張 帥，黃嘉玲，林怡麗，程 昊

（1.肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 肇慶 526061；2. 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；3. 廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004）

紫外照射對(duì)靈芝菌絲體多糖的影響

張 帥1，黃嘉玲1，林怡麗1，程 昊2，3

（1.肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 肇慶 526061；2. 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；3. 廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004）

采用紫外照射誘導(dǎo)菌種的方法可使靈芝菌絲體多糖含量增加。首先考察了不同紫外照射時(shí)間和功率對(duì)靈芝菌絲體形態(tài)、生長(zhǎng)速度及多糖含量的影響，發(fā)現(xiàn)小功率、短時(shí)間的照射有利于菌絲體的生長(zhǎng)，并可提高菌絲體多糖的含量，而大功率、長(zhǎng)時(shí)間的照射則會(huì)對(duì)靈芝菌絲體產(chǎn)生相反的影響。然后通過(guò)正交試驗(yàn)，確定了紫外照射提高靈芝菌絲體多糖含量的最優(yōu)條件，即用20 W的紫外燈照射靈芝菌種10 min，靈芝菌絲體多糖含量可達(dá)9.57%，比未經(jīng)紫外照射的靈芝菌絲體多糖含量提高了3.45%。另外，將未紫外照射和在最優(yōu)條件下紫外照射的靈芝的菌絲體多糖進(jìn)行抗氧化能力比較，發(fā)現(xiàn)二者清除·OH和O2-·自由基能力無(wú)明顯差異。

紫外照射；靈芝；菌絲體；多糖；抗氧化

靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，是一種含有多種氨基酸、生物堿、多糖及三萜類(lèi)化合物等生物活性成分的珍貴食用菌［1］，尤其是靈芝中的β-（1→3）葡聚糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤和提高免疫力功能，是靈芝研究和利用最廣泛的活性因子［2-4］。然而，無(wú)論是靈芝菌絲體還是子實(shí)體，其多糖含量并不高［5］，導(dǎo)致目前市場(chǎng)上靈芝多糖保健產(chǎn)品的生理活性不甚理想且生產(chǎn)成本較高，因而提高靈芝多糖含量，可使靈芝這一寶貴“藥食兩用”資源得到更加高效的利用，使靈芝產(chǎn)品的市場(chǎng)前景更加廣闊。

目前提高食用菌多糖含量的方法主要是優(yōu)化發(fā)酵條件及基因工程技術(shù)。如肖雷等［6］和楊孝麗等［7］通過(guò)優(yōu)化液體深層發(fā)酵條件分別提高了靈芝多糖和灰樹(shù)花多糖的含量，而張帆等［8］則通過(guò)過(guò)量表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因OsUgp2提高了紫芝多糖含量。采用基因工程技術(shù)，食用菌胞內(nèi)多糖和胞外多糖均可得到有效提高，但基因工程技術(shù)復(fù)雜，對(duì)設(shè)備和人員技術(shù)要求較高；而通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件通常只能提高食用菌胞外多糖含量。

紫外線是一種非電離照射，低劑量時(shí)通常不會(huì)殺死菌種，只能導(dǎo)致DNA突變，從而引起菌種生理特征和生物性狀的變化。相比X-射線、γ-射線等電離輻射，紫外線易獲得，且對(duì)人體健康危害較小，因此紫外照射在菌種誘變方面得到了廣泛應(yīng)用［9］。通過(guò)菌種誘變來(lái)提高微生物胞外多糖含量已有較多研究［10-12］，但對(duì)其胞內(nèi)多糖含量的影響卻鮮見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)紫外線誘變靈芝菌種，使細(xì)胞DNA突變，有可能引起靈芝生長(zhǎng)過(guò)程中多糖等活性成分的變化。本研究首先用紫外線誘變靈芝菌種，然后對(duì)誘變的靈芝菌種進(jìn)行培養(yǎng)，觀察靈芝菌絲體的形態(tài)及測(cè)定菌絲體中的胞內(nèi)多糖含量，并考察胞內(nèi)多糖含量的變化趨勢(shì)，從而確定紫外照射對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖（簡(jiǎn)稱(chēng)靈芝多糖）含量的影響關(guān)系，并獲得提高靈芝多糖含量的最優(yōu)紫外照射條件。本研究為提高靈芝多糖含量提供了一種簡(jiǎn)單有效的方法，可為其他食用菌活性成分的提高提供方法借鑒，這對(duì)我國(guó)食用菌行業(yè)的發(fā)展以及食用菌產(chǎn)品的深加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

