,， ,2， ,3， ,3，，，*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)護理學(xué)院內(nèi)護教研室；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

pcDNA3.1/ SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達

高勇強1,陽青蘭1，胡麗1,2，梁瑜1,3，劉彥1,3，張愉快1，王可耕1，肖建華1*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)護理學(xué)院內(nèi)護教研室；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室)

目的構(gòu)建日本血吸蟲動力蛋白輕鏈DNA疫苗和小鼠干擾素真核表達質(zhì)粒，研究其在HeLa細胞及動物體內(nèi)的表達。方法設(shè)計特異性引物，PCR擴增獲取動力蛋白輕鏈(SjDLC)與干擾素-γ(IFN-γ)基因，克隆于pcDNA3.1真核質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測序鑒定。將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HeLa細胞，Western blot鑒定其表達。真核質(zhì)粒經(jīng)左腿股四頭肌免疫小鼠，在末次免疫2周后，PCR法檢測小鼠肌組織內(nèi)SjDLC和IFN-γ基因，免疫組織化學(xué)法檢測基因的表達，MTT法檢測T細胞增殖水平。結(jié)果PCR和雙酶切能檢測到280 bp的SjDLC基因及480 bp的IFN-γ基因；Western blot顯示在12 kDa和19 kDa處有陽性反應(yīng)條帶，與SjDLC和IFN-γ分子量大小一致，兩種基因能在HeLa細胞中表達。PCR及免疫組化顯示兩種基因能在小鼠肌肉組織中存在和表達。MTT法顯示兩種質(zhì)粒均能刺激T細胞增殖。結(jié)論成功構(gòu)建pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/ mIFN-γ真核質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒能在HeLa細胞和動物體內(nèi)表達。

DNA疫苗； 動力蛋白輕鏈； 干擾素-γ

在血吸蟲病防治方面，尋找疫苗候選抗原分子和加強疫苗的保護效果是血吸蟲病研究工作的熱點。本課題組前期通過構(gòu)建日本血吸蟲cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了日本血吸蟲新基因即動力蛋白輕鏈(dynein light chain of Schistosoma japonicum，SjDLC)基因，并對其進行了初步的生物學(xué)特性研究[1]。細胞因子具有增強免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答類型的作用，目前已作為佐劑廣泛應(yīng)用，如IFN-γ具有刺激Th1細胞增殖及抑制Th2細胞作用，應(yīng)用IFN-γ能調(diào)節(jié)細胞免疫向Th1型極化，從而減輕Th2型細胞免疫所致疾病[2]。為進一步研究日本血吸蟲pcDNA3.1/SjDLC DNA疫苗及IFN-γ在日本血吸蟲感染中的保護性作用，本研究通過構(gòu)建pcDNA3.1/ SjDLC及pcDNA 3.1/ mIFN-γ真核質(zhì)粒并鑒定其在小鼠體內(nèi)的表達情況，為疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑6～8周雌性BALB/C小鼠購自長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，pcDNA3.1，DH5α由本研究所保存。Trizol購于Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，T4DNA連接酶、BamH I、Hind III、EcoR I限制性內(nèi)切酶購于NEB公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒去內(nèi)毒素大量提取試劑盒購于OMEGA生物技術(shù)公司，MTT購于Sigma公司。

1.2 pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ真核質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定根據(jù)DLC基因和mIFN-γ基因序列使用PRIMER5.0軟件設(shè)計特異性引物，在上游引物中引入BamH I 酶切位點(GGATCC)，在下游引物中分別引入Hind III酶切位點(AAGCTT)和EcoRI酶切位點(GGATCC)，其中DLC基因上游引物：5′-CGCGGATCCAGAATGAATGAACGTAAAGCCG-3′,下游引物：5′-CCC AAGCTTTTATCCTGATTTAAATAGTAGAA ATGC-3′，mIFN-γ基因上游引物：5′-CGCGGATCCACAATGAACGCTACACACTGCA-3′，下游引物：5′-CCGGA ATTCTCAGCAGCGACTCCTTTTCC-3′，上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

DLC基因擴增方法如下，新西蘭兔腹部敷貼法感染尾蚴，42天后取成蟲，使用Trizol提取成蟲RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。mIFN-γ基因擴增方法如下，健康8周齡BALB/c小鼠，無菌取脾臟后，剪碎放入70 μm細胞篩孔中，加PBS研磨洗滌；加2mL紅細胞裂解液裂解10 min，1 700 rpm，離心5 min，棄上清；加入 2 mL 含 10 μL/mL ConA 的完全 RPM I1640培養(yǎng)基于 5% CO237 ℃ 培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)3天；然后收集細胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以兩者cDNA為模板,PCR條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s、58 ℃ 退火60 s、72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)后72 ℃保溫10 min，4 ℃終止反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠鑒定后，純化PCR產(chǎn)物。純化后的產(chǎn)物與pcDNA3.1常規(guī)連接方法連接后，轉(zhuǎn)化至DH5α，篩選陽性克隆菌，同時進行BamH I和Hind III雙酶切，鑒定后測序。

1.3真核質(zhì)粒在HeLa細胞中的表達HeLa細胞分別接種到細胞培養(yǎng)板中(每孔2 mL，5.0×105個細胞/孔)，生長達90%時，按照Lip2000說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)48 h，收集細胞，加入5倍細胞體積的 RIPA 裂解液，懸浮細胞，冰上裂解半小時，13 000 rpm 4 ℃離心5 min，收集蛋白，SDS-PAG電泳，用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白電泳條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，進行Western blot分析。一抗為日本血吸蟲感染兔血清(1∶1 000稀釋)，4 ℃反應(yīng)過夜；TBST液洗膜5 min，重復(fù) 3次，加HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶1000稀釋)4 ℃反應(yīng)2 h。洗膜同上，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.4真核質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)的接種及表達15只雌性BALB/c小鼠隨機分為3組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1 / SjDLC組及pcDNA3.1 / mIFN-γ組，分別經(jīng)左腿股四頭肌注射重組質(zhì)粒，每2周免疫1次，共免疫3次。末次免疫后2周，麻醉后斷頸處死小鼠，取腿部肌肉提取總DNA，PCR法檢測小鼠肌組織內(nèi)SjDLC和mIFN-γ基因。另取每組小鼠的股四頭肌用4%多聚甲醛固定4 h后,常規(guī)制作石蠟切片，免疫組化法檢測SjDLC和IFN-γ基因在小鼠體內(nèi)的表達。

1.5 MTT法檢測SjDLC和mIFN-γ刺激T細胞增殖情況末次免疫后2周， 麻醉后斷頸處死小鼠，分離小鼠脾淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度為6×106/mL，接種于96孔板，每組分別用RPMI1640培養(yǎng)液、SWA(10 μg/mL)和Con A(10 μg/mL)作為刺激物進行刺激，于5% CO237 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL培養(yǎng)4 h，800 rpm離心15 min棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測每孔OD570nm值。

1.6統(tǒng)計分析計量數(shù)據(jù)用均數(shù)+標準差表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進行t檢驗分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pcDNA3.1/ SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ真核質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 SjDLC和mIFN-γ基因PCR擴增結(jié)果 1%瓊脂糖膠電泳后在280 bp處可見目的條帶，與SjDLC基因大小相符(圖1 A)；在480 bp處可見目的條帶，與mIFN-γ 基因大小一致(圖1 B)。

圖1.SjDLC基因(A)和mIFN-γ 基因(B)PCR的擴增M:Marker;1:SjDLC基因擴增產(chǎn)物；2：mIFN-γ 基因擴增產(chǎn)物

2.1.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ雙酶切鑒定 利用BamH I和Hind III雙酶切方法檢測到重組質(zhì)粒的兩條目的條帶，條帶大小與PCR 檢測結(jié)果一致 (圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定M:Marker;1:雙酶切驗證pcDNA3.1/ SjDLC質(zhì)粒；2：雙酶切驗證pcDNA3.1/mIFN-γ質(zhì)粒；3：雙酶切驗證pcDNA3.1質(zhì)粒

2.2 pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ在HeLa細胞中的表達HeLa細胞分別接種到細胞培養(yǎng)板中，按照Lip2000說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)48 h，收集細胞，進行Western blot分析。Western blot顯示在12 kDa(圖3A)和19 kDa(圖3B)處有陽性反應(yīng)條帶，與SjDLC和IFN-γ分子量大小一致。

