聶智毅，黎瑜，康桂娟，蔡海濱，曾日中

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巴西橡膠樹的克隆及表達分析

聶智毅，黎瑜，康桂娟，蔡海濱，曾日中*

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

依據(jù)橡膠樹膠乳轉錄組數(shù)據(jù)，利用RT–PCR技術鑒定了一個快速堿化因子(rapid alkalinization factor, RALF)家族基因cDNA序列。該cDNA長度為767 bp，開放閱讀框長度為411 bp，編碼136個氨基酸。序列比對顯示該RALF基因與有較高相似性，因而命名為。以熱研7–33–97無性系橡膠樹為材料，采用實時熒光定量PCR對不同組織及乙烯、茉莉酸、傷害、過氧化氫、高鹽、低溫、干旱等處理下的表達模式進行分析。結果表明：在橡膠樹葉片、花、樹皮以及膠乳中均有表達，其中膠乳中表達量最高；與健康橡膠樹相比，在死皮橡膠樹膠乳及樹皮中的表達量顯著上調(diào)；乙烯、茉莉酸、過氧化氫及傷害處理能誘導該基因表達，而低溫、干旱及高鹽處理則抑制該基因表達，表明可能參與橡膠樹的信號傳導、產(chǎn)排膠調(diào)控以及脅迫響應。

巴西橡膠樹；；快速堿化因子；基因克?。槐磉_分析

巴西橡膠樹(Muell. Arg.)是一種重要的熱帶經(jīng)濟林木，其樹皮乳管中的膠乳是天然橡膠的重要商業(yè)來源。用乙烯(ethylene, ET)及茉莉酸(jasmonic acid, JA)等植物激素刺激可增加膠乳產(chǎn)量，但其增產(chǎn)機制仍未完全明確[1–2]。目前，乙烯利(2–chlorethylphosphonic acid, ethephon)刺激增產(chǎn)技術已廣泛應用于天然橡膠的生產(chǎn)，可有效增加天然橡膠產(chǎn)量，降低割膠強度，在提高勞動生產(chǎn)率的同時，延長橡膠樹經(jīng)濟壽命[3]。但是應用乙烯利刺激也會導致橡膠樹排膠時間過長、早衰以及死皮(tapping panel dryness, TPD)等負面效應，嚴重影響了天然橡膠的可持續(xù)生產(chǎn)[4]。對橡膠樹乳管ET及JA等激素響應基因進行分離鑒定，從橡膠樹產(chǎn)排膠和衰老等方面對ET及JA信號響應基因進行系統(tǒng)分類及深入研究，有助于揭示ET及JA等刺激橡膠樹增產(chǎn)的生理生化和分子機制，并為研發(fā)安全、高效、增產(chǎn)的新型刺激劑打下基礎。

快速堿化因子(rapid alkalinization factor, RALF)是廣泛存在于高等植物中的一類多肽信號分子，由PEARCE等[5]在提取純化煙草的系統(tǒng)素時偶然發(fā)現(xiàn)。RALF參與多種植物生長發(fā)育及脅迫響應生理過程[6]。NIE等通過cDNA芯片技術分析了ET刺激下橡膠樹膠乳的基因表達變化，發(fā)現(xiàn)一個RALF基因在ET刺激下顯著上調(diào)表達[7]。本研究中，通過比對橡膠樹膠乳轉錄組數(shù)據(jù)庫，鑒定該基因開放閱讀框(open reading frame, ORF)序列，利用生物信息學軟件對該基因編碼蛋白質的結構特征進行預測并分析其進化關系；以實時熒光定量PCR技術(real– time quantitative PCR, RT–qPCR)研究該基因的表達模式，初步分析其功能，旨在為揭示該基因的生物學功能，探明ET與JA等促進橡膠樹增產(chǎn)的機制以及橡膠樹死皮發(fā)生機理。

1　材料與方法

1.1　材料

供試材料為熱研7–33–97無性系橡膠樹。

主要試劑：RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Fisher；100 bp DNA Ladder、pMD– 18T Vector及2×SYBRPremix Ex TaqII購自TaKaRa；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR MasterMix購自北京天根生化科技有限公司；茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、聚乙二醇6000 (PEG6000)購自Sigma–Aldrich；總RNA提取以及其余相關試劑購自上海生工生物有限公司。相關引物(表1)由上海生工生物有限公司合成。