赤靈芝菌種，肇慶學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室試管保藏。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），依說(shuō)明書(shū)配好后分裝試管和平面皿，滅菌后做成PDA斜面和PDA平板若干，冷藏備用。

靈芝液體培養(yǎng)基：250 mL錐形瓶中加入體積比40%的水，20 g/L的葡萄糖，8 g/L的胰蛋白胨，4 g/L的 KH2PO4，3 g/L的 MgSO4·7H2O，加熱攪拌充分溶解，滅菌后冷卻。

苯酚、硫酸、葡萄糖、胰蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、氯仿、正丁醇、鄰苯三酚、水楊酸、FeSO4、H2O2、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 無(wú)菌條件下，將靈芝菌種接于PDA斜面若干，置于生化培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿試管。

1.2.2 紫外誘導(dǎo) 參考Fu等［13］的方法并作改進(jìn)。無(wú)菌條件下，從活化好的的靈芝PDA斜面中取5 mm2大小的菌塊接至PDA平板，置于生化培養(yǎng)箱25℃倒置培養(yǎng)72 h，然后將PDA平板分別置于不同功率紫外燈下45 cm處開(kāi)蓋照射不同時(shí)間，每個(gè)照射處理3次重復(fù)，照射完成后用錫紙包裹（防止光復(fù)活），置25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 菌種篩選 選取各照射處理中菌絲體形態(tài)（色澤、邊緣整齊度）及長(zhǎng)勢(shì)良好的菌體接至PDA斜面培養(yǎng)，每個(gè)照射處理接3管。25℃培養(yǎng)14 d，每個(gè)照射處理選出1支菌絲體形態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)最好的菌種轉(zhuǎn)至液體培養(yǎng)。

1.2.4 菌絲體生長(zhǎng)速度的測(cè)定 參考何明霞等［14］的方法并作改進(jìn)。無(wú)菌條件下，將直徑5 mm的菌塊接種于PDA平板上，置于生化培養(yǎng)箱25℃倒置培養(yǎng)14 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲體生長(zhǎng)速度（mm/d）。每株3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 液體培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，將篩選出的菌種接至液體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7 d，濾出靈芝菌絲體并洗滌3次，再用85%乙醇處理，以除去濕菌體中的脂類(lèi)物質(zhì)，同時(shí)使糖苷酶失活，防止多糖降解。將菌絲體60℃干燥48 h后研成粉末。

1.2.6 多糖提取 參考Li等［15］的方法并作改進(jìn)。分別稱(chēng)取各照射處理菌絲體粉末0.3 g，加15 mL水70 ℃提取3 h，冷卻，4，000 r/min離心15 min，取上清液。用Sevag法［16］除蛋白，加入0.2倍溶液體積的氯仿和0.04倍溶液體積的正丁醇劇烈振蕩30 min，除去蛋白乳化層，取上清液，同法重復(fù)3次，上清液補(bǔ)水至15 mL，搖勻，再移取1～100 mL容量瓶，定容、搖勻，得靈芝多糖樣液。

1.2.7 多糖測(cè)定 采用改進(jìn)的苯酚-硫酸法［17-18］測(cè)定多糖含量。配制0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于試管中，各補(bǔ)水至2 mL，并加入6%苯酚溶液1.6 mL振蕩。再加入7.5 mL濃硫酸，迅速振蕩搖勻，室溫靜置。另取2 mL水作空白對(duì)照。490 nm處測(cè)定各溶液吸光度，以葡萄搪濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y = 10.95x + 0.017，R2= 0.9988，說(shuō)明糖濃度在規(guī)定范圍內(nèi)線性良好。將各照射組靈芝多糖樣液按上述方法處理，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出多糖濃度（以葡萄糖計(jì)），計(jì)算多糖含量：

式中，c為樣液多糖濃度（mg/mL），n為稀釋倍數(shù)，V為樣液體積（mL），m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.8 多糖抗氧化活性測(cè)定 分別對(duì)靈芝多糖清除羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的能力進(jìn)行測(cè)定，用以表征靈芝多糖的抗氧化活性［19］。清除·OH和 O2-·能力測(cè)定均參考候?qū)W敏等［20］的方法并作改進(jìn)。

（1） 清除·OH能力測(cè)定：將靈芝多糖樣液用雙蒸水稀釋成一系列濃度的溶液。取10 mL試管若干，分別依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL以及不同濃度多糖溶液2 mL（空白對(duì)照以雙蒸水代替多糖樣液），最后加入8.8 mol/L H2O2溶液2 mL，混勻并于37℃水浴30 min，離心（3 000 r/min，10 min）后取上清于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，參比溶液以雙蒸水代替H2O2。計(jì)算·OH清除率（I2）：

式中，A0為空白對(duì)照吸光度，Ax為加入樣品溶液后的吸光度，Ax0為參比溶液吸光度。

（2）清除O2-·能力測(cè)定：取10 mL試管若干，分別加入pH 8.2的Tris-鹽酸緩沖液4.5 mL，25℃水浴20 min，各試管再加入不同濃度的多糖溶液0.2 mL及30℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL（以10 mmol/L鹽酸溶液配制），混勻后25℃水浴4 min，立即加4滴8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。以蒸餾水作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)325 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算O2-·清除率（I3）：

式中，A0為空白對(duì)照吸光度，An為加入樣品溶液后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外照射時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度的影響

圖1 紫外照射時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度的影響

靈芝菌種經(jīng)20 W紫外燈不同時(shí)間的紫外照射后，菌絲體生長(zhǎng)速度對(duì)比見(jiàn)圖1。由圖1可知，靈芝菌種經(jīng)紫外照射10 min和15 min后，菌絲體生長(zhǎng)速度明顯高于其他照射時(shí)間靈芝菌種的菌絲體生長(zhǎng)速度，其中照射10 min的靈芝菌種，菌絲體生長(zhǎng)最快。另外，未經(jīng)紫外照射的菌種，其菌絲體生長(zhǎng)速度高于照射5、20、25、30 min的菌種，表明靈芝菌種經(jīng)紫外照射后，既可能導(dǎo)致菌絲體生長(zhǎng)加快，也可能減慢菌絲體生長(zhǎng)速度，較短和較長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射均不利于菌絲體的生長(zhǎng)。

2.2 紫外照射時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體形態(tài)的影響

靈芝菌種經(jīng)20 W紫外燈不同時(shí)間的紫外照射后，菌絲體形態(tài)對(duì)比見(jiàn)表1。從表1可以看出，紫外照射10 min內(nèi)的靈芝菌種，長(zhǎng)出的菌絲潔白且邊緣整齊，顯示出良好的生長(zhǎng)狀況。隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲色澤加深變暗，且菌絲邊緣不再整齊。因此，短時(shí)間的紫外照射，更有利于靈芝菌絲體的生長(zhǎng)。

表1 紫外照射時(shí)間對(duì)靈芝菌絲形狀的影響

2.3 紫外照射時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響

靈芝菌種經(jīng)20 W紫外燈不同時(shí)間的紫外照射后，菌絲體多糖含量對(duì)比見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，靈芝菌種經(jīng)紫外照射5、10、15 min后，相比未照射的菌種，菌絲體多糖含量均有所提高。其中，菌種照射10 min后，其菌絲體多糖含量比紫外照射前的結(jié)果提高3.1%。其他照射處理的菌種，其菌絲體多糖含量均大大下降，且照射時(shí)間越長(zhǎng)，多糖含量下降幅度越大，其中菌種照射30 min后，其菌絲體多糖含量比紫外照射前的結(jié)果下降21.6%?？梢?jiàn)，紫外照射對(duì)靈芝菌絲體中的多糖含量影響較大，短時(shí)間照射有利于菌絲體多糖含量的提高，但提高量并不顯著，而長(zhǎng)時(shí)間照射則會(huì)顯著降低菌絲體中的多糖含量。

圖2 紫外照射時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響

2.4 紫外照射功率對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度的影響

靈芝菌種經(jīng)不同功率紫外燈紫外照射10 min后，菌絲體生長(zhǎng)速度對(duì)比見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，分別經(jīng)10、20、30 W紫外燈照射10 min后的靈芝菌種，相比未照射的菌種，菌絲體生長(zhǎng)速度明顯提高，其中，經(jīng)20 W紫外燈照射的菌種，其菌絲體生長(zhǎng)速度最快，略高于30 W和10 W紫外燈照射的菌種的菌絲長(zhǎng)速。而40 W紫外燈照射菌種的菌絲體長(zhǎng)速明顯低于未照射菌種。結(jié)果表明不同功率的紫外線照射對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度的影響不同，功率為10～30 W的紫外照射有利于靈芝菌絲體的生長(zhǎng)，但功率較高的紫外照射，會(huì)對(duì)菌絲體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。

圖3 紫外照射功率對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度的影響

2.5 紫外照射功率對(duì)靈芝菌絲體形態(tài)的影響

靈芝菌種經(jīng)不同功率紫外燈照射10 min后，菌絲體形態(tài)對(duì)比見(jiàn)表2。由表2可知，隨紫外照射功率的增大，靈芝菌絲密度呈下降趨勢(shì)，菌絲色澤逐漸變暗，菌落邊緣整齊度逐漸下降。其中10 W和20 W紫外燈照射10 min后的菌種，其菌絲體形態(tài)良好，與未照射菌種的菌絲體形態(tài)一致。表明功率較低時(shí)的紫外照射對(duì)菌絲體形態(tài)未產(chǎn)生明顯影響，而功率較大時(shí)的紫外照射則對(duì)菌絲體形態(tài)產(chǎn)生不良影響。

表2 紫外照射功率對(duì)靈芝菌絲形狀的影響

2.6 紫外照射功率對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響

靈芝菌種經(jīng)不同功率紫外燈照射10 min后，菌絲體多糖含量對(duì)比見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，靈芝菌種經(jīng)10、20、30 W紫外燈照射10 min后，相比未照射的菌種，菌絲體多糖含量均有所提高。其中，20 W紫外燈照射10 min后的菌種，其菌絲體多糖含量比紫外照射前的結(jié)果提高2.9%。而40 W紫外燈照射10 min的菌種，其菌絲體多糖含量相比紫外照射前的結(jié)果卻大大下降?？梢?jiàn)，紫外照射功率對(duì)靈芝菌絲體中的多糖含量影響較大，10～30 W的照射有利于菌絲體多糖含量的提高，而大功率的紫外照射則會(huì)顯著降低菌絲體中的多糖含量。

圖4 紫外照射功率對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響

2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化紫外照射條件

根據(jù)紫外照射時(shí)間和功率對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響結(jié)果，設(shè)計(jì)三因子二水平L4（23）正交試驗(yàn)，優(yōu)化紫外照射提高靈芝菌絲體多糖含量的條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，紫外照射功率對(duì)菌絲體多糖含量的影響要大于紫外照射時(shí)間，最優(yōu)照射條件為用20 W紫外燈照射靈芝菌種10 min，即試驗(yàn)2的條件，此時(shí)菌絲體多糖含量為9.57%，相比未經(jīng)紫外照射的靈芝菌絲體多糖含量9.24%，提高3.45%。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.8 紫外照射前后靈芝菌絲體多糖抗氧化性比較

靈芝菌種經(jīng)紫外照射后，其菌絲體多糖分子組成可能有所改變，因此需對(duì)靈芝菌種照射前后菌絲體多糖的生物活性進(jìn)行比較。未照射菌種和經(jīng)20 W紫外燈照射10 min后的菌種，其多糖抗氧化能力的比較結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，靈芝菌種紫外照射前后，其菌絲體多糖清除·OH和O2-·能力無(wú)明顯差異，且均隨多糖濃度的增加而提高，二者抗氧化性一致?？梢?jiàn)，靈芝菌種經(jīng)20 W紫外燈照射10 min后，其菌絲體多糖可能僅含量有明顯增加，而多糖分子組成可能無(wú)明顯改變。

3 結(jié)論與討論

紫外照射是一種應(yīng)用廣泛的菌種誘變方法。靈芝菌種經(jīng)適當(dāng)?shù)淖贤庹丈浜螅囵B(yǎng)的菌絲體形態(tài)及生長(zhǎng)速度均會(huì)發(fā)生變化，表明紫外照射可引起靈芝菌種某些生物性狀發(fā)生改變，而這一改變表明菌絲體所含的某些活性物質(zhì)如多糖含量也會(huì)發(fā)生變化。紫外照射時(shí)間和功率不同，對(duì)靈芝菌絲體中多糖含量的影響也不同，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了紫外照射提高靈芝菌絲體多糖含量的條件，即用20 W的紫外燈照射靈芝菌種10 min，靈芝菌絲體多糖含量可達(dá)9.57%，比未經(jīng)紫外照射的靈芝菌絲體多糖含量提高3.45%。另外，將未紫外照射和在最優(yōu)條件下紫外照射的靈芝菌絲體多糖抗氧化能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者清除·OH和O2-·的能力無(wú)明顯差異。本試驗(yàn)首次考察了紫外線誘變靈芝菌種對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響，并獲得了通過(guò)紫外照射靈芝菌種來(lái)提高靈芝菌絲體多糖含量的條件。采用菌種紫外誘變來(lái)提高靈芝多糖的方法，簡(jiǎn)單易行且實(shí)用性強(qiáng)，因而有較好的應(yīng)用前景。另外，因本研究?jī)H對(duì)靈芝菌種紫外照射后對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響進(jìn)行考察，因而對(duì)靈芝子實(shí)體多糖以及靈芝培養(yǎng)過(guò)程中胞外多糖的含量及生物活性的影響有待進(jìn)一步研究。

圖5 紫外照射前后靈芝菌絲體多糖抗氧化性比較

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Effect of ultraviolet radiation on polysaccharides of Ganoderma lucidum mycelia

ZHANG Shuai1，HUANG Jia-ling1，LIN Yi-li1，CHENG Hao2，3
（1. College of Chemistry and Chemical Engineering，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China；2. College of Biological & Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；3. Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry of Guangxi， Nanning 530004，China）

The content of polysaccharides from Ganoderma lucidum mycelia can be increased using the method of ultraviolet （UV） radiation introduction. The effects of different time and power of UV radiation on morphology，growth rate，and polysaccharides content of mycelia were firstly investigated. The results showed that UV radiation with low power and short time was conductive to mycelia growth and increasing polysaccharides content，and the opposite effects on those occurred under the condition of UV radiation with high power and long time. Then，the optimum UV radiation condition of increasing polysaccharides content was obtained by orthogonal test，that was，G. lucidum strains was radiated for 10 min using a UV lamp with 20 W，and the mycelia polysaccharides content can reach 9.57%，which was 3.45% higher than that of without UV radiation. In addition，the antioxidant ability of mycelia polysaccharides from G. lucidum radiated by UV under the optimum conditions was compared with that without UV radiation. The results indicated that ·OH and O2-· scavenging capacities of the two polysaccharides were not significantly different.

ultraviolet radiation ；Ganoderma lucidum ；mycelia；polysaccharides；antioxidation

S646.9

A

1004-874X（2017）08-0026-07

張 帥，黃嘉玲，林怡麗，等. 紫外照射對(duì)靈芝菌絲體多糖的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（8）：26-32.

2017-05-10

廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610580050）；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃項(xiàng)目（2016TZYKF01）

張帥（1978-），男，博士，副教授，E-mail:Shuaizhang78525@hotmail.com

程昊（1980-），男，碩士，副教授，E-mail:iamchenghao@163.com

（責(zé)任編輯 楊賢智）