王怡悅 何侃 葉芊

葡萄籽原花青素預(yù)處理對幼齡小鼠深低溫腦缺血/再灌注損傷的保護作用

王怡悅 何侃 葉芊

目的探討葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)預(yù)處理對小鼠腦缺血/再灌注損傷保護作用機制。方法120只3周齡C57/BL6小鼠隨機分成3組：假手術(shù)組、模型組、GSPE組(每組再分為缺血120分鐘再灌注后1、6、24、72小時，4個亞組，n=10)，GSPE組灌胃給藥2 mL/10 g(100 mg/kg)，每天1次，共2周；同時假手術(shù)組與模型組給予等量雙蒸水。GSPE組于術(shù)前30分鐘最后1次灌胃給藥，模型組與假手術(shù)組則給予同體積雙蒸水。分別于再灌注后1、6、24、72小時處死小鼠取腦，檢測各組各時間點腦組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malonyldialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)含量，TUNEL法檢測小鼠大腦皮層細胞凋亡。組間各時間點比較采用單因素方差分析和Bonferroni法兩兩比較。結(jié)果GSPE組在再灌注后1、6、24小時SOD、GSH-px均明顯高于模型組(P<0.05)，GSPE組MDA在1、6、24小時均高于假手術(shù)組(P<0.05)，但在6、24小時均低于模型組(P<0.05)；與假手術(shù)組比較模型組和GSPE組于再灌注各時間點均出現(xiàn)明顯的病理凋亡(P<0.05)，GSPE組各時間點病理凋亡均顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)論GSPE可能通過誘導(dǎo)SOD、GSH-Px生成，清除MDA，對深低溫缺血再灌注腦起保護作用。

葡萄籽原花青素； 腦缺血再灌注； 超氧化物歧化酶； 谷胱甘肽過氧化物酶； 丙二醛； 凋亡

在小兒復(fù)雜先天性心臟病外科手術(shù)中往往需要采用深低溫停循環(huán)或深低溫低流量技術(shù)，但如果時間較長，均會造成不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)是存在于葡萄中的一種天然植物多酚，是一種天然的抗氧化劑，具有強大的對抗氧化應(yīng)激及減少細胞凋亡作用[1]。通過建立幼齡小鼠深低溫缺血/再灌注模型，并檢測各組各時間點小鼠腦組織細胞凋亡及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malonyldialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)含量，探討GSPE對腦損傷的影響及可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

3周齡雌性健康C57BL6小鼠120只，體質(zhì)量15～17 g(南京大學(xué)模式動物研究所，13B6547)；GSPE(美國隆思達公司，LS136011)；便攜式鉑電阻數(shù)字溫度計JM624(天津今明儀器有限公司)；SOD、MDA、NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細胞凋亡(TUNEL)檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展公司)。

1.2 實驗動物分組及給藥

小鼠120只，隨機分成3組：假手術(shù)組、模型組、GSPE組(每組再分為缺血120分鐘再灌注后1、6、24、72小時，4個亞組，n=10)。GSPE組灌胃給藥2 mL/10 g(100 mg/kg)，每天1次，共2周；同時假手術(shù)組與模型組給予等量雙蒸水。GSPE組于術(shù)前30分鐘最后1次灌胃給藥，模型組與假手術(shù)組則給予同體積雙蒸水。灌胃給藥過程中假手術(shù)組與GSPE組各死亡1只小鼠，模型組死亡2只小鼠。

1.3 模型制備

術(shù)前小鼠禁食12小時，禁水4小時，10%水合氯醛0.3 mL/10 g腹腔注射麻醉小鼠，將鉑電阻數(shù)字溫度計探頭插入小鼠肛門1 cm深處，將小鼠置于冰盒中，降溫至(18.5±0.5)℃，每分鐘體溫下降不超過0.5℃。將小鼠置于解剖臺上固定四肢，取頸部正中切口，解剖游離兩側(cè)頸總動脈，予無創(chuàng)動脈夾阻斷兩側(cè)頸總動脈，120分鐘后開放血流，將小鼠放置新生兒暖箱中復(fù)溫，每分鐘體溫恢復(fù)不超過0.5℃，在30分鐘內(nèi)將體溫逐漸恢復(fù)至32℃并至復(fù)蘇。假手術(shù)組除不阻斷頸總動脈和不予用藥外，其余操作同前。本手術(shù)模型的可靠性在先前實驗中已得到驗證[2]。模型制備過程中，假手術(shù)組死亡1只小鼠，模型組死亡3只小鼠，GSPE組死亡2只小鼠。

1.4 檢測方法

SOD、MDA、GSH-px測定及腦細胞凋亡測定：分別在再灌注后各個時間點將小鼠斷頭處死，取出新鮮腦組織，用生理鹽水洗凈后投入液氮凍存用于測定SOD、MDA、GSH-px，各指標檢測方法均按試劑盒說明。同時用TUNEL法檢測各時間點小鼠大腦皮層腦組織細胞凋亡，細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=(凋亡細胞數(shù)÷細胞總數(shù))×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠腦組織SOD含量變化

模型組SOD在缺血120分鐘再灌注后1、6、24、72小時均明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)；GSPE組SOD在缺血120分鐘再灌注后1、6、24小時點低于假手術(shù)組(P<0.05)，但高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.2 小鼠腦組織GSH-px含量變化

模型組GSH-px在各時間點均明顯低于假手術(shù)組(P<0.05),而GSPE組雖在缺血120分鐘再灌注后1、6、24小時低于假手術(shù)組(P<0.05)，但顯著高于模型組(P<0.05)。見表2。

2.3 小鼠腦組織MDA含量變化

模型組MDA在缺血120分鐘再灌注后1、6、24小時均高于假手術(shù)組(P<0.01)，GSPE組MDA在缺血120分鐘再灌注后1、6、24小時均高于假手術(shù)組(P<0.05)，但在缺血120分鐘再灌注后6、24小時均低于模型組(P<0.05)。見表3。

2.4 小鼠腦細胞凋亡測定

與假手術(shù)組比較，模型組與GSPE組小鼠腦組織在缺血120分鐘再灌注后6、24小時即出現(xiàn)明顯凋亡(P<0.01)，而GSPE組小鼠在缺血120分鐘再灌注后6、24小時腦組織凋亡均明顯輕于模型組(P<0.05)。見表4、圖1。

表1 各組小鼠各時間點腦組織SOD含量

注： 與模型組比較，aP<0.05；與假手術(shù)組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表2 各組小鼠各時間點腦組織GSH-px含量

注： 與模型組比較，aP<0.05；與假手術(shù)組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表3 各組小鼠各時間點腦組織MDA含量

注： 與模型組比較，aP<0.05；與假手術(shù)組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表4 各組小鼠腦組織缺血120分鐘

注： 與模型組比較，aP<0.05；與假手術(shù)組比較，bP<0.05，cP<0.01。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：GSPE組

圖1 各組大腦皮層TUNEL-staning結(jié)果(TUNEL×40)

3 討論

盡管深低溫具有腦保護作用[3]，但長時間缺血后再灌注對腦組織損傷仍不可避免。本實驗?zāi)Ｐ徒咏谂R床心臟直視手術(shù)中DHLF時腦缺血再灌注狀況，可