表1　HbRALF34克隆和表達分析所用引物序列

1.2　方法

1.2.1材料處理

ET、JA、H2O2及傷害處理均選用樹圍已達到開割標準的未開割熱研7–33–97無性系橡膠樹。參照HAO和WU[8]的方法：JA處理以羊毛脂為載體，在每株橡膠樹割線下方刮去外周木栓層，涂2 g含1%JA的羊毛脂；ET處理在每株橡膠樹割線下方涂1%的乙烯利。參照TANG等[9]的方法，以8顆圖釘間距均勻的刺入橡膠樹割線樹皮進行傷害處理。參照ZHU等[10]的方法，在每株橡膠樹割線下方涂1.5%的H2O2。各處理3次重復。每重復處理6株橡膠樹，以處理0 h作為對照。

選用熱研7–33–97無性系橡膠組培苗為低溫、干旱及高鹽脅迫處理材料。橡膠組培苗根部清洗后置清水中，以30 ℃、相對濕度80%、12 h光照(強度為600 μmol/(m2·s))和12 h黑暗、靜置培養(yǎng)2~3 d進行脅迫處理。將橡膠組培苗根部浸沒于1 mol/L的NaCl溶液中進行高鹽脅迫處理；參照劉輝等[11]的方法，橡膠組培苗浸沒于30%PEG6000作為干旱脅迫處理；橡膠組培苗于人工氣候箱中以4 ℃、相對濕度80%、16 h光照(強度為600 μmol/(m2·s))和8 h黑暗培養(yǎng)作為低溫處理。各處理3次重復。每個重復5株橡膠組培苗，以處理0 h為對照。

1.2.2樣品的采集

采集1990年定植的熱研7–33–97無性系橡膠樹樹皮、葉片、雄花、雌花及膠乳作為基因組織表達差異分析的樣品。ET及JA處理0、4、8、24、48、72 h，采集膠乳作為ET及JA誘導表達分析樣品；傷害及H2O2處理0、6、24、48 h，采集膠乳作為傷害及H2O2誘導表達分析樣品；低溫、干旱及高鹽脅迫處理0、3、24、48 h，采集橡膠組培苗葉片作為低溫、干旱及高鹽脅迫表達分析樣品；選取樹圍相對一致的健康橡膠樹和死皮橡膠樹，割膠采集膠乳，收集割下的樹皮，快速用0.1% DEPC處理過的蒸餾水洗去附著的膠乳，并用滅菌的濾紙吸干，作為健康及死皮橡膠樹膠乳及樹皮表達差異分析樣品。膠乳樣品直接滴入液氮中收集，花、葉片及樹皮樣品經(jīng)液氮研磨成粉末。所有樣品于–70 ℃中凍存，備用。

1.2.3橡膠樹各組織的總RNA提取及cDNA合成

橡膠樹各組織總RNA參照XU等[12]方法提取，以DNase I去除殘留的DNA。按照反轉錄試劑盒說明書，以各組織、各處理及對照樣品RNA為模板合成克隆及表達分析所需cDNA。

1.2.4基因ORF的擴增及序列分析

采用BioEdit5.0.6，以序列L0012[7]比對膠乳轉錄組數(shù)據(jù)庫(SRA數(shù)據(jù)庫登錄號SRR1648124)[13]，并利用DNAMAN 8.0.8進行分析，獲得該基因完整ORF序列。以引物RALFOF及RALFOR對基因ORF進行驗證。PCR反應條件：94 ℃保持 5 min；94 ℃保持30 s；55 ℃保持30 s；72 ℃保持30 s；共35個循環(huán)；72 ℃保持7 min。擴增結束后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小。PCR產(chǎn)物回收后與pMD–18T載體于16 ℃連接8 h后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取插入片段大小正確的陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司進行測序。分別采用Pfam27.0 (http://pfam.xfam.org/)和Compute pI/Mw (http://web. expasy.org/compute_pi/)分析蛋白的保守結構域、分子量和等電點。以SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)及TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)進行信號肽及蛋白跨膜結構域預測。將序列進行BLASTX (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)比對，獲得該基因的同源序列，以ClustalX 2程序進行多重比對，運用MEGA5.05軟件的鄰接法(neighbour–joining, NJ)構建系統(tǒng)進化樹，并進行1 000次Bootstrap統(tǒng)計學檢驗。

1.2.5基因表達模式分析

以為內(nèi)參(GenBank登錄號AB268099，擴增引物為Hb18SF及Hb18SR)，用引物RALFQF1和RALFQR1對各組織、各處理及對照進行RT–qPCR分析。反應條件：95 ℃保持30 s；95 ℃保持5 s；58 ℃保持20 s；72 ℃保持20 s；共45個循環(huán)。循環(huán)結束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性。以公式2–ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.3　數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1　基因的克隆及序列分析

