李忠旺，陳玉梁，歐巧明，葉春雷，裴懷弟，劉新星，王紅梅，羅俊杰

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯病毒誘導(dǎo)應(yīng)答基因抑制消減雜交文庫(kù)構(gòu)建及分析

李忠旺，陳玉梁，歐巧明，葉春雷，裴懷弟，劉新星，王紅梅，羅俊杰*

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯病毒積累引起的種薯退化是馬鈴薯生產(chǎn)中造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降的重要原因之一。本研究以馬鈴薯病毒病攜帶植株葉片cDNA為試驗(yàn)組(Tester)、脫毒種苗葉片cDNA為驅(qū)動(dòng)組(Driver)，采用抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)技術(shù)構(gòu)建了馬鈴薯病毒誘導(dǎo)應(yīng)答基因的cDNA文庫(kù)；為驗(yàn)證文庫(kù)構(gòu)建效果，從文庫(kù)中隨機(jī)挑取了98個(gè)陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證后測(cè)序，獲得了45條高質(zhì)量的有效非重復(fù)序列；經(jīng)與GenBank進(jìn)行同源比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其中14條非重復(fù)序列屬于馬鈴薯病毒基因序列，22條與已知基因序列同源性較高，9條無(wú)同源參考基因；選取文庫(kù)中出現(xiàn)頻率較高的2個(gè)ESTs(expressed sequence tag，表達(dá)序列標(biāo)簽)用qRT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量受馬鈴薯病毒侵染的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，該SSH文庫(kù)構(gòu)建較為成功，為進(jìn)一步篩選與馬鈴薯病毒致病、防御相關(guān)的應(yīng)答基因，解析馬鈴薯與病毒互作的分子機(jī)理，利用生物技術(shù)手段培育抗病毒馬鈴薯奠定了基礎(chǔ)。

馬鈴薯；病毒；應(yīng)答基因；抑制消減雜交

馬鈴薯(Solanumtuberosum)為茄科茄屬多年生草本塊莖植物，是世界上僅次于小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)的第四大糧食作物[1]，因其塊莖部分含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)和各種維生素，是重要的糧菜飼兼用作物及工業(yè)原料。中國(guó)是世界最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，總產(chǎn)量和人均消費(fèi)量均處于世界前列且穩(wěn)步增長(zhǎng)，但單位面積產(chǎn)量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于荷蘭等馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)達(dá)的國(guó)家，影響單產(chǎn)的因素很多，其中病毒等病害積累引起的種薯退化是重要的原因之一[2-4]。已報(bào)道的在田間條件下能侵染馬鈴薯的病毒有近30余種[4-5]，它們引起馬鈴薯植株花葉、褪綠、卷葉、矮縮以及壞死等癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育異常，塊莖產(chǎn)量下降，特別是復(fù)合侵染時(shí)可使產(chǎn)量損失80%以上，有些還會(huì)嚴(yán)重影響塊莖品質(zhì)和商品性[6-7]。

由于馬鈴薯病毒病的特殊性，目前尚無(wú)有效的化學(xué)方法防治馬鈴薯病毒病，利用莖尖分生組織培育健康無(wú)毒的馬鈴薯已成為預(yù)防馬鈴薯病毒病最為有效的方法之一。但莖尖脫毒組織培養(yǎng)技術(shù)本身具有成本高、對(duì)操作人員技術(shù)要求高、是否完全脫毒監(jiān)測(cè)困難、脫毒種薯在栽培過程中易于再次感染的局限性[8]，加上受經(jīng)濟(jì)條件、認(rèn)知等原因的影響很難全面應(yīng)用與生產(chǎn)。因此，培育抗病毒馬鈴薯品種可能是從根本上緩解這一問題的可行辦法。但由于栽培種馬鈴薯一般是四倍體無(wú)性繁殖材料，育種中存在基因分離復(fù)雜、花粉不育和現(xiàn)有栽培種基因庫(kù)狹窄等缺陷，極大地限制了可以利用的基因資源[9]。以轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記輔助育種為代表的現(xiàn)代生物育種技術(shù)是有效彌補(bǔ)不足的可行方法，可以加速實(shí)現(xiàn)馬鈴薯抗病毒特性的改良目的，但需要對(duì)病毒入侵后馬鈴薯的應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)主要功能基因及其作用機(jī)理有較為清晰的認(rèn)識(shí)。

抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH) 技術(shù)是1996年由Diatchenko等[10]以mRNA差異顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的一種利用抑制性PCR和差減雜交技術(shù)為基礎(chǔ)篩選差異表達(dá)基因的方法，由于該方法具有高效和假陽(yáng)性率低的特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于植物抗病、抗逆、發(fā)育等差異表達(dá)基因篩選研究中[11-15]，但在馬鈴薯病毒病相關(guān)研究中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

本研究以馬鈴薯病毒病攜帶植株葉片cDNA為試驗(yàn)組(Tester)、脫毒種苗葉片cDNA為驅(qū)動(dòng)組(Driver)，構(gòu)建了馬鈴薯病毒誘導(dǎo)應(yīng)答基因抑制消減雜交cDNA文庫(kù)，篩選與馬鈴薯病毒病致病、防御相關(guān)的應(yīng)答基因并研究其轉(zhuǎn)錄模式，以期在整體水平上了解馬鈴薯與病毒互作的分子機(jī)理、克隆抗病基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)于2014年7月-2016年4月進(jìn)行，以甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所育成品種“隴薯8號(hào)”(對(duì)花葉病毒病和卷葉病毒病具有很好的田間抗性)葉片為受試材料，實(shí)驗(yàn)組感病植株是從田間選取，驅(qū)動(dòng)組脫毒種苗取材于馬鈴薯脫毒種苗繁育專用溫室，均隨機(jī)選取5株后混合取樣。

供試Clontech SMARTerTM PCR cDNA synthesis Kit、Clontech SMARTerTM PCR cDNA synthesis Kit、SYBR Premix ExTaq購(gòu)自大連TAKARA 公司，RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自上海Invitrogen公司，測(cè)序、引物合成及克隆載體pUCm-T、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、非酶DNA清除劑、PCR產(chǎn)物回收、純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 RNA 的提取、純化及SSH文庫(kù)構(gòu)建

取約100 mg 馬鈴薯葉片于液氮中研磨后參照Invitrogen公司TRIzol試劑說明書抽提總RNA，在氯仿抽提前加一步酚∶氯仿(24∶1)純化步驟，最后RNA溶液用上海生工非酶DNA清除劑純化，進(jìn)一步提高了RNA的質(zhì)量。

所獲得的RNA合成雙鏈cDNA后，分別感病植株cDNA 為實(shí)驗(yàn)組，以脫毒種苗cDNA 為驅(qū)動(dòng)組，按照PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech，Cat. No. 637401)試劑盒說明書進(jìn)行RsaⅠ酶切消化、接頭連接、雜交、PCR 擴(kuò)增等操作，每步操作均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；采用StTublin基因引物PCR 檢測(cè)雜交效率，分別在18、20、22、24、26、28、30、32 個(gè)循環(huán)取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。利用DNA 回收試劑盒回收第2次PCR 差減產(chǎn)物連接到pUCm-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。

1.3 差減文庫(kù)的鑒定及ESTs 測(cè)序分析

隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化平板的白斑用pUCm-T載體M13引物(表1)PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆后送交生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用VectorScreen分離出載體序列，再對(duì)EST序列進(jìn)行比對(duì)后獲得非冗余序列，再用tblastx(Search translated nucleotide database using a translated nucleotide query)進(jìn)行同源性搜索分析基因功能。

1.4 候選基因Real-time PCR 驗(yàn)證

應(yīng)用Invitrogen公司TRIzol試劑提取對(duì)照組和處理組的葉片總RNA，應(yīng)用Clontech SMARTerTM PCR cDNA synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，參考試劑盒說明書建成20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，延伸階段收集信號(hào)，從58 ℃到95 ℃，采集熔解曲線熒光信號(hào)。選取其中2個(gè)差異表達(dá)基因，利用Primer Premier 6.0 軟件分別設(shè)計(jì)差異表達(dá)ESTs正、反向引物，以馬鈴薯持家基因StTublin為內(nèi)參，做3次重復(fù)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(表1)。