圖3 pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1 / IFN-γ在HeLa細胞中的表達A：1:pcDNA3.1; 2:pcDNA3.1/ SjDLC;B：1:pcDNA3.1；2:pcDNA3.1/IFN-γ

2.3 pcDNA3.1/ SjDLC及pcDNA3.1 / mIFN-γ真核質(zhì)粒在動物體內(nèi)的表達

2.3.1 PCR法檢測小鼠肌肉組織中SjDLC和mIFN-γ基因 取腿部肌肉組織提取總DNA，使用SjDLC及mIFN-γ特異性引物，擴增各基因，結(jié)果可見能從小鼠肌肉組織中擴增出280 bp的SjDLC基因及480 bp的mIFN-γ基因(圖4)。

圖4 PCR法檢測小鼠肌肉組織中SjDLC及mIFN-γ基因M:DNA Maker;1:pcDNA3.1/ SjDLC;2:pcDNA3.1/ mIFN-γ

2.3.2 免疫組化法檢測pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ在小鼠肌肉組織中的表達 免疫組化結(jié)果顯示各組肌細胞區(qū)域可見pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ在肌肉組織中表達的棕黃色陽性反應(yīng)顆粒(圖5)。

圖5 免疫組化法檢測小鼠肌肉組織內(nèi)重組質(zhì)粒的表達(200×)A:pcDNA3.1; B:pcDNA3.1/ SjDLC; C:pcDNA3.1/ mIFN-γ

2.4 MTT法檢測淋巴細胞體外增殖試驗MTT法結(jié)果顯示：用SWA刺激后SjDLC組和IFN-γ組T細胞增殖水平均顯著性高于pcDNA3.1對照組，P<0.05，IFN-γ組高于SjDLC組，P<0.05。Con A刺激組與SWA刺激組比較，P>0.05。RPMI1640刺激后各組T細胞均不增值，與SWA刺激組比較，P<0.05。見圖6。

圖6 MTT檢測免疫后小鼠脾淋巴細胞增值率與pcDNA3.1比較，*：P<0.05，與SWA組比較，#：P<0.05

3 討 論

核酸疫苗是近年來快速發(fā)展的新型疫苗，將編碼抗原基因或基因片段插入質(zhì)粒載體中構(gòu)成重組質(zhì)粒，直接免疫后，機體內(nèi)的細胞表達這一抗原，刺激機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，達到抗感染的目的[3]。核酸疫苗能誘導(dǎo)有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，也沒有死疫苗、減毒疫苗的致病作用，并且生產(chǎn)簡單，成本低廉，因此受到廣泛青睞。

目前血吸蟲病的疫苗研究仍未得到令人滿意的結(jié)果[4]，因此，尋找有效的候選疫苗抗原分子仍然是日本血吸蟲疫苗研究工作的重要基礎(chǔ)。血吸蟲抗原作為疫苗常常免疫效果有限，為了加強疫苗的免疫效果聯(lián)合佐劑十分重要，運用細胞因子作為佐劑也是目前血吸蟲病疫苗研究的方向。

本研究通過構(gòu)建日本血吸蟲SjDLC DNA疫苗及mIFN-γ真核質(zhì)粒，初步研究其在真核細胞及小鼠體內(nèi)表達狀況，為尋找有效的候選疫苗抗原分子及應(yīng)用IFN-γ作為佐劑加強血吸蟲疫苗免疫接種效果奠定基礎(chǔ)。

日本血吸蟲動力蛋白輕鏈基因(SjDLC)是由本課題組前期發(fā)現(xiàn)的新基因，已獲得GenBank 登錄號(AY225851)，該基因序列與曼氏血吸蟲DLC基因序列同源性較高，相似性為86%[1]。該蛋白位于血吸蟲體被，介導(dǎo)其與“外界分子”的相互識別，可結(jié)合血吸蟲體被需要轉(zhuǎn)運的物質(zhì)通過微管進行運輸，是血吸蟲生存和發(fā)揮免疫逃逸的重要基因之一[5-6]。

IFN-γ主要是由Th1細胞分泌，具有抗感染、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，能抑制Th2型細胞免疫，有利于減輕由血吸蟲蟲卵抗原誘導(dǎo)的Th2型細胞免疫介導(dǎo)的免疫病理損傷[7-8]。

本研究構(gòu)建了pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/mIFN-γ真核質(zhì)粒，通過PCR和雙酶切方法檢測到280 bp的SjDLC基因及480 bp的mIFN-γ基因，測序結(jié)果顯示這兩個基因的核苷酸序列與GenBank中的序列完全一致。 Western blot顯示在12 kDa和19 kDa處有陽性反應(yīng)條帶，與SjDLC和IFN-γ分子量大小一致，說明兩種基因能在HeLa細胞中表達。PCR能從小鼠肌肉組織中擴增出280 bp的SjDLC基因及480 bp的mIFN-γ基因，免疫組化結(jié)果顯示小鼠肌組織中出現(xiàn)兩種蛋白的陽性反應(yīng)顆粒。說明pcDNA3.1/SjDLC及pcDNA3.1/ mIFN-γ能在小鼠肌肉組織中存在和表達，這是疫苗發(fā)揮作用的免疫學(xué)基礎(chǔ)。MTT法檢測到SjDLC和IFN-γ能顯著性誘導(dǎo)T細胞增殖和活化。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建的pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/mIFN-γ真核表達質(zhì)粒，能在小鼠體內(nèi)良好表達，為進一步研究其在日本血吸蟲感染中的保護性作用奠定了實驗基礎(chǔ)。

[1] 劉彥,肖建華,廖力,等.日本血吸蟲肌動蛋白輕鏈基因的獲得和分析[J].中國人獸共患病雜志,2004,20 (11):960-962.

[2] de Carvalho PG,de Oliveira Rodrigues R,Ribeiro da Silva SF,et al.CD38+CD8+ and CD38+CD4+ T cells and IFN Gamma (+874) polymorphism are associated with a poor virological outcome[J].Immunol Invest,2016,45(4):312-327.

[3] Kumar A,Samant M.DNA vaccine against visceral leishmaniasis:a promising approach for prevention and control[J].Parasite Immunol,2016,38(5):273-281.

[4] Attallah AM,El-Far M,Omran MM3,et al.Levels of schistosoma mansoni c irculating Antigen in chronic hepatitis C patients with different stages of liver fibrosis[J].J Immunoassay Immunochem,2016,37(3):316-330.

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ConstructionandexpressionofthepcDNA3.1/SjDLCandpcDNA3.1/mIFN-γ

GAO Yongqiang,YANG Qinglan,HU Li,et al

(InstituteofPathogenicBiology,MedicalCollege,UniversityofSouthChina；Hengyang421001，Hunan，China)

ObjectiveTo construct the dynein light chain of Schistosoma japonicum DNA vaccine and IFN-γ recombinant plasmid of mice,so as to investigate their expression in HeLa cells and mouse.MethodsA pair of primers designed by PRIMER5.0 software was synthesized;the gene fragments of SjDLC and mIFN-γ were amplified by PCR，and inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1,where the recombinant plasmids were identified with restrictive enzymes and sequenced.The recombinant vectors pcDNA3.1/SjDLC and pcDNA3.1 /mIFN-γ were transfected into HeLa cells;the expressed proteins were identified by Western blot.These plasmids were injected into BALB /c mice too,the gene of SjDLC and IFN-γ in quadriceps femoris were identified by PCR.The expression of SjDLC,IFN-γ were observed with immunohistochemistry.The proliferation of splenic lymphocytes in mice was detected by MTT.ResultsThe 280 bp of SjDLC gene and 480 bp of IFN-γ gene were observed through PCR and double enzyme digestion;Western blot displayed that positive response bands in 12 kDa and 19 kDa which is consistent with the molecular weight of SjDLC and IFN-γ were successfully expressed in HeLa cells.PCR and immunohistochemistry showed that two genes expressed in mouse muscle tissue.MTT showed that two plasmids could stimulate the proliferation of T cells.ConclusionThe pcDNA /SjDLC DNA vaccine and recombinant plasmid pcDNA /mIFN-γ were successfully constructed and then expressed in HeLa cells and mouse.

DNA vaccine; SjDLC; IFN-γ

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.006

2016-07-20；

2017-08-28

湖南省教育廳科學(xué)研究項目(編號：13C824)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2015B415)；湖南省分子靶標新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(NO.2015-351)；特殊病原體防控湖南省重點實驗室資助項目(NO.2014-5).

*通訊作者，E-mail:jhxiao223@163.com.

R383.24

A

蔣湘蓮)