通過比對橡膠樹膠乳轉錄組數(shù)據(jù)庫，并以RT–PCR驗證，獲得的目的基因含完整ORF的cDNA序列，該cDNA序列大小為767 bp，目的基因ORF大小為411 bp，編碼136個氨基酸。生物信息學分析結果顯示，該序列編碼的蛋白相對分子量為15 600，理論等電點為8.38；結構域分析表明，該蛋白N端存在1個跨膜結構域，第1~25位氨基酸是信號肽序列；C端存在1個RALF結構域(圖1)。與擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫比對結果表明，該蛋白與擬南芥() RALF家族蛋白中的AtRALF34一致性最高，為56%。比對其他物種結果顯示，與該基因編碼蛋白一致性最高的是木薯() RALF蛋白，一致性達85%，其次是麻瘋樹() RALF蛋白，一致性為80%。此外，與蓖麻()、可可()、葡萄()及胡楊()等物種RALF34蛋白有較高一致性，因此將其命名為。

下劃線部分表示RALF結構域；□表示跨膜結構域；*表示起始及終止密碼子；雙橫線表示YISY基序；▲表示預測的信號肽剪切位點；◆表示雙堿性氨基酸基序。

2.2　多序列比對及系統(tǒng)發(fā)生分析

選擇擬南芥、木薯、麻瘋樹、蓖麻、可可、胡楊和葡萄等7個物種的HbRALF34同源蛋白序列與HbRALF34進行氨基酸多重序列比對和系統(tǒng)進化分析。多重序列比對結果顯示，這些RALF蛋白的RALF結構域高度保守(圖2)。系統(tǒng)進化分析結果顯示，橡膠樹HbRALF34與同屬大戟科的木薯、麻瘋樹及蓖麻RALF蛋白親緣關系最近(圖3)。

圖2　HbRALF34與其他RALF蛋白序列比對

圖3　HbRALF34與其他植物RALF蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.3　HbRALF34的組織表達特性

組織表達分析結果(圖4)表明，在橡膠樹樹皮、葉片、膠乳、雄花及雌花中皆有表達，其中，表達量最高的組織是膠乳，樹皮次之，表達量最低的組織是葉片。比較健康橡膠樹和死皮橡膠樹中表達差異發(fā)現(xiàn)，相對于健康橡膠樹，死皮橡膠樹膠乳及樹皮中的表達極顯著上調(diào)(圖5)。

各柱形上不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。

“**”表示差異極顯著(P＜0.01)

2.4　HbRALF34的誘導表達分析

的誘導表達分析結果顯示，膠乳中受傷害及H2O2(表2)、ET及JA(表3)誘導先上調(diào)表達，表達量達到最高后迅速下降。傷害處理6 h時，的表達水平顯著高于對照，為對照的2.1倍；處理24~48 h時，該基因的表達顯著低于對照。H2O2處理6 h 時，的表達顯著高于對照，為對照的1.6倍；24 h時，該基因的表達基本恢復到與對照相近的水平。ET處理4 h 時，為對照的2.3倍；8 h時表達量達到最高，約為對照的3.5倍；處理24~48 h時，該基因的表達顯著低于對照，處理72 h后基本恢復到與對照相近的表達水平。JA處理后，的表達在8 h與對照差異顯著，表達量是對照的1.7倍，處理24~72 h，的表達顯著低于對照。橡膠樹葉片中，的表達受低溫、高鹽及干旱脅迫的抑制。低溫、高鹽及干旱脅迫處理后，的表達量皆在3 h顯著低于對照，直到處理后48 h仍顯著低于對照(表4)。

表2　傷害及H2O2處理下膠乳HbRALF34的表達量

同行不同字母示差異顯著(<0.05)。

表3　ET及JA處理下膠乳HbRALF34的表達量

同行不同字母示差異顯著(<0.05)。

表4　干旱、低溫及鹽脅迫處理下橡膠樹葉片HbRALF34的表達量

同行不同字母示差異顯著(<0.05)。

3　結論與討論

本研究克隆的編碼1個典型的RALF前體蛋白，其N端存在信號肽及跨膜結構域，C端包含1個RALF結構域，RALF結構域的N末端存在1個絕對保守的YISY基序(motif)。此外，HbRALF34存在3個雙堿性氨基酸基序(dibasic amino acid motif)，可能作為水解酶特異性識別位點，用于RALF蛋白加工成熟或RALF的降解失活[5,14]。蛋白序列比對及系統(tǒng)進化分析表明，橡膠樹HbRALF34與擬南芥、蓖麻及可可等物種RALF家族中的RALF34蛋白同源性最高。目前，植物中的RALF34功能仍未清楚[6]，對HbRALF34的功能研究將有助于解析該類RALF基因的生物學功能。

