶液1∶1等體積混合，室溫下避光放置12～16 h制得ABTS反應(yīng)液，用0.2 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將0.8 mL的ABTS反應(yīng)液稀釋到734 nm下、吸光值0.68～0.72備用。配置5 mg/mL的酶解物溶液，取0.04 mL與4 mL ABTS反應(yīng)液混合均勻，常溫避光反應(yīng)1 h，測(cè)定其在734 nm下的吸光值，用去離子水做空白對(duì)照，根據(jù)以下公式計(jì)算酶解物ABTS自由基清除能力：

B= (1-A/C)×100

(1)

式中：B—ABTS自由基清除率，%；A—酶解物樣品在734 nm下的吸光值；C—空白對(duì)照在734 nm下的吸光值。

(2)酶解物Fe2+螯合力測(cè)定。根據(jù)Siu等[12]的方法，配置5 mg/mL的鰱魚(yú)魚(yú)皮酶解物樣品溶液，將1 mL樣品溶液與3.7 mL無(wú)水乙醇和0.1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液均勻混合后，加入0.2 mL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液，室溫下反應(yīng)10 min，測(cè)定反應(yīng)液在562 nm下的吸光值，用去離子水做空白對(duì)照，根據(jù)以下公式計(jì)算酶解物Fe2+螯合力：

F= (1-D/E)×100

(2)

式中：F—Fe2+螯合力，%；D—酶解物樣品在562 nm下的吸光值；E—空白對(duì)照在562 nm下的吸光值。

1.2.3 鰱魚(yú)魚(yú)皮酶解物的分離純化

(1)酶解物超濾分離。參考Power等[13]的方法，采用中空纖維膜超濾設(shè)備對(duì)抗氧化活性最佳的酶解產(chǎn)物初步分離，所用超濾膜的截留分子量分別為3 kDa、5 kDa和10 kDa，超濾過(guò)程中酶解物濃度30 mg/mL，流速1.2 mL/min，得到分子量大小不同的4個(gè)組分：F1(分子量>10 kDa)、F2(10 kDa>分子量>5 kDa)、F3(5 kDa>分子量>3 kDa)和F4(分子量<3 kDa)。測(cè)定超濾后組分的ABTS自由基清除力及Fe2+螯合力，對(duì)活性強(qiáng)的組分進(jìn)行繼續(xù)分離。

(2)Sephadex G-15凝膠層析分離。選用Sephadex G-15凝膠層析對(duì)超濾得到的小于3 kDa組分作進(jìn)一步分離，參考舒一梅等[14]的方法對(duì)凝膠填料粉進(jìn)行預(yù)處理，用去離子水將超濾后活性最強(qiáng)組分配置成10 mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣6 mL，以去離子水為洗脫液，流速1 mL/min，在280 nm下檢測(cè)樣品的吸光值，用收集器收集得到的組分，并測(cè)定其ABTS自由基活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均是重復(fù)測(cè)定3次得到，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用SAS 9.0軟件進(jìn)行顯著性分析，Excel 2016軟件繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類(lèi)及酶解時(shí)間對(duì)ABTS自由基清除力的影響

清除ABTS自由基能力和Fe2+螯合力是常用的體外評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的指標(biāo)[15]。如圖1所示，4種蛋白酶在各自最適條件下酶解鰱魚(yú)魚(yú)皮蛋白4 h。結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物ABTS自由基清除能力均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在前1 h內(nèi)快速增長(zhǎng)，2～4 h內(nèi)仍在增大只是增長(zhǎng)幅度變小。在整個(gè)酶解過(guò)程中，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力一直高于其他蛋白酶酶解產(chǎn)物(P<0.05)。蔡路昀等[16]用堿性蛋白酶酶解草魚(yú)魚(yú)皮2 h所得的產(chǎn)物也具有較好的ABTS自由基清除能力。堿性蛋白酶酶解4 h后產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，為(28.70±0.23)%。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)皮蛋白酶解產(chǎn)物 清除ABTS 自由基的影響

Fig．1 Effects of hydrolysis time on ABTS free radical-scavenging activity of the hypophthalmichthys molitrix skin protein hydrolysate

2.2 蛋白酶種類(lèi)及酶解時(shí)間對(duì)Fe2+螯合力的影響

如圖2所示，F(xiàn)e2+螯合力較酶解前均顯著增大，在0～1 h內(nèi)快速增長(zhǎng)，1 h后菠蘿蛋白酶酶解物Fe2+螯合力仍在增加，但增幅不及之前，其他蛋白酶解物在1 h后活性基本不變，胰蛋白酶酶解物的Fe2+螯合力顯著高于其他酶解物(P<0.05)。Wu等[17]用胰蛋白酶對(duì)太平洋鱈魚(yú)皮明膠進(jìn)行酶解，分離得到3個(gè)活性較好的Fe2+螯合肽，并發(fā)現(xiàn)均與Fe2+1∶1結(jié)合。本研究中，雖然胰蛋白酶酶解物的Fe2+螯合力最大，為(89.77±0.61)%，但堿性蛋白酶酶解物的ABTS自由基清除力和Fe2+螯合力均較高，綜合這兩項(xiàng)指標(biāo)，考慮選擇堿性蛋白酶酶解2 h產(chǎn)物進(jìn)行下一步超濾分離實(shí)驗(yàn)，其水解度為(21.79±0.08)%，也顯著高于其他蛋白酶酶解物(P<0.05)。Klompong等[18]用堿性蛋白酶酶解黃斑紋鲹魚(yú)肉蛋白，得出酶解物抗氧化活性與其水解度相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。水解度較大的堿性蛋白酶解產(chǎn)物與其它3種蛋白酶解物相比，抗氧化活性更強(qiáng)，這可能是由于經(jīng)蛋白酶切割后，水解度大的酶解物中暴露出肽鏈中抗氧化氨基酸側(cè)鏈及產(chǎn)生抗氧化氨基酸序列的幾率更大。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)皮蛋白酶解產(chǎn)物 亞鐵離子螯合力的影響

Fig．2 Effects of hydrolysis time on ferrous ion-chelating activity of the hypophthalmichthys molitrix skin protein hydrolysate

2.3 超濾分離及組分的抗氧化活性測(cè)定

堿性蛋白酶酶解2 h后產(chǎn)物經(jīng)中空纖維膜超濾分離得到分子量大小不同的4個(gè)組分。各組分清除ABTS自由基能力排序如下：F4>F3>F2>F1，差異顯著(P<0.05)(圖3A)。其中，堿性蛋白酶酶解2 h后產(chǎn)物與F3組分的無(wú)顯著性差異(P>0.05)。Chueng等[19]研究鱈魚(yú)酶解物超濾后產(chǎn)物的ABTS自由基清除力也得到了相同的趨勢(shì)，說(shuō)明多肽組分的分子量大小對(duì)其ABTS清除力具有重要影響。超濾前酶解物與超濾后得到的4個(gè)組分Fe2+螯合力均大于80%，按Fe2+螯合力排序：F4>F2>酶解產(chǎn)物>F1，差異顯著(P<0.05)，F(xiàn)2與F3組分的Fe2+螯合力差異不顯著(P>0.05)(圖3B)。此結(jié)果表明，肽段分子量大小影響其抗氧化活性，分子量越小的組分，其ABTS自由基清除能力及Fe2+螯合力越強(qiáng)，因此選擇組分F4進(jìn)行后續(xù)的凝膠層析分離。鄭捷等[20]對(duì)不同分子量真鯛魚(yú)骨多肽抗氧化活性的研究也得到了類(lèi)似的結(jié)果，分子量越小的超濾組分，其各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)均越強(qiáng)。

圖3 酶解產(chǎn)物及其超濾后4個(gè)組分清除ABTS自由基能力(A)，亞鐵離子螯合力(B)

Fig．3 ABTS radical scavenging activity ( A) and ferrous ion-chelating activity ( B) of hypophthalmichthys molitrix skin protein hydrolysate and the four ultrafiltration fractions

2.4 Sephadex G-15凝膠層析分離及其組分的抗氧化活性測(cè)定

凝膠層析過(guò)程中大分子物質(zhì)先被洗脫出來(lái)，小分子在后[21]。組分F4經(jīng)凝膠層析分離后得到的3個(gè)組分按洗脫時(shí)間由短到長(zhǎng)分別是F4-1、F4-2、F4-3，其分子量大小關(guān)系則為：F4-1>F4-2>F4-3。測(cè)定結(jié)果如圖4所示。清除ABTS自由基能力大小排序?yàn)椋篎4-1>F4-2>F4-3(P< 0.05)，F(xiàn)4-3的Fe2+螯合力顯著高于F4-1和F4-2(P<0.05)，分別為(94.92±0.32)%、(93.40±0.74)%和(93.15±0.10)%，但F4-1和F4-2無(wú)顯著性差異(P>0.05)。F4-1的Fe2+螯合力僅比F4-3低不到2%，而ABTS自由基清除力幾乎是F3的兩倍。綜合兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看，凝膠層析所得組分的抗氧化活性較好的組分是F4-1?；钚宰罴呀M分并非分子量最小組分，說(shuō)明多肽的生物活性并不全由分子量大小決定，可能還需考慮肽的氨基酸組成與排列，以及重要氨基酸的位置[22]。

圖4 凝膠層析圖譜(A)及凝膠層析后3個(gè)組分清除ABTS自由基能力(B)和亞鐵離子螯合力(C)

Fig．4 The gel chromatography atlas( A) ，and the ABTS radical scavenging activity ( B) ， and ferrous ion-chelating activity ( C) of the 3 fractions from the gel filtration

3 結(jié)論

用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)皮蛋白進(jìn)行酶解，得到的產(chǎn)物抗氧化活性較未酶解魚(yú)皮蛋白均有所提高。其中，堿性蛋白酶解2 h產(chǎn)物的抗氧化活性相對(duì)較強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL條件下測(cè)得ABTS自由基清除率為(28.70±0.23)%，F(xiàn)e2+螯合力為(85.03±0.67)%。采用中空纖維超濾設(shè)備對(duì)其進(jìn)行超濾分離，得到的組分分子量越小，抗氧化活性越強(qiáng)，即分子量小于3 kDa的組分F4的清除ABTS自由基能力及亞鐵離子螯合力均為最強(qiáng)，分子量大于10 kDa的組分F1各項(xiàng)活性均為最差。最后將F4經(jīng)凝膠層析繼續(xù)分離，得到抗氧化活性較強(qiáng)的組分F4-1，在0.51 mg/mL的濃度下測(cè)定其ABTS自由基清除率和Fe2+螯合力分別為(79.65±0.87)%和(93.40±0.20)%。研究表明，鰱魚(yú)魚(yú)皮蛋白是一種良好的抗氧化肽來(lái)源，利用超濾及凝膠層析技術(shù)分離能得到活性更好的組分，但該組分中性肽序列鑒定還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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PreparationofHypophthalmichthysmolitrixskinproteinpeptidesandtheevaluationoftheantioxidantactivity

SONGSijia1,LUVJian1,LIUHuaigao2,LUOYongkang1

1CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China;2GuotaiBiotechnology(Beijing)Co.,Ltd.,Beijing100011,China)

In order to prepare theHypophthalmichthysmolitrixskin peptides with good antioxidant activity,theHypophthalmichthysmolitrixskin was hydrolyzed by using of the four common commercial enzymes,namely,trypsin,Alcalase 2.4L,bromelain and papain;ABTS radical scavenging activity and ferrous ion-chelating activity were determined;and the hydrolyzates were separated by ultrafiltration and gel chromatography to obtain better hydrolyzate separation fractions. The results showed that the antioxidant activity of the protein hydrolysate increased,among which the antioxidant activity of the protein hydrolysate after a 2-hour enzymolysis had a stronger antioxidant activity. An ultrafiltration was carried out to the hollow fiber ultrafiltration membranes with the cut-off molecular weight of 10 kDa,5 kDa and 3 kDa. Among the 4 fractions after the ultrafiltration,the smaller the molecular weight was,the stronger the antioxidant activity was. The fraction with a molecular weight less than 3 kDa was separated into 3 sub-fractions by Sephadex G-15 gel chromatography,among which the larger the molecular weight was,the stronger the antioxidant activity was,whose ABTS radical scavenging ability (79.65±0.87)% and Fe2+chelating capacity (93.40±0.20)% were determined at the concentration of 0.51 mg/mL. This study provided a theoretical reference for the exploitation and utilization of antioxidant peptides fromHypophthalmichthysmolitrixskin.

Hypophthalmichthysmolitrixskin;enzymatic hydrolysis;antioxidant activity;ultrafiltration;gel chromatography

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.06.007

2017-09-19

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No. 2017YFD0400200)；農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(大宗淡水魚(yú)類(lèi))(CARS-45)

宋思佳(1995—)，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)生物活性肽。E-mail: songsijia2@cau.edu.cn

羅永康(1963—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：luoyongkang@cau.edu.cn

TS254.9

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1007-9580(2017)06-037-06