2 結(jié)果與分析

圖1 馬鈴薯塊莖RNA電泳Fig.1 Total RNA tested by agarose gel M：DNA marker；1～3：驅(qū)動(dòng)組總RNA Driver total RNA；4～6：試驗(yàn)組總RNA Tester total RNA.

2.1 RNA的分離與質(zhì)量檢測(cè)

圖1是用Invitrogen公司Trizol 試劑盒提取馬鈴薯葉片總RNA，總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其28S和18S RNA帶型清晰可見，且比例適當(dāng)，表明總RNA質(zhì)量好、純度高，滿足文庫(kù)構(gòu)建的要求。以該RNA作模板，以O(shè)ligodT18 為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，再進(jìn)一步合成雙鏈cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 雙鏈cDNA 酶切效果檢測(cè)

為了驗(yàn)證長(zhǎng)片段雙鏈cDNA 是否被充分消化成小片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切前后的雙鏈cDNA，酶切前雙鏈cDNA 分布在100～2000 bp(圖2：Lane 1，3)，經(jīng)高頻四堿基內(nèi)切酶RsaⅠ酶切后，雙鏈cDNA 分布范圍明顯下移(圖2：Lane 2，4)，說明RsaⅠ已將較長(zhǎng)的雙鏈cDNA 消化成帶有粘性平末端的小片段，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)預(yù)期，保證了實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。

2.3 接頭連接及連接效率檢測(cè)

圖2 雙鏈cDNA酶切效果驗(yàn)證Fig.2 ds-cDNA enzyme digestion efficiency M：DNA marker；1，3：未經(jīng)過Rsa I酶切的驅(qū)動(dòng)組雙鏈cDNA、試驗(yàn)組雙鏈cDNA Driver ds-cDNA and Tester ds-cDNA；2，4：經(jīng)過Rsa I酶切的驅(qū)動(dòng)組雙鏈cDNA、試驗(yàn)組雙鏈cDNA Driver ds-cDNA and Tester ds-cDNA after Rsa I digestion.

圖3 接頭連接效果PCR驗(yàn)證Fig.3 Detection of ligation efficiency of adaptor M：DNA marker；1，2：與接頭1的連接產(chǎn)物 Ligased with adaptor 1；3～6：與接頭2R的連接產(chǎn)物 Ligased with adaptor 2R；1，3，5：PCR Primer 1和StTublin 3′引物組合PCR產(chǎn)物 Product of Primer 1 and StTublin 3′primer；2，4，6：StTublin引物PCR產(chǎn)物 Product of StTublin primer.

圖4 巢式PCR產(chǎn)物檢測(cè)Fig.4 Nested PCR products tested by agarose gel

ds-cDNA與接頭連接效率的高低是決定抑制性消減雜交成敗非常關(guān)鍵的一步。將經(jīng)酶切驗(yàn)證可用的實(shí)驗(yàn)組雙鏈cDNA分成兩份， 分別連接接頭Adaptor 1和Adaptor 2R以便于后續(xù)的消減雜交。連接產(chǎn)物分別用試劑盒提供引物Primer 1和馬鈴薯持家基因StTublin反向引物組合以及馬鈴薯持家基因StTublin正反向引物組合(擴(kuò)增片段內(nèi)不含RsaI酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖3)，持家基因的3′反向引物與接頭的外側(cè)引物Primer 1組合的擴(kuò)增片段(連接接頭的PCR產(chǎn)物)大于StTublin正反向引物組合的擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.4 巢式PCR產(chǎn)物檢測(cè)

消減雜交后富集的差異表達(dá)基因片段再經(jīng)過兩次PCR擴(kuò)增，第1次僅末端具有不同接頭的雙鏈cDNA呈指數(shù)擴(kuò)增，在第2次巢式PCR將進(jìn)一步降低背景和富集差異表達(dá)序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第2輪巢式PCR在擴(kuò)增到15個(gè)循環(huán)時(shí)已經(jīng)有較多的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，大小分布在100 bp到500 bp之間(圖4)，可以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

2.5 消減效率的PCR分析

用馬鈴薯內(nèi)標(biāo)基因StTublin引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證消減效率，結(jié)果顯示在消減雜交產(chǎn)物中均不能擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，而非消減雜交對(duì)照組在22個(gè)循環(huán)就有目標(biāo)條帶出現(xiàn)(圖5)，說明本實(shí)驗(yàn)消減雜交成功，消減效率較高。

2.6 陽(yáng)性克隆的獲得與篩選

2次PCR產(chǎn)物純化后連接到克隆載體pUCm-T后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，轉(zhuǎn)化后涂布在含有X-gal和IPTG的Amp抗性LB平板上生長(zhǎng)16 h，將其于4 ℃放置24 h后，挑選白斑于液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h。以菌液為模板PCR鑒定陽(yáng)性克隆結(jié)果顯示，在隨機(jī)挑選的28個(gè)克隆中，陽(yáng)性克隆為27個(gè)，片段大小分布在200 bp到600 bp之間(圖6)，陽(yáng)性重組率大于95%，滿足隨機(jī)挑選克隆測(cè)序要求，從而成功建立了馬鈴薯淀粉合成積累相關(guān)抑制消減雜交文庫(kù)。

2.7 差異表達(dá)ESTs測(cè)序與分析

根據(jù)所獲得的PCR產(chǎn)物大小隨機(jī)挑選了98個(gè)陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證后送交上海生工測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果用VectorScreen分離出載體序列，再對(duì)EST序列進(jìn)行比對(duì)后獲得45條非冗余序列，再用tblastx(Search translated nucleotide database using a translated nucleotide query)進(jìn)行同源性分析基因功能。結(jié)果顯示(表2)，45 條非冗余序列中有9條序列尚無(wú)同源序列，14條序列屬于馬鈴薯病毒基因片段，此外還有與植物抗病毒相關(guān)LRR類轉(zhuǎn)錄因子、衰老相關(guān)基因等，說明本文庫(kù)質(zhì)量較高，差異表達(dá)基因與馬鈴薯病毒致病及防御過程密切相關(guān)。

圖5 消減效率的PCR檢測(cè)Fig.5 Reduction efficiency by PCR analysis M：DNA marker；H：H2O；1：消減組cDNA Subtracted cDNA；2：未消減cDNA Unsubtracted cDNA；18C～32C：循環(huán)數(shù)Cycles number.

圖6 陽(yáng)性克隆PCR篩選電泳Fig.6 PCR products of positive clones which were selected randomly M：DNA marker；H：H2O；1～14： PCR擴(kuò)增的插入片段The PCR products of the inserts.

表2 非冗余序列Blast注釋結(jié)果Table 2 Non redundant sequence Blast annotation results

2.8 差異表達(dá)基因Real-time PCR驗(yàn)證

選取文庫(kù)中出現(xiàn)頻率較高、片段較長(zhǎng)而易于設(shè)計(jì)引物的2個(gè)ESTs：一個(gè)是與植物抗病毒相關(guān)LRR類蛋白基因(EST1)，一個(gè)是Blast比對(duì)無(wú)同源序列的EST(EST2)。用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)上述ESTs代表的基因在馬鈴薯病毒侵染前后的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)ESTs在脫毒種苗中表達(dá)量很低或者幾乎沒有表達(dá)，但是在感染病毒的植株中表達(dá)水平急劇升高(圖7)，兩個(gè)ESTs在病毒侵染前后的相對(duì)表達(dá)量差異均達(dá)到了極顯著水平(PEST1=0.000219<0.01，PEST2=0.00038<0.01)， 這初步說明上述兩個(gè)ESTs所代表的基因參與了馬鈴薯對(duì)病毒侵染脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。

圖7 差異表達(dá)ESTs的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.7 Validation for the differential expression ESTs by qRT-PCR EST1：LRR類轉(zhuǎn)錄因子LRR type transcription factor；EST2：未知功能基因Functional unknown gene.

3 討論

3.1 SSH文庫(kù)的構(gòu)建

基因的差異表達(dá)是調(diào)控生命活動(dòng)的核心，通過比較同一植物組織在不同的病理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異是揭示植物病害致病機(jī)理及植物對(duì)病害防御機(jī)理的重要手段，抑制消減雜交技術(shù)的應(yīng)用加快了基因差異表達(dá)分析的速度[16]。目前為止，抑制消減雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物抗逆、抗病及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)領(lǐng)域[11-15]，但在馬鈴薯病毒病入侵及抗病機(jī)理方面還沒有相關(guān)研究報(bào)道。本研究以馬鈴薯病毒病攜帶植株的RNA為試驗(yàn)組(Tester)、脫毒種苗RNA為驅(qū)動(dòng)組(Driver)，構(gòu)建了馬鈴薯病毒誘導(dǎo)應(yīng)答基因抑制消減雜交cDNA文庫(kù)，篩選出病毒入侵前后的差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步深入研究馬鈴薯病毒入侵機(jī)制，克隆馬鈴薯抗病毒基因并利用基因工程手段創(chuàng)制抗病毒馬鈴薯新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

但是抑制消減雜交技術(shù)也存在著一些不足，如：對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的需求量較多，不適于來(lái)源困難的樣品；得到的cDNA是限制酶消化后的小片段，進(jìn)一步研究還需要擴(kuò)增全長(zhǎng)序列；要求對(duì)比實(shí)驗(yàn)組之間的差異性較低等。此外，實(shí)驗(yàn)本身的技術(shù)環(huán)節(jié)也存在不足，如酶切不完全、cDNA與接頭的鏈接效率不高等，都會(huì)降低消減效率，致使消減結(jié)果存在一定的假陽(yáng)性。在本文庫(kù)的構(gòu)建過程中，在每一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)都進(jìn)行了相應(yīng)的驗(yàn)證，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，差異表達(dá)ESTs測(cè)序結(jié)果顯示文庫(kù)內(nèi)含有較多的病毒基因片段，選取的兩個(gè)差異表達(dá)ESTs在病毒浸染后的相對(duì)表達(dá)量均顯著提高，說明該消減文庫(kù)構(gòu)建比較成功，文庫(kù)內(nèi)包含的ESTs應(yīng)該都是實(shí)驗(yàn)組所特有的基因片段。

3.2 馬鈴薯抗病毒基因的篩選

由于馬鈴薯在生產(chǎn)中造成產(chǎn)量下降的一個(gè)主要原因就是種薯感染病毒后導(dǎo)致的，再加上脫毒種薯的生產(chǎn)成本較高，因此，科學(xué)家一直在致力于抗病毒馬鈴薯新品種的培育[17]。而由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，科學(xué)家們也利用了多種轉(zhuǎn)基因策略創(chuàng)制抗病毒馬鈴薯新種質(zhì)，尤其是在馬鈴薯中表達(dá)病毒外殼蛋白基因和利用病毒反義RNA技術(shù)創(chuàng)制抗病毒種質(zhì)方面開展了較多的研究[18-23]，然而大多收效甚微或只能對(duì)一種病毒具有較好的效果，應(yīng)用價(jià)值不高。因此，缺乏有效的抗病毒基因是利用基因工程技術(shù)培育馬鈴薯抗病毒品種多面臨的最大困難。

R基因能夠賦予植物對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原物的抗性，這種主動(dòng)抗性依賴于寄主的R基因產(chǎn)物與病毒編碼的無(wú)毒因子(Avr)之間的特異性識(shí)別，是目前為止所知道的能夠賦予植物抗病性最好的基因[24]。目前克隆鑒定出來(lái)的植物抗病毒R基因中，絕大多數(shù)都是屬于NBS-LRR蛋白，這類蛋白因?yàn)槎加斜Ｊ氐暮怂峤Y(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site，NBS)和亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeats，LRR)而得名[25-26]。NBS-LRR類基因是在植物中發(fā)現(xiàn)的成員最多、多樣性最豐富的基因家族之一，很多植物的基因組中含有很多個(gè)NBS-LRR蛋白家族成員，有報(bào)道指出二倍體栽培種馬鈴薯基因組中含有738個(gè)部分和完整的NBS-LRR序列[27]。目前從馬鈴薯中已克隆兩個(gè)抗PVX基因Rx1和Rx2，它們均編碼CC-NBS-LRR類型蛋白，特異性識(shí)別PVX的外殼蛋白(coat protein，CP)，兩者核酸序列也高度同源，轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯也表現(xiàn)出了對(duì)PVX的極端抗性[28-30]。

本研究所構(gòu)建的馬鈴薯病毒誘導(dǎo)應(yīng)答基因SSH文庫(kù)中就包含有一個(gè)具有亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域的LRR類蛋白基因，經(jīng)Real-time PCR分析結(jié)果表明，該基因在不感染病毒的馬鈴薯植株中不表達(dá)，感染病毒植株中高表達(dá)。因此，該基因很可能是一個(gè)新的馬鈴薯抗病毒R基因，值得進(jìn)一步深入研究。

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Constructionandanalysisofasuppressionsubtractivehybridizationlibraryforthepotatovirusinducedresponsegene

LI Zhong-Wang, CHEN Yu-Liang, OU Qiao-Ming, YE Chun-Lei, PEI Huai-Di, LIU Xin-Xing,WANG Hong-Mei, LUO Jun-Jie*

BiotechnologyInstitute,GansuAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730070,China

Potato virus accumulation is one of the important reasons for the decline of yield and quality in potato production. In order to screen and clone the potato virus induced response gene, we constructed a suppression subtractive hybridization (SSH) library using cDNAs from potato virus disease carrying plant leaf as the tester, and those cDNAs from a virus-free seedling leaf as the driver. To verify the effect of library, 98 randomly selected positive clones were identified by PCR from the library and sequenced, and 45 high quality non repeat sequences were obtained. By blast analysis in GenBank, we found that 14 of them were sequences belonging to the potato virus gene, 22 of them had high homology with known genes, and 9 of them had no homologous reference gene. Two frequently found ESTs in the library were analyzed using quantitative real time PCR, and their expression was induced by potato virus. The results therefore showed that the SSH library was constructed successfully. This work has thus laid a foundation for further screening for potato virus related pathogenicity, and induction of corresponding defense response genes. This may lead to analysis of the molecular mechanisms of interaction between the potato plant and the virus, and use of biotechnology to cultivate virus resistant potato varieties.

potato; virus; response gene; suppression subtractive hybridization

10.11686/cyxb2017063http//cyxb.lzu.edu.cn

李忠旺, 陳玉梁, 歐巧明, 葉春雷, 裴懷弟, 劉新星, 王紅梅, 羅俊杰. 馬鈴薯病毒誘導(dǎo)應(yīng)答基因抑制消減雜交文庫(kù)構(gòu)建及分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(12): 152-159.

LI Zhong-Wang, CHEN Yu-Liang, OU Qiao-Ming, YE Chun-Lei, PEI Huai-Di, LIU Xin-Xing, WANG Hong-Mei, LUO Jun-Jie. Construction and analysis of a suppression subtractive hybridization library for the potato virus induced response gene. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 152-159.

2017-02-20；改回日期：2017-04-19

甘肅省農(nóng)科院青年創(chuàng)新基金(2013GAAS29),甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2015GAAS02),甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新重大項(xiàng)目(2016GAAS59-02)和國(guó)家自然科學(xué)

基金項(xiàng)目(31460388)資助。

李忠旺(1980-)，男，甘肅山丹人，助理研究員。E-mail: lizhongwang33@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail：hnsljjie@163.com