的組織表達分析結果表明，在橡膠樹不同的組織皆有表達，而且存在顯著的表達差異，以膠乳中表達最高，暗示HbRALF34可能在橡膠樹多種生理過程中發(fā)揮作用，且與橡膠樹乳管中的生理過程密切相關。橡膠樹乳管是一種植物防衛(wèi)結構，膠乳是乳管細胞中的細胞質，橡膠樹的產(chǎn)排膠過程是一種植物創(chuàng)傷反應過程[15–18]。傷害、ET及JA刺激皆能增加橡膠樹膠乳產(chǎn)量。其中，ET刺激可通過調(diào)節(jié)橡膠樹乳管水循環(huán)、延緩乳管堵塞物形成及提高乳管糖代謝水平等調(diào)控橡膠樹產(chǎn)排膠[7]。ET刺激橡膠樹膠乳的pH值變化呈現(xiàn)出刺激點附近趨向堿化的趨勢[19]。JA則可促進橡膠樹乳管分化及橡膠生物合成[18]。而ET與JA是傷害信號轉導的相關信號分子，它們之間相互作用，共同參與橡膠樹的創(chuàng)傷反應[18–20]。已有研究表明，RALF及其受體可以調(diào)控H+–ATP酶的活性，從而調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)外pH值；RALF還參與植物細胞內(nèi)Ca2+信號的調(diào)控及MAPK的激活等[6]。細胞pH變化是植物調(diào)節(jié)細胞生長及響應外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的重要反應，是植物防御反應信號傳遞途徑中的重要部分[21–23]；而Ca2+與MAPK在調(diào)控植物生長發(fā)育及脅迫應答中皆發(fā)揮重要作用[24–27]。本研究結果顯示，在橡膠樹膠乳中表達最高，而在膠乳中受傷害、ET及JA誘導上調(diào)表達，表明其可能參與傷害、ET及JA等信號的傳導，與橡膠樹產(chǎn)排膠調(diào)控相關。橡膠樹死皮是由強割(一種機械傷害)和強乙烯刺激所導致的產(chǎn)排膠失調(diào)[28–31]。與健康橡膠樹相比，死皮橡膠樹膠乳及樹皮中的表達均極顯著上調(diào)，顯示可能與橡膠樹死皮相關，進一步表明了與橡膠樹產(chǎn)排膠調(diào)控的關系。此外，H2O2、低溫、高鹽及干旱脅迫皆能迅速引起表達的顯著變化，表明可能參與橡膠樹的脅迫應答。下一步通過對HbRALF34進行亞細胞定位，分離其受體，分析HbRALF34與受體的關系，深入研究HbRALF34及其受體的生物學功能，了解它們在橡膠樹生長發(fā)育、產(chǎn)排膠調(diào)控、死皮發(fā)生及脅迫應答中的作用，有助于進一步揭示該類RALF的作用機制。

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責任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Cloning and expression analysis offrom

NIE Zhiyi, LI Yu, KANG Guijuan, CAI Haibin, ZENG Rizhong*

(Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Danzhou, Hainan 571737, China)

Based on the latex transcriptome date, a cDNA sequence of rapid alkalinization factor (RALF) family gene was identified by RT–PCR. The cDNA is 767 bp in size with a 411 bp open reading frame and encodes 136 amino acids. BLASTX searches of GenBank showed that the deduced amino acid sequences of RALF gene was similar to，thus was named as. Expression profiles ofin different tissues ofclone Reyan 7–33–97 and in response to ethylene (ET), jasmonic acid (JA), wounding, hydrogen peroxide (H2O2), high salt, low temperature and drought were assayed via real–time quantitative PCR (RT–qPCR). The results suggested thatwas ubiquitously expressed in the leaves, flowers, barks and latex of rubber tree, and its highest expression was in latex. Compared with healthy rubber tree, the expression level ofwas increased in latex and bark of tapping panel dryness rubber tree. Moreover, the expression ofwas induced by ET, JA, H2O2and wounding treatments, but was inhibited by high salt stress, low temperature and drought treatments. All these results suggest thatis likely involved in signal transduction, regulating rubber biosynthesis and latex flow, as well as responding to stress in.

;; rapid alkalinization factor; gene cloning; expression analysis

S794.1

A

1007-1032(2017)06-0597-07

2017–05–22

2017–11–04

國家自然科學基金項目(31770642，31270713)；海南省自然科學基金項目(20153108)

聶智毅(1978—)，男，廣西梧州人，副研究員，主要從事天然橡膠質量相關的遺傳與環(huán)境因素研究，narzyzizip@163.com；

通信作者，曾日中，研究員，主要從事天然橡膠質量相關的遺傳與環(huán)境因素研究，hnzrz@aliyun.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn