賈會(huì)麗，王學(xué)敏，郭繼承，高洪文，吳欣明，劉建寧，石永紅，董寬虎，王運(yùn)琦*

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.北京綠京華園林工程有限公司，北京 102209；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化

賈會(huì)麗1，王學(xué)敏2，郭繼承3，高洪文2，吳欣明1，劉建寧1，石永紅1，董寬虎4，王運(yùn)琦1*

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.北京綠京華園林工程有限公司，北京 102209；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

胚胎晚期富集蛋白(LEA)廣泛參與植物對多種逆境脅迫的反應(yīng)。本研究利用同源克隆的方法，從紫花苜蓿中克隆了一個(gè)LEA4類基因的開放閱讀框(ORF)，命名為MsLEA4-4。該基因編碼512個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)分析顯示MsLEA4-4包含5個(gè)重復(fù)的由11個(gè)氨基酸TAQAAKEKTQQ組成的序列特征。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了MsLEA4-4在不同逆境下的表達(dá)量，結(jié)果顯示,該基因受干旱、NaCl、Cu2+、Zn2+和外源ABA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，其中NaCl脅迫2 h、Cu2+和Zn2+脅迫8 h，MsLEA4-4基因表達(dá)量最高；冷脅迫和干旱脅迫下，該基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長呈逐漸上升趨勢，表明該基因可能參與了紫花苜蓿的抗逆性調(diào)控。構(gòu)建植物超表達(dá)載體pCAMBIA3301-MsLEA4-4，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染擬南芥花序，通過草銨膦(PPT)篩選和分子檢測，7株抗性苗呈陽性，表明目的基因已成功導(dǎo)入擬南芥基因組中。本研究為進(jìn)一步探索MsLEA4-4基因在紫花苜?？鼓嫘哉{(diào)控中的作用奠定了基礎(chǔ)。

紫花苜蓿；胚胎晚期富集蛋白(LEA)；逆境脅迫；遺傳轉(zhuǎn)化

由于植物的不可移動(dòng)性，在生長發(fā)育過程中往往會(huì)遭受干旱、高溫、低溫、高鹽等各種非生物脅迫，這些脅迫都會(huì)引起植物內(nèi)部的水分缺失。缺水會(huì)引起植物體內(nèi)的呼吸作用和光合作用等一系列生理活動(dòng)失調(diào)[1]。在長期的進(jìn)化過程中，植物演化出一系列從細(xì)胞到生理水平的應(yīng)答反應(yīng)，如基因的表達(dá)、代謝的調(diào)節(jié)、酶活性的改變等，來提高自己對不良環(huán)境的耐受性[2]。胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant，LEA)是參與細(xì)胞抗逆保護(hù)的一類重要蛋白，可阻止干旱導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集，從而提高植物耐旱性；在低溫脅迫下，LEA蛋白的合成可保護(hù)生物膜，提高植物的抗寒性；LEA蛋白還可通過穩(wěn)定細(xì)胞膜，隔離或結(jié)合離子的方式降低滲透壓，減少植物在高滲、高鹽條件下導(dǎo)致的細(xì)胞脫水和結(jié)構(gòu)破壞等[3]。LEA蛋白不僅在植物發(fā)育晚期的種子中大量積累，在受到水分脅迫(干旱、鹽、低溫等)的營養(yǎng)組織中，LEA蛋白也可被誘導(dǎo)表達(dá)[4]。因此，LEA蛋白的表達(dá)與植物細(xì)胞抗逆保護(hù)作用有著密切聯(lián)系。近年來，有諸多研究證明LEA基因的過量表達(dá)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的脅迫抗性[5]。鄒永東等[6]將大豆(Glycinemax)LEA1蛋白轉(zhuǎn)入擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性有所提高。趙詠梅等[7]將小麥(Triticumaestivum)LEA2基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性和耐旱性明顯提高。Dalal等[8]發(fā)現(xiàn)在干旱、滲透脅迫、高鹽以及外源ABA脅迫下SbLEA3的表達(dá)量升高，SbLEA3參與高粱(Sorghumbicolor)體內(nèi)的逆境調(diào)控。白永琴[9]將紫花苜蓿(Medicagosativa)LEA3-1基因轉(zhuǎn)入煙草(Nicotianatabacum)中，240 mmol/L NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)丙二醛含量、電導(dǎo)率與對照相比明顯降低，說明轉(zhuǎn)LEA3-1蛋白提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。Amara等[10]將第5組LEA蛋白R(shí)ab28轉(zhuǎn)入玉米(Zeamays)中，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性，滲透脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的葉面積和根面積增加，葉綠素含量降低緩慢，丙二醛含量降低。LEA4蛋白在植物界中也普遍存在，目前已經(jīng)從玉米[11]、大豆[1]等多種植物中克隆到了LEA4基因，轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性和耐旱性明顯提高?？傊?，目前對LEA1～3類蛋白保護(hù)功能的研究已積累了較多資料，如LEA基因的表達(dá)模式、細(xì)胞學(xué)定位、轉(zhuǎn)基因植物研究、蛋白質(zhì)特性分析等[12]，但對LEA4蛋白的研究相對較少，其功能和作用機(jī)制仍然不清楚。

紫花苜蓿營養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，且具有抗寒、耐鹽堿等優(yōu)良特性，在家畜日糧和土壤改良中發(fā)揮著重要角色[13]。近年來，畜牧業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和轉(zhuǎn)型升級(jí)加快了草食畜牧業(yè)的發(fā)展，對優(yōu)質(zhì)安全草食畜產(chǎn)品的需求推動(dòng)著紫花苜蓿在品種改良和抗性育種方面的研究越來越深入[14]。本研究從紫花苜蓿中成功克隆出LEA4類基因MsLEA4-4，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究在不同逆境脅迫下MsLEA4-4的表達(dá)模式，同時(shí)構(gòu)建超表達(dá)植物載體，將MsLEA4-4基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，為深入研究MsLEA4-4基因在紫花苜蓿中的抗逆機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紫花苜?！爸熊?號(hào)”為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種。DNA聚合酶Ex Taq、DNA Makers、pMD18-T Vector、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均購自Takara公司(日本)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas(美國)，Trizol試劑購自Invitrogen(美國)，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit和In-Fusion? HD Cloning Kit均購自Clontech(美國)，ABA購自Sigma(美國)，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α購自北京天根生化科技有限公司。ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、氯仿、異丙醇、乙醇、NaCl、PEG6000等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料的種植與處理 2014年4月將100粒紫花苜蓿中苜1號(hào)種子用氯氣消毒24 h后播種于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，待長出2片子葉后移至營養(yǎng)缽中(蛭石∶珍珠巖=3∶1)，培養(yǎng)4 周后選取長勢一致的苜蓿幼苗進(jìn)行干旱、高鹽、低溫和脫落酸脅迫人工模擬環(huán)境處理，每個(gè)處理5株，重復(fù)3次。干旱處理：將紫花苜蓿幼苗置于20% PEG6000的1/2 MS營養(yǎng)液中，室溫25 ℃條件下將植株分別處理0，2，4，8，12和24 h；高鹽處理：將紫花苜蓿幼苗置于含有250 mmol/L NaCl的1/2 MS營養(yǎng)液中，室溫25 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h；冷處理：將紫花苜蓿幼苗置于1/2 MS營養(yǎng)液中，4 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h；Zn2+處理和Cu2+處理：將紫花苜蓿幼苗分別置于含有500 μmol/L ZnSO4·7H2O和500 μmol/L CuSO4·5H2O的1/2 MS營養(yǎng)液中，室溫25 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h。ABA處理：將紫花苜蓿幼苗置于含有0.1 mmol/L ABA的1/2 MS營養(yǎng)液中，室溫25 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h。以上處理分別取其葉，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆與生物信息學(xué)分析 用Trizol法分別提取250 mmol/L NaCl溶液處理2，4，8，12和24 h后的幼葉總RNA后，按照質(zhì)量比為1∶1∶1∶1∶1混合均勻。參照RevertAidTMFirst Strand cDNA Asynthesis Kit說明書，將不同處理下提取的RNA進(jìn)行混合后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RACE-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的類LEA蛋白Unigene序列(未發(fā)表)，分別設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE的特異性引物GSP1和GSP2，PCR擴(kuò)增出兩端序列，經(jīng)PMD18-T載體連接，陽性克隆送英駿公司(上海)測序，最后將測序所得3′端和5′端序列拼接，獲得全長cDNA序列。

用DNAStar 7.0分析MsLEA4-4基因的核酸及氨基酸序列，用ScanProsite 對MsLEA4-4基因進(jìn)行功能預(yù)測。從NCBI上下載其他植物的LEA蛋白序列，用DNAMAN 6.0進(jìn)行多序列比對；下載蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)LEA蛋白序列，利用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joning法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3不同逆境脅迫下紫花苜蓿MsLEA4-4基因的表達(dá)特異性 用Trizol試劑分別提取1.2.1中獲得的各處理RNA，根據(jù)RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考 TaKaRa公司的SYBR System(ABI，美國)，采用兩步法進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，第1步：95 ℃預(yù)變性30 s；第2步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)樣品，每個(gè)樣品3次重復(fù)。基因特異引物為F1/R1，以紫花苜蓿ACT2基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物為F2/R2。根據(jù)得到的Ct值，將每種處理的0 h設(shè)為對照，2，4，8，12和24 h分別設(shè)為5個(gè)不同處理，利用2-△△ct法[15]，分別計(jì)算MsLEA4-4基因在不同處理下的表達(dá)量。

1.2.4構(gòu)建植物表達(dá)載體 分別設(shè)計(jì)含有BglⅡ和BsteⅡ 酶切位點(diǎn)的引物F4和R4(表1)，用該引物擴(kuò)增MsLEA4-4的ORF序列，得到帶有酶切位點(diǎn)的目的基因片段；用BglⅡ和BsteⅡ雙酶切該目的基因片段和pCAMBIA3301 質(zhì)粒載體，經(jīng) T4 DNA 連接酶連接，得到插入目的基因的pCAMBIA3301-MsLEA4-4植物超表達(dá)載體(圖1)，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選測序正確序列用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及篩選 提取測序正確的pCAMBIA3301-MsLEA4-4質(zhì)粒，使用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101。采用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，在含草銨膦(PPT, 50 mg/L)的1/2 MS固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因抗性植株，使用PCR和RT-PCR法分別在基因組水平和轉(zhuǎn)錄水平對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測。重復(fù)此篩選步驟至獲得T3代轉(zhuǎn)基因植株并用于后期脅迫處理試驗(yàn)。將獲得的轉(zhuǎn)基因植株在含有NaCl(濃度分別為0、50、100、150、200、250、300 mmol/L)的1/2 MS培養(yǎng)基中生長1周后比較T3轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥植株的生長情況。

實(shí)驗(yàn)中用到的所有引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中的引物序列Table 1 Primer used in the study

注：表中下劃線表示限制性酶切位點(diǎn)。

Note： Underlined nucleotides indicate the restriction site.

圖1 pCAMBIA3301-MsLEA4-4植物超表達(dá)載體構(gòu)建Fig.1 Sketch map of over-expression vector of MsLEA4-4

2 結(jié)果與分析

圖2 紫花苜蓿MsLEA4-4 ORF及載體酶切鑒定結(jié)果Fig.2 PCR results of MsLEA4-4 ORF and constructed vector enzyme digestion a：紫花苜蓿MsLEA4-4 ORF電泳Electrophoresis result of the MsLEA4-4 ORF； M: DNA Marker 2000; 1: MsLEA4-4 ORF 片段 The fragment of MsLEA4-4 ORF.b:植物超表達(dá)載體pCAMBIA3301-MsLEA4-4酶切鑒定Enzyme digestion of over-expression vector pCAMBIA3301-MsLEA4-4；M: DNA Marker 2000；2: BglⅡ/BstEⅡ雙酶切3301-MsLEA4-4 double enzyme digestion of over-expression vector pCAMBIA3301-MsLEA4-4.

2.1 紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆

根據(jù)高通量測序得到的225 bp類LEA Unigene片段，利用RACE-PCR技術(shù)，得到3′端長度為665 bp，5′端長度為498 bp的序列。利用DNAMAN 6.0軟件對所得到的序列進(jìn)行拼接后，得到長為613 bp的ORF序列，見圖2a。 利用NCBI中的BLAST功能進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示該序列與鷹嘴豆(Cicerarietinum)等物種的LEA基因高度同源，初步認(rèn)為獲得的序列是一個(gè)LEA類蛋白序列。

2.2 紫花苜蓿MsLEA4-4基因的生物信息學(xué)分析

該序列含有一個(gè)498 bp的開放閱讀框，編碼166個(gè)氨基酸。序列編碼的蛋白質(zhì)分子量為17.81 kDa，理論等電點(diǎn)為8.74，其中包含25個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K、R)，23個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D、E)，33個(gè)疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)，61個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。該蛋白缺少半胱氨酸(W)和色氨酸(C)，富含甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸以及蘇氨酸等，有5個(gè)重復(fù)的由11個(gè)氨基酸序列TAQAAKEKTQQ組成的序列特征(圖3)。

利用GenBank上的BlastP搜索到來源于不同物種的9個(gè)LEA蛋白序列，并進(jìn)行了比對分析。圖3中可見，該基因編碼蛋白與其他物種中LEA蛋白的同源性相對較高，與蒺藜苜蓿同源性達(dá)96%，與擬南芥、野生大豆(Glycinesoja)、鷹嘴豆、地三葉(Trifoliumsubterraneum)等同源性達(dá)52%～82%。

將該基因與蒺藜苜蓿中LEA基因家族進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)與蒺藜苜蓿LEA4-4聚為一類，屬于第4組LEA蛋白(圖4)。說明該基因可能具有LEA4-4蛋白的功能，將其命名為MsLEA4-4。

圖3 MsLEA4-4氨基酸序列與其他植物L(fēng)EA蛋白的多序列聯(lián)配Fig.3 Multiple alignment analysis of MsLEA4-4 with homologous from other plants 方括號(hào)為5個(gè)重復(fù)的TAQAAKEKTQQ序列。Square brackets are five repetitive sequences of TAQAAKEKTQQ.Ms：紫花苜蓿 Medicago sativa；Mt：蒺藜苜蓿 Medicago truncatula；Ts：地三葉 Trifolium subterraneum；Ca：鷹嘴豆 Cicer arietinum；Cc：木豆 Cajanus cajan；Ah：花生 Arachis hypogaea；Va：赤豆 Vigna angularis；Gs：野生大豆 Glycine soja；Cj：錦雞兒 Caragana jubata；At：擬南芥 Arabidopsis thaliana.

圖4 蒺藜苜蓿LEA家族DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LEA DNA in M. truncatula

2.3 逆境脅迫下紫花苜蓿MsLEA4-4基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR對紫花苜蓿MsLEA4-4基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，多種逆境脅迫均能誘導(dǎo)紫花苜蓿MsLEA4-4基因的增強(qiáng)表達(dá)。在干旱(PEG模擬)、鹽(NaCl)、重金屬(Cu2+處理、Zn2+處理)脅迫誘導(dǎo)下，MsLEA4-4的表達(dá)量上調(diào)。其中干旱脅迫下該基因的表達(dá)量上調(diào)最顯著，處理8 h表達(dá)量為對照的189倍，處理24 h的表達(dá)量達(dá)到對照的1065倍(圖5A)；NaCl脅迫下，MsLEA4-4基因的表達(dá)量在8 h之前無明顯變化，8 h表達(dá)量為對照的16倍，接著又降低到與對照的表達(dá)量基本一致，24 h的表達(dá)量又逐漸上升為對照的35倍(圖5B)；Cu2+脅迫下，MsLEA4-4基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間變化呈單峰趨勢，在8 h表達(dá)量達(dá)到最大，為對照的35倍(圖5C)；Zn2+脅迫下，MsLEA4-4基因的表達(dá)量在12 h之前基本無變化，在處理時(shí)間達(dá)24 h時(shí)表達(dá)量突然上升，但是變化也不大，為對照的15倍左右(圖5D)；冷(4 ℃)脅迫下MsLEA4-4基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在2 h表達(dá)量達(dá)到最大，接著就迅速下降，2 h后表達(dá)量均低于對照(圖5E)；外源ABA也能明顯誘導(dǎo)MsLEA4-4基因的表達(dá)，隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化表達(dá)量逐漸上升，處理24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，為對照的85倍(圖5F)。

圖5 不同脅迫下MsLEA4-4基因的表達(dá)量分析Fig.5 Gene expression analysis of MsLEA4-4 in response to different stress 圖中所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，進(jìn)行方差分析，**為極顯著差異。All data are repeated three times in the Figure， analysis of variance， ** is extremely significant difference.

2.4 紫花苜蓿MsLEA4-4基因轉(zhuǎn)化擬南芥

本研究將來自紫花苜蓿的MsLEA4-4 cDNA全長片段通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入模式植物擬南芥中進(jìn)行超量表達(dá)。首先將MsLEA4-4 cDNA全長片段克隆到植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301中(圖1)。通過限制性內(nèi)切酶BglⅡ/BstEⅡ雙酶切檢測，獲得與預(yù)期大小相符613 bp左右的條帶(圖2b)。再將酶切陽性的克隆測序檢測，插入序列完整、無缺失、無突變，表明MsLEA4-4基因已經(jīng)成功克隆到植物表達(dá)載體中。通過草銨膦篩選后， 提取T2代轉(zhuǎn)基因植株DNA， 分別用nptⅡ和MsLEA4-4引物進(jìn)行PCR檢測，最終篩選出7株含有MsLEA4-4基因的陽性苗(圖6)，可用于后續(xù)MsLEA4-4基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測Fig.6 Detection of transgenic plants by PCR

3 討論

LEA蛋白最早發(fā)現(xiàn)于棉花(Gossypiumhirsutum)子葉中，因其在植物胚胎發(fā)育后期大量表達(dá)而得名[16]。根據(jù)蛋白質(zhì)序列同源性及其特殊的基元序列，Battaglia等[17]將LEA蛋白分為7個(gè)不同的類群。研究發(fā)現(xiàn)，不同LEA蛋白都具有高親水性和熱穩(wěn)定性，缺少半胱氨酸和色氨酸，并富含甘氨酸或其他氨基酸類(如丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)[18]。LEA蛋白在植物中是個(gè)數(shù)量龐大的家族，LEA基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析最先在擬南芥中被報(bào)道，其共有51個(gè)成員，被劃分為7類[19]，隨后在水稻(Oryzasativa)[20]、大豆[21]、黃瓜(Cucumissativus)[22]、玉米[23]中發(fā)現(xiàn)分別含有34、35、78和32個(gè)LEA蛋白，近年來又在蒺藜苜蓿[24]中發(fā)現(xiàn)含有23個(gè)LEA蛋白。紫花苜蓿和蒺藜苜蓿為近緣物種，因此本研究以模式植物蒺藜苜蓿中LEA蛋白為參考基因，對MsLEA4-4基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)MsLEA4-4與蒺藜苜蓿LEA4-4聚在一起，歸屬于LEA4類。因此MsLEA4-4可能具有與LEA4類蛋白相似的功能。

ABA在植物逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著信號(hào)分子的作用。LEA蛋白作為重要的逆境蛋白之一，可能會(huì)通過ABA信號(hào)途徑來調(diào)控植物的耐逆性[25]。這是因?yàn)長EA基因的啟動(dòng)子區(qū)域一般含有ABREs元件，這種順式作用元件可以通過核心基序(ACGT)與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，來起始ABA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[26]。除了ABREs元件外，LEA基因的啟動(dòng)子區(qū)域中還有富含AT序列的ATHB基序(CAATTATTA)，它能與ABA信號(hào)途徑中的調(diào)控因子相互作用來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。此外，在LEA基因啟動(dòng)子區(qū)域還含有能被ABA誘導(dǎo)的胚特異性表達(dá)的DPBF基序(ACACNNG)等[3]。本研究發(fā)現(xiàn)在外源ABA誘導(dǎo)下，MsLEA4-4基因的表達(dá)量在24 h明顯上升，達(dá)到對照的85倍，說明MsLEA4-4對外源ABA的作用比較敏感，有可能會(huì)通過體內(nèi)的ABA信號(hào)途徑來參與紫花苜蓿的抗逆性調(diào)控。

LEA蛋白在植物應(yīng)對外界壓力的過程中扮演著重要的角色[27]。過去的許多研究已經(jīng)報(bào)道了一些LEA蛋白與植物抗逆性相關(guān)的功能。例如，LEA基因的過量表達(dá)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的脅迫抗性[28]。LEA蛋白最常見的功能是參與植物對干旱的響應(yīng)過程[29]，這是因?yàn)長EA基因的啟動(dòng)子區(qū)域上都具有一些與干旱相關(guān)的順式作用元件，所以可能被干旱脅迫所誘導(dǎo)[30]。LEA蛋白還有可能通過保護(hù)植物體內(nèi)的酶活性來提高植物對干旱以及各種脅迫的耐逆性[31]。Wu等[32]發(fā)現(xiàn)在干旱和高鹽條件下轉(zhuǎn)LEA基因丹參體內(nèi)丙二醛含量較低，并具有很高的超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽濃度。本研究中對MsLEA4-4基因進(jìn)行了模擬干旱、高鹽、重金屬等逆境脅迫，發(fā)現(xiàn)干旱、高鹽、重金屬脅迫以及低溫脅迫均能誘導(dǎo)mRNA的積累，尤其是干旱脅迫下表現(xiàn)最為明顯，說明MsLEA4-4基因可能參與了這些逆境調(diào)控。因此下一步將對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱、鹽等逆境脅迫，并研究轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)抗氧化酶活性的變化情況，期望揭示紫花苜蓿MsLEA4-4基因在非生物逆境脅迫中的調(diào)控作用。

References：

[1] Liu G B. The Matal-Binding Properties and the Protective Effect on Biological Macromolecules of Two Soybean LEA4 Protein. Changchun: Northeast Normal University, 2006.

劉國寶. 兩種大豆LEA4蛋白的金屬離子結(jié)合特性及對生物大分子的保護(hù)作用. 長春: 東北師范大學(xué), 2006.

[2] Wang Y R, Zhang Z G, Wu J X. LEA protein and its application in improvement of stress tolerance in plants. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(3): 1-9.

王艷蓉, 張治國, 吳金霞. LEA蛋白及其在植物抗逆改良中的應(yīng)用. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(3): 1-9.

[3] Liu F, Wang X D, Zhao Y P,etal. Isolation and functional characterization of the seed-specific promoter ofLEAgene from cotton (GossypiumhirsutumL.). Cotton Science, 2014, 26(4): 290-294.

劉峰, 汪小東, 趙彥鵬, 等. 棉花種子特異表達(dá)的LEA啟動(dòng)子克隆及功能驗(yàn)證. 棉花學(xué)報(bào), 2014, 26(4): 290-294.

[4] Li X. Molecular Evolutionary Research of the PlantLEAGene Family and Preliminary Functional Analysis of an AtypicalLEAGene inArabidopsis. Zhenjiang: Jiangsu University, 2016.

李翔. 植物L(fēng)EA基因家族的分子進(jìn)化研究和擬南芥非典型LEA基因功能的初步分析. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學(xué), 2016.

[5] Banerjee A, Roychoudhury A. Group II late embryogenesis abundant (LEA) proteins: structural and functional aspects in plant abiotic stress. Plant Growth Regulation, 2015, 79(1): 1-17.

[6] Zou Y D, Shi L S, Liu G B,etal. Structure and function of group 1 late embryo genesis abundant proteins. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2008, 20(3): 490-494.

鄒永東, 施麗沙, 劉國寶, 等. 植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白1組的結(jié)構(gòu)與功能. 生命科學(xué), 2008, 20(3): 490-494.

[7] Zhao Y M, Yang J X, Yu J N,etal. Transformation of a stress tolerant gene in wheat,TaLEA2, intoArabidopsisthaliana. Acta Botanica Boreali Occidentalia Sinica, 2006, 26(1): 1-6.

趙詠梅, 楊建雄, 俞嘉寧, 等. 小麥耐逆基因-TaLEA2轉(zhuǎn)化擬南芥的研究. 西北植物學(xué)報(bào), 2006, 26(1): 1-6.

[8] Dalal M, Kumar G S, Mayandi K. Identification and expression analysis of group 3 LEA family genes in sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench]. Acta Physiologiae Plantarum, 2013, 35: 979-984.

[9] Bai Y Q. Cloning and Functional Characterization ofLEA3-1 Gene from Alfalfa (MedicagosativaL.). Beijing: Chinese Academy of Agricultures Sciences, 2010.

白永琴. 紫花苜蓿LEA3-1基因克隆及其功能驗(yàn)證. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010.

[10] Amara I, Capellades M, Ludevid M D,etal. Enhanced water stress tolerance of transgenic maize plants over-expressingLEARab28 gene. Journal of Plant Physiology, 2013, 170(9): 864-873.

[11] Zamora-Briseno J A, Jimenez E S. A LEA 4 protein up-regulated by ABA is involved in drought response in maize roots. Molecular Biology Reports, 2016, 43(4): 221-228.

[12] Dang N X, Popova A V, Hundertmark M,etal. Functional characterization of selected LEA proteins fromArabidopsisthalianain yeast andinvitro. Planta, 2014, 240(2): 325-336.

[13] Jia H L, Wang X M, Gao H W,etal. Cloning the gene γ-tocopherol methyltransferase (γ-TMT) from alfalfa and expression analysis in adverse situations. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(6): 198-206.

賈會(huì)麗, 王學(xué)敏, 高洪文, 等. 紫花苜蓿γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT)基因的克隆與逆境下的表達(dá)分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(6): 198-206.

[14] Xu A K. The Basic Study on Genetic Improvement ofPuccinelliachinampoensisandMedicagosativaUnder Saline-alkali Conditions. Changchun: Northeast Normal University, 2014.

徐安凱. 鹽堿條件下朝鮮堿茅及紫花苜蓿遺傳改良的基礎(chǔ)研究. 長春: 東北師范大學(xué), 2014.

[15] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[16] Baker J, Van D C, Dure L. Sequence and characterization of 6 Lea proteins and their genes from cotton. Plant Molecular Biology, 1988, 11(3): 277-291.

[17] Battaglia M, Olvera C Y, Garciarrubio A,etal. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiology, 2008, 148(1): 6-24.

[18] Liu Y, Xing X, Li D Q. Studies on the classification and function of LEA proteins. Biotechnology Bulletin, 2011, 8: 36-43.

劉洋, 邢鑫, 李德全. LEA蛋白的分類與功能研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2011, 8: 36-43.

[19] Hundertmark M, Hincha D K. LEA (Late Embryogenesis Abundant) proteins and their encoding genes inArabidopsisthaliana. BMC Genomics, 2008, 9: 118.

[20] Wang X S, Zhu H B, Jin G L,etal. Genome-scale identification and analysis ofLEAgenes in rice (OryzasativaL.). Plant Science, 2007, 172(2): 414-420.

[21] Li L, Xu H L, Yang X L,etal. Genome-wide identification, classification and expression analysis ofLEAgene family in soybean. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(19): 3945-3954.

李樂, 許紅亮, 楊興露, 等. 大豆LEA 基因家族全基因組鑒定、分類和表達(dá). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(19): 3945-3954.

[22] Altunoglu Y C, Baloglu P, Yer E N,etal. Identification and expression analysis ofLEAgene family members in cucumber genome. Plant Growth Regulation, 2016, 80(2): 225-241.

[23] Li X, Cao J. Late embryogenesis abundant (LEA) gene family in maize: identification, evolution, and expression profiles. Plant Molecular Biology Reporter, 2015, 34(1): 15-28.

[24] Liu Z M, Liu W X, Jia X T,etal. Genome-wide analysis ofLEAgene family inMedicagotruncatula. Pratacultural Science, 2015, 32(3): 382-391.

劉志敏, 劉文獻(xiàn), 賈喜濤, 等. 蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因組分析. 草業(yè)科學(xué), 2015, 32(3): 382-391.

[25] Bielas B, Leida C, Rubio-Cabetas M J. Physiological characterization of drought stress response and expression of two transcription factors and twoLEAgenes in threePrunusgenotypes. Scientia Horticulturae, 2016, 213(14): 260-269.

[26] Jia H Y, Suzuki M, McCarty D R. Regulation of the seed to seedling developmental phase transition by the LAFL and VAL transcription factor networks. Developmental Biology, 2014, 3(1): 135-145.

[27] Su M Y, Huang G, Zhang Q,etal. The LEA protein, ABR, is regulated by ABI5 and involved in dark-induced leaf senescence inArabidopsisthaliana. Plant Science, 2016, 247: 93-103.

[28] Liu Y, Wang L, Jiang S S. Group 5 LEA protein,ZmLEA5C, enhance tolerance to osmotic and low temperature stresses in transgenic tobacco and yeast. Plant Physiology and Biochemistry, 2014, 84: 22-31.

[29] Yu J, Lai Y M, Wu X,etal. Overexpression ofOsEm1 encoding a group I LEA protein confers enhanced drought tolerance in rice. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 478(2): 703-709.

[30] Sun X J, Tang X Q, Yu L X,etal. Cloning and characterization of the LEA3 protein gene and promoter fromSorghumbicolor. Plant Diversity and Resources, 2013, 35(5): 585-593.

孫曉嬌, 湯曉倩, 于麗霞, 等. 高粱LEA3 蛋白基因和啟動(dòng)子的克隆及序列分析. 植物分類與資源學(xué)報(bào), 2013, 35(5): 585-593.

[31] Furuki T, Sakurai M. Group 3 LEA protein model peptides protect enzymes against desiccation stress. Biochimica et Biophysica Acta, 2016, 1864(9): 1237-1243.

[32] Wu Y C, Liu C L, Kuang J,etal. Overexpression ofSmLEAenhances salt and drought tolerance inEscherichiacoliandSalviamiltiorrhiza. Protoplasma, 2014, 215(5): 1191-1199.

CloningandexpressionanalysisofMsLEA4-4fromMedicagosativa

JIA Hui-Li1, WANG Xue-Min2, GUO Ji-Cheng3, GAO Hong-Wen2, WU Xin-Ming1, LIU Jian-Ning1, SHI Yong-Hong1, DONG Kuan-Hu4, WANG Yun-Qi1*

1.AnimalHusbandryandVeterinaryInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030032,China; 2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturesSciences,Beijing100193,China; 3.BeijingGreenJinghuaLandscapingCo.,Ltd,Beijing102209,China; 4.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China

Late embryogenesis abundant (LEA) proteins are widely involved in many adverse situations for plants. In this study, we isolated a LEA4 gene from alfalfa by homology cloning strategy, termedMsLEA4-4. TheMsLEA4-4 encoding revealed 512 amino acids and structure analysis showed that the gene contains eleven repeating TAQAAKEKTQQ amino acids sequences. Quantitative real-time PCR was used to detectMsLEA4-4 expression quantities in adverse situations. Results revealed that the expression ofMsLEA4-4 was up-regulated by drought (PEG), salinity (NaCl), Cu2+, Zn2+and ABA stress. Gene expression was highest at 2 h and 8 h under the stress of NaCl, Cu2+and Zn2+. Under chilling and drought stress, the gene showed a rising trend. These results indicate that theMsLEA4-4 protein may be involved in the regulation of environment stress responses in alfalfa. The plant expression vector pCAMBIA3301-MsLEA4-4 was constructed and transgenic plants were obtained through infecting inflorescences ofArabidopsisbyAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation. The vector sequence was tested by antibiotic (PPT) and PCR in the genome of transgenic plants and indicated that the target gene had been transferred. This study provides basic information for further study of theMsLEA4-4 function in stress-tolerance regulation in alfalfa.

Medicagosativa; late embryogenesis abundant proteins (LEA); adversity stress; genetic transformation

10.11686/cyxb2017202http//cyxb.lzu.edu.cn

賈會(huì)麗, 王學(xué)敏, 郭繼承, 高洪文, 吳欣明, 劉建寧, 石永紅, 董寬虎, 王運(yùn)琦. 紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(12): 108-116.

JIA Hui-Li, WANG Xue-Min, GUO Ji-Cheng, GAO Hong-Wen, WU Xin-Ming, LIU Jian-Ning, SHI Yong-Hong, DONG Kuan-Hu, WANG Yun-Qi. Cloning and expression analysis ofMsLEA4-4 fromMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 108-116.

2017-04-25；改回日期：2017-06-14

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-35-25)，物種資源保護(hù)費(fèi)(2130135)和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所項(xiàng)目(xms201506)資助。

賈會(huì)麗(1980-)，女，山西臨猗人，助研，在讀博士。E-mail：jiahuili333@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail: wangyunqi2017@126.com