王文英，劉喜存，馬曉紅，郭春江，董彥琪

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453000）

西瓜花藥培養(yǎng)的若干影響因素

王文英，劉喜存，馬曉紅，郭春江，董彥琪

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453000）

為了探索西瓜花藥培養(yǎng)的最佳取材時(shí)期、熱激處理時(shí)間及培養(yǎng)基激素配方，通過(guò)花蕾分級(jí)、設(shè)置不同的熱激處理時(shí)間、不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基，觀察分析愈傷組織生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，當(dāng)花蕾和花藥處于中等大小時(shí)，為‘新蜜一號(hào)’花藥接種的適宜時(shí)期；西瓜花藥在33℃的高溫條件進(jìn)行處理3 d，再置于25℃條件下暗培養(yǎng)至14 d能激發(fā)花藥產(chǎn)生愈傷組織。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比為1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA和1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率較高。

西瓜；花藥培養(yǎng)；花蕾形態(tài)；高溫預(yù)處理；誘導(dǎo)培養(yǎng)基

西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai]是人們喜愛(ài)的葫蘆科作物之一，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。傳統(tǒng)西瓜育種需連續(xù)自交多代才能獲得100%純系，這個(gè)過(guò)程需要耗費(fèi)大量時(shí)間和物力。相對(duì)于傳統(tǒng)育種，生物技術(shù)育種也能創(chuàng)造純系，且便捷、高效，因此大大提高育種效率，縮短育種年限。前人研究表明，通過(guò)花粉輻射和離體胚挽救技術(shù)[1-2]、未授粉子房/胚珠培養(yǎng)技術(shù)[3-4]和花藥培養(yǎng)技術(shù)[5-8]均可獲得單倍體胚和植株。然而，影響單倍體誘導(dǎo)途徑的因素很多，如基因型、生長(zhǎng)環(huán)境、外植體發(fā)育階段、誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分、低溫預(yù)處理時(shí)間、熱激處理時(shí)間等[9-10]，但這些影響因素研究尚不透徹，致使胚誘導(dǎo)率低、植株分化率低。榮文娟等[4]以西瓜未受精胚珠為外植體的研究結(jié)果表明，不同基因型的胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率都有顯著差異，35℃高溫預(yù)處理3 d可得到較高愈傷誘導(dǎo)率的質(zhì)量較好的愈傷組織，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2 mg·L-16-BA+3 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1TDZ 上，愈傷誘導(dǎo)率最高，為84.36%。魏躍等[11]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同品種對(duì)激素變化的反應(yīng)也不同，有的較為敏感，有的較為遲鈍，激素6-BA對(duì)誘導(dǎo)率的影響一般要大于NAA，在愈傷組織誘導(dǎo)中，6-BA濃度是關(guān)鍵。筆者在探索花藥培養(yǎng)過(guò)程中，研究了花蕾形態(tài)指標(biāo)、熱激處理時(shí)間及添加不同激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)西瓜花藥培養(yǎng)的影響，為西瓜花藥培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的‘新蜜一號(hào)’西瓜品種，材料分別于2016年和2017年2月初催芽播種，4月初定植于溫室，于盛花期取新鮮花蕾進(jìn)行花藥培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 花蕾選取及處理 試驗(yàn)方法參考朱迎春等[7]。在西瓜植株進(jìn)入盛花期時(shí)，早晨8:00采集花蕾并放置于自封袋中，灑水保濕，4℃冰箱低溫預(yù)處理2 d。預(yù)處理結(jié)束后，挑選健康的花蕾，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精表面消毒30 s，接著用0.1%飽和次氯酸鈉溶液消毒10 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次，剝?nèi)∥鞴匣ㄋ幗臃N于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 花蕾形態(tài)分級(jí) 采集和篩選不同形態(tài)的花蕾并進(jìn)行分級(jí)（表1），接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.5%瓊脂上，pH=5.8。33℃高溫條件下暗培養(yǎng)3 d，然后再置于25℃條件下暗培養(yǎng)至14 d，最后放置在光照條件下培養(yǎng)。每個(gè)形態(tài)的花蕾接種4皿，每皿接種10～15枚花藥，3次重復(fù)。培養(yǎng)20 d后，觀察不同形態(tài)花蕾產(chǎn)生的愈傷組織大小、顏色，并統(tǒng)計(jì)數(shù)目。

