王中領(lǐng)，唐 納，王 悍，解學乾，張在先，張貴祥

(上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院放射科，上海 200080)

制備anti-EGFR-PEG-SPIO靶向納米分子探針對肺腺癌細胞行體外靶向MR成像

王中領(lǐng)，唐 納，王 悍，解學乾，張在先，張貴祥*

(上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院放射科，上海 200080)

目的探討anti-EGFR-PEG-SPIO納米分子探針對表皮生長因子受體(EGFR)高表達肺腺癌細胞的靶向性及利用MRI對其監(jiān)測的可行性。方法制備anti-EGFR靶向納米分子探針(anti-EGFR-PEG-SPIO)及非靶向納米分子探針(PEG-SPIO)，行電鏡(TEM)觀察，并測量水合粒徑及弛豫率等表征。之后將不同F(xiàn)e濃度(0、10、20、40、60、80 μg/ml)的anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO分別與H460細胞孵育2 h后，進行體外MR成像，觀察其T2WI信號強度及信號強度變化率。行H460細胞普魯士藍染色和電鏡觀察細胞攝取Fe情況。結(jié)果不同F(xiàn)e濃度anti-EGFR-PEG-SPIO及PEG-SPIO探針分別與H460細胞孵育2 h后，前者顯示H460細胞的信號強度隨Fe濃度的升高而明顯減低，F(xiàn)e濃度為60 μg/ml時，相對于0、10、20、40、80 μg /ml，信號強度變化率約為-58.2%、-82.7%、-94.4%和-98.3%；而后者顯示H460細胞信號強度減低相對不明顯。普魯士藍染色及TEM結(jié)果顯示anti-EGFR-PEG-SPIO的H460細胞內(nèi)可見大量鐵顆粒沉積，而PEG-SPIO的腫瘤細胞內(nèi)僅可見少量鐵顆粒沉積。結(jié)論自行制備的anti-EGFR-PEG-SPIO分子探針對H460肺腺癌細胞具有靶向效應(yīng)，采用3.0T MR掃描儀可對其進行監(jiān)測。

靶向成像；肺；腺癌；分子探針；超順磁性氧化鐵

MR分子成像可從細胞、分子水平對腫瘤進行靶向顯像及診斷[1-3]，是一種特異性高、無創(chuàng)的新型診斷方法。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)在細胞的增值、生長及分化等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，具有較高的組織特異性，在肺腺癌中呈高表達。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide-dopamine, SPIO)作為非病毒載體具有低毒性以及超順磁性，在MR分子成像中得到廣泛的應(yīng)用。本研究制備anti-EGFR單克隆抗體靶向多功能納米分子探針，評價其對肺腺癌細胞的靶向性以及利用MR監(jiān)測的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 靶向anti-EGFR-PEG-SPIO及非靶向PEG-SPIO納米探針(中國科學院化學研究所提供)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco BRL，Gaithersburg)，F(xiàn)BS(胎牛血清；Gibco BRL，Gaithersburg)，青霉素-鏈霉素溶液(杭州吉諾生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶(1∶250;Gibco BRL，Gaithersburg)。人非小細胞型肺癌細胞(H460;購于上海生命科學院細胞庫)。

1.2 主要設(shè)備 細胞CO2培養(yǎng)箱Heraeus BB15(美國Thermo Scientific公司)，GE Signa HDx 3.0T MR掃描儀，光學顯微鏡Leica DFC295(德國Leica公司)，投射電子顯微鏡2010F(日本JEOL公司)。

1.3 方法

1.3.1 anti-EGFR-PEG-SPIO的合成 參照文獻[4]合成PEG-SPIO；將PEG-SPIO(Fe 2 mg，3.5 mg/ml)加入2 ml的EP管內(nèi)，將1 ml 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基鈉鹽(sulfo-NHS，2.8 mg)溶解于PBS緩沖液，并迅速轉(zhuǎn)移至PEG-SPIO中，室溫下反應(yīng)15 min；采用PD-10交換柱對活化后的PEG-SPIO進行碳酸氫鈉/碳酸鈉緩沖液(NaHCO3/Na2CO3；pH=8.5)交換，洗脫液采用NaHCO3(0.1 M)，然后加入1 mg的西妥昔單抗在室溫下進行耦聯(lián)反應(yīng)，4 h后采用PBS緩沖液進行透析過夜。耦聯(lián)完畢后，將耦聯(lián)物置于4℃儲存。

1.3.2 anti-EGFR-PEG-SPIO與PEG-SPIO表征測量 采用透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)測量SPIO的粒徑，納米粒度儀測試耦聯(lián)anti-EGFR前后的靶向與非靶向分子探針的水合粒徑及MRI T2值，并計算弛豫率(R2；單位：s-1·mM-1)：R2=1/T2。

1.3.3 細胞培養(yǎng) 將H460接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，待貼壁的H460細胞密度生長至90%時，去除原培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化，每4天傳一代。并采用光學顯微鏡對培養(yǎng)中的細胞進行動態(tài)觀察。待細胞生長總數(shù)達1×107個時停止傳代，備用。

1.3.4 細胞毒性實驗(MTT比色法) 將密度為3×105的H460細胞種植于96孔板，于37 ℃、5% CO2恒溫箱中孵育24 h，之后將不同F(xiàn)e濃度的(10、20、40、60、80 μg/ml)anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO探針與H460細胞孵育24 h。然后在96孔板中每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，至培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液并加入DMSO約200 μl，20 min后采用酶標儀在490 nm處測量各孔細胞吸光度，采用PBS溶液作為對照，每孔吸光度測量4次。

1.3.5 anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO探針細胞攝取實驗 普魯士藍染色：按照文獻[1]方法將與H460細胞的靶向和非靶向分子探針進行普魯士藍染色。將1×106個H460細胞分別與Fe濃度為40 μg /ml的anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO探針在RPMI 1460培養(yǎng)液中孵育2 h(置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱)，PBS溶液沖洗3次，4%戊二酮固定20 min，蒸餾水洗3次，核固紅復染3 min，蒸餾水洗滌3次，然后于倒置顯微鏡下觀察Fe染色結(jié)果。

細胞攝取的TEM觀察：將含量1×105的H460細胞接種于培養(yǎng)板，待細胞倍增至90%時，加入Fe濃度為60 μg/ml 的anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO對比劑，孵育6 h，去除培養(yǎng)液后PBS溶液沖洗3次。然后采用2.5%戊二醛磷酸鹽固定12 h(4℃)，采用1%四氧化鋨溶液于4℃固定3 h，后經(jīng)乙醇梯度脫水約25 min后采用Epon 812進行包埋、修塊及切片。采用醋酸鈾和檸檬酸鉛室溫下染色各3 min，水洗、風干，電鏡下觀察并拍照。

1.3.6 體外MR成像 將H460細胞接種于6孔板中，分別將Fe濃度為0、10、20、40、80 μg /ml的anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO探針與1×106的H460細胞孵育2 h，PBS溶液沖洗3次，經(jīng)胰蛋白酶消化后重懸于0.5 ml 1%瓊脂糖的EP管。

采用3.0T MR掃描儀、動物小線圈對懸浮細胞進行成像。采用T2WI快速自旋轉(zhuǎn)回波序列：TR 3 000 ms，TE 90.4 ms，層厚1 mm，層間距1 mm，矩陣256×256，F(xiàn)OV 8 cm×8 cm

信號強度分析：分別選擇每各樣本大小一致、同一橫截面的ROI(面積>30 mm2)測量T2WI信號強度，同一樣品測量6次，計算平均值及標準差。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。不同F(xiàn)e濃度anti-EGFR-PEG-SPIO及PEG-SPIO探針與H460細胞孵育后T2WI信號強度比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK及LSD檢驗；相同F(xiàn)e濃度下，anti-EGFR-PEG-SPIO與PEG-SPIO探針的T2WI信號差異采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Anti-EGFR靶向與非靶向納米聚合物的表征 TEM所測SPIO的粒徑為9.2 nm，納米粒子分布均勻，無粘連(圖1A、B)。耦聯(lián)anti-EGFR前后納米聚合物水合粒徑約38.5 nm和45.7 nm(圖1C)。MRI所測anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO的T2值(圖1D)分別為10.3 ms和 11.2 ms，R2分別為 97.1 s-1·mM-1和 89.3 s-1·mM-1。

圖1 anti-EGFR靶向與非靶向納米聚合物的表征 A、B.SPIO的電鏡圖及粒徑直徑分布圖; C.耦聯(lián)anti-EGFR前后納米聚合物水合粒徑; D.anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO的R2值 圖2 anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO的MTT 圖3 體內(nèi)H460細胞攝取實驗 anti-EGFR-PEG-SPIO(A)和PEG-SPIO(B)的普魯士藍染色(×200)；anti-EGFR-PEG-SPIO(C)和PEG-SPIO(D)的細胞攝取電鏡表現(xiàn)(×20 000) 箭示Fe顆粒染色聚積

2.2 細胞毒性實驗 MTT顯示當anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO的Fe濃度為80 μg/ml時，H460細胞生存率均為85%以上(圖2)。

2.3 體內(nèi)H460細胞攝取實驗

2.3.1 普魯士藍染色 濃度為40 μg /ml的anti-EGFR-PEG-SPIO探針與H460細胞孵育后，大量細胞內(nèi)可見藍色鐵顆粒沉積(圖3A)，PEG-SPIO探針與H460細胞孵育后，細胞內(nèi)僅可見少量鐵顆粒沉積(圖3B)。

2.3.2 細胞內(nèi)攝取 anti-EGFR-PEG-SPIO納米分子探針與H460細胞孵育6 h后，H460細胞內(nèi)可見大量Fe顆粒染色沉積(圖3C)，而PEG-SPIO在H460細胞內(nèi)僅可見少量Fe顆粒染色積聚(圖3D)。

2.4 MR體外成像 anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO探針(Fe濃度為0 10、20、40、60、80 μg/ml)與肺腺癌細胞孵育2 h后，T2WI信號強度差異均有統(tǒng)計學意義(F=2 948.62、1 023.83，P均<0.01)，且anti-EGFR-PEG-SPIO的Fe濃度為0、10、20、40、80 μg/ml時與其他各濃度兩兩比較T2WI信號強度差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，見表1。anti-EGFR-PEG-SPIO的T2WI信號強度隨Fe濃度的升高而明顯降低，F(xiàn)e濃度為60 μg/ml時，細胞信號強度下降顯著，相對于Fe濃度0、10、20、40、80 μg /ml，anti-EGFR-PEG-SPIO信號強度變化率分別為-58.2%、-82.7%、-94.4%和-98.3%；PEG-SPIO的T2WI信號強度減低相對較弱(圖4)。Fe濃度為0時，anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO的T2WI信號差異無統(tǒng)計學意義(t=0.41，P>0.05)，F(xiàn)e濃度為10、20、40、80 μg /ml時，anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO的T2WI信號差異有統(tǒng)計學意義(t=6.94、10.40、13.98、7.71，P均<0.01)。

表1 不同F(xiàn)e濃度anti-EGFR-PEG-SPIO及PEG-SPIO分子探針與H460細胞孵育后T2WI信號強度(±s)

表1 不同F(xiàn)e濃度anti-EGFR-PEG-SPIO及PEG-SPIO分子探針與H460細胞孵育后T2WI信號強度(±s)

Fe濃度(μg/ml)anti-EGFR-PEG-SPIOPEG-SPIO01441.50±43.121424.33±58.6410603.00±26.14831.83±38.1920246.33±29.15526.33±28.604081.17±7.55287.00±34.098025.17±3.19198.33±18.14

圖4 T2WI信號強度 A.anti-EGFR-PEG-SPIO(下排)和PEG-SPIO(上排)的T2WI信號; B.anti-EGFR-PEG-SPIO和PEG-SPIO探針T2WI信號強化趨勢圖

3 討論

EGFR在多種上皮性腫瘤中呈高度表達或過表達，如非小細胞型肺癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌及頭頸部腫瘤，而在正常表皮細胞常不表達，具有較高的組織特異性。研究[3-5]表明anti-EGFR單克隆抗體與肺腺癌腫瘤細胞有很強的結(jié)合能力。SPIO具有良好的水溶性及超順磁效應(yīng)，常被用作MRI T2負順磁效應(yīng)對比劑、藥物傳遞的載體及腫瘤的熱療[6-8]。利用anti-EGFR單克隆抗體作為載體，可將SPIO攜帶至腫瘤細胞表面，通過EGFR配體介導細胞內(nèi)化并將其攝入細胞漿，降低腫瘤T2值，對藥物的釋放監(jiān)測及提高腫瘤診斷敏感性具有重要價值，可實現(xiàn)MRI對腫瘤治療監(jiān)測的可視化。

本研究采用anti-EGFR抗體修飾PEG包裹的SPIO，構(gòu)建anti-EGFR-PEG-SPIO靶向MRI分子探針，利用不同F(xiàn)e濃度的分子探針與H460細胞孵育，根據(jù)腫瘤細胞攝取不同F(xiàn)e含量的對比劑而形成細胞T2信號強度差異，從細胞水平探討腫瘤的監(jiān)測可視化以及細胞靶向成像在臨床診療中的應(yīng)用。TEM顯示磁性納米粒子具有良好分散性及水溶性，DLS結(jié)果表明anti-EGFR修飾后的PEG-SPIO，水合粒徑發(fā)生變化，表明anti-EGFR單克隆抗體成功耦聯(lián)到PEG-SPIO納米粒子表面，通過體外細胞MR成像及細胞攝取實驗，發(fā)現(xiàn)anti-EGFR單克隆抗體修飾的PEG-SPIO納米探針具有良好的靶向性及活性。本研究以納米分子探針對H460進行細胞毒性實驗，采用不同F(xiàn)e濃度的靶向與非靶向分子探針與H460腫瘤細胞孵育24 h后，細胞生存率均超過85%以上，提示該納米分子探針具有低毒性，可作為MRI對比劑應(yīng)用于體內(nèi)外研究。