表1 不同形態(tài)的花蕾分級(jí)

1.2.3 不同熱激處理時(shí)間 篩選處于單核中期至單核晚期的花藥，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.5%瓊脂上，pH=5.8。立即于33 ℃的高溫條件下暗培養(yǎng) 1、3、5、7 d，然后再置于25℃條件下暗培養(yǎng)14 d，最后放置在光照條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理接種4皿，每皿接種10～15枚花藥，3次重復(fù)。20 d后觀察愈傷組織生長(zhǎng)情況，并記錄其色澤、質(zhì)地等特征。

1.2.4 不同激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基 篩選處于單核中期至單核晚期的花藥，接種在含有不同濃度6-BA和NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（基本培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.5%瓊脂）（表2），pH=5.8。33℃高溫條件下暗培養(yǎng)3 d，然后再置于25℃條件下暗培養(yǎng)至14 d，最后放置在光照條件下培養(yǎng)。每個(gè)形態(tài)的花蕾接種4皿，每皿接種10～15枚花藥，3次重復(fù)，以MS+3%蔗糖+0.5%瓊脂（編號(hào)A0）為對(duì)照培養(yǎng)20 d后，觀察產(chǎn)生的愈傷組織的大小、顏色并統(tǒng)計(jì)數(shù)目。

表2 6種不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

用Microsoft Excel 2007統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用浙江大學(xué)Data Process System V9.01進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾形態(tài)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

西瓜花藥培養(yǎng)至20 d左右時(shí)，花藥頂端中部陸續(xù)長(zhǎng)出愈傷組織。愈傷組織的形態(tài)大致可以分為2種：一種是質(zhì)地致密的黃綠色組織，一種是質(zhì)地疏松的白色組織。選擇質(zhì)地致密的黃綠色愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)，其增殖速度較快并有分化趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），當(dāng)花蕾和花藥處于中等大小時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，花粉所處的發(fā)育時(shí)期為單核中晚期，為‘新蜜一號(hào)’花藥接種的適宜時(shí)期。

表3 不同形態(tài)的花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)率

2.2 熱激處理時(shí)間對(duì)愈傷組織的影響

試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)（表4），西瓜花藥在33℃的高溫條件處理3 d后再置于25℃條件下暗培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)形成黃綠色愈傷組織，質(zhì)地較密，愈傷組織生長(zhǎng)優(yōu)良。在33℃的高溫條件下暗培養(yǎng)1 d和5 d后，形成黃白色愈傷組織或花藥變黑。在33℃的高溫條件下暗培養(yǎng)7 d，愈傷組織生長(zhǎng)情況表現(xiàn)最差，全部發(fā)黑死亡。

表4 不同的熱激處理時(shí)間對(duì)愈傷組織的影響

2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表5），‘新蜜一號(hào)’西瓜花藥在6種激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)20 d左右的培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著。在6種激素處理中，A4、A5培養(yǎng)基即激素配比為1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA 和 1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率較高。A2、A6培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率次之，A0、A1、A3培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最差。