靶向與非靶向分子探針與H460細胞孵育后的MR成像結(jié)果顯示，隨著Fe濃度的增加，anti-EGFR-PEG-SPIO的腫瘤細胞攝取率明顯高于PEG-SPIO，差異統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果表明，anti-EGFR單克隆抗體修飾的納米分子探針對H460具有明顯靶向效應(yīng)。本研究在H460細胞靶向攝取實驗中，發(fā)現(xiàn)在相同F(xiàn)e濃度下，anti-EGFR-PEG-SPIO的腫瘤細胞內(nèi)見大量鐵顆粒沉積染色，而EG-SPIO僅可見少量鐵顆粒染色，進一步證實靶向分子探針H460細胞對靶向納米分子探針的攝取主要依賴于EGFR。筆者推測腫瘤細胞靶向攝取的機制可能為anti-EGFR單克隆抗體與H460細胞表面EGFR受體特異性結(jié)合，將納米分子探針以內(nèi)化方式帶入細胞內(nèi)，導致腫瘤細胞MRI信號強度改變。

SPIO具有很好的生物相容性及超順磁效應(yīng)，因此在藥物傳遞、MRI的分子探針以及腫瘤熱療中得到廣泛的應(yīng)用[9-12]。在MR成像中，與非聚合的Gd復合物相比，SPIO則呈現(xiàn)更高的敏感度。通常在其表面包覆葡聚糖、PEI及PEG等衍生物，以提高其在體內(nèi)外的生物相容性及穩(wěn)定性[13-14]。本研究構(gòu)建anti-EGFR修飾PEG包覆的SPIO靶向納米分子探針，具有超聲磁性效應(yīng)及靶向性，符合作為MR分子探針的要求，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Preparationofanti-EGFR-PEG-SPIOmolecularprobeanditstargetingMRIforlungadenocarcinomacells

WANGZhongling,TANGNa,WANGHan,XIEXueqian,ZHANGZaixian,ZHANGGuixiang*

(DepartmentofRadiology,ShanghaiFirstPeople'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200080,China)

ObjectiveTo observe the targeting function of high affinity anti-EGFR monoclonal antibody (Cetuximab)-conjugated superparamagnetic iron oxide-dopamine (anti-EGFR-PEG-SPIO) lung cancer cells via epidermal growth factor receptor (EGFR), as well as the feasibility for surveillance of tumor targeting with MRI.MethodsNanoparticles (NPs) of anti-EGFR-PEG-SPIO and PEG-SPIO were prepared, and the morphology of nanoparticles was observed with transmission electron microscope (TEM). The hydrodynamic diameter and R2 values of nanoparticles before and after conjugation with anti-EGFR were performed with dynamic light scattering (DLS) and MRI. MRI was performed in incubation with anti-EGFR-PEG-SPIO and PEG-SPIO after 2 h in vitro. The cellular uptake of anti-EGFR-PEG-SPIO and PEG-SPIO was further evaluated using Prussian blue staining and TEM.ResultsAnti-EGFR-PEG-SPIO and PEG-SPIO showed signal intensity of H460 cells on T2WI, decreased significantly compared with PEG-SPIO. The rate of signal intensity change was -58.2%, -82.7%, -94.4% and -98.3%, respectively, at iron concentrations of (0, 10, 20, 40, 80 μg/ml) of anti-EGFR-PEG-SPIO. Prussian blue staining and TEM showed that a lot of intracellular irons of anti-EGFR-PEG-SPIO were observed in H460 cells, but few of PEG-SPIO.ConclusionThe effect of active targeting via anti-EGFR in EGFR overexpressed cells can be achieved with anti-EGFR-PEG-SPIO in H460 cells in vitro, and the targeting delivery process could be monitored with 3.0T MRI.

Targeting imaging; Lung; Adenocarcinoma; Molecular probe; Superparamagnetic iron oxide-dopamine

R445.2

A

1003-3289(2017)12-1797-05

國家自然科學基金(81371623)。

王中領(lǐng)(1979—)，男，江蘇宿遷人，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：分子影像及腦功能成像。E-mail: zlwang138136@126.com

張貴祥，上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院放射科，200080。E-mail: gxzhang021@163.com

2016-12-06

2017-10-10

10.13929/j.1003-3289.201612019