表5 6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 不同形態(tài)的花蕾

通過(guò)觀察花蕾外部形態(tài)和花藥顏色，建立花藥發(fā)育階段與花蕾外部形態(tài)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而確定花藥取材的標(biāo)準(zhǔn)，為提高花藥培養(yǎng)成活率提供了更為便捷的初期選材方法。西瓜花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期到雙核期，以花藥的色澤和花蕾的大小作為初步確定小孢子發(fā)育時(shí)期的標(biāo)志[12]。就多數(shù)植物而言，單核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織，一般所處發(fā)育階段越早的花粉，對(duì)培養(yǎng)條件的要求越苛刻，且培養(yǎng)效果不一定好[13]。與本試驗(yàn)的選材時(shí)期相符。但本試驗(yàn)僅從花蕾、花藥的外觀進(jìn)行分析比較，而未從花蕾開(kāi)放時(shí)期進(jìn)行細(xì)分，后期將繼續(xù)從花蕾選擇方面進(jìn)行深入研究，以便為初期提供更精準(zhǔn)的花蕾材料。

3.2 熱激處理時(shí)間對(duì)愈傷組織的影響

適宜的熱激處理溫度對(duì)愈傷組織或胚狀體的形成以及促進(jìn)其生長(zhǎng)都有重要作用。李娟等[5]研究表明，36℃熱激4 d時(shí)，西瓜小孢子的脫分化效果好。其中，‘271’小孢子脫分化率最高，為4.01%。西瓜花藥需要在高溫條件下處理，從而激發(fā)花藥產(chǎn)生愈傷組織，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響愈傷組織的生長(zhǎng)質(zhì)量。筆者發(fā)現(xiàn)，3 d為較理想的處理時(shí)長(zhǎng)，但本試驗(yàn)設(shè)置的梯度以d為時(shí)間單位，下一步為獲得更精確的熱激處理時(shí)間，應(yīng)加密時(shí)間梯度，以h為時(shí)間單位，進(jìn)一步探索更精確的熱激處理時(shí)間。

3.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響

不同激素對(duì)花藥發(fā)育的影響是不同的，在西瓜花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，6-BA在西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵的作用，其質(zhì)量濃度低于0.5 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率下降。NAA誘導(dǎo)愈傷組織的作用不強(qiáng)，但是愈傷組織的質(zhì)量較好，有較高的分化潛力。緱艷霞[12]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg·L-1KT+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA 誘導(dǎo)‘拿比特’和‘喜都’西瓜花藥愈傷組織頻率最高且質(zhì)量最好，外植體褐化率也較低。本試驗(yàn)僅對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行試驗(yàn)和分析，但其分化和再生能力卻不明確，還需進(jìn)行后續(xù)的誘導(dǎo)分化。

現(xiàn)有的培養(yǎng)程序受基因型的影響仍然很大，不同基因型材料花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)成胚狀體的頻率差異十分顯著。下一步應(yīng)就花藥培養(yǎng)進(jìn)行更詳實(shí)的跟蹤和研究，及時(shí)發(fā)現(xiàn)各種影響因素的作用，并探索其作用機(jī)制，最后總結(jié)出西瓜花藥培養(yǎng)各階段的最適培養(yǎng)基。

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A study of factors affecting anther culture of watermelon

WANG Wenying,LIU Xicun,MA Xiaohong,GUO Chunjiang，DONG Yanqi
(Xinxiang Academy of Agricultural Sciences,Xinxiang 453000,Henan,China,)

The purpose of this experiment was to explore the bud morphological index,high temperature pretreatment and medium hormone formula of watermelon anther culture.The growth of callus was observed and analyzed through bud grading,high temperature pretreatment and different induction medium.The results showed that when the flower buds and anthers were in medium size,it was the suitable period for anther inoculation of the experimental materials.The anther of watermelon was treated of 3 days at 33℃，and then 14 days at 25℃,then the anther callus could be stimulated.The induction rate of callus was higher when the hormone ratio of induction medium was 1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA and 1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA.

Watermelon;Anther culture;Bud morphological;High temperature pretreatment;Induction medium

2017-11-10；

2017-11-14

新鄉(xiāng)市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（CXGG16002）

王文英，女，助理研究員，主要從事西甜瓜育種研究。Tel：0373-3670709；E-mail:wangwenying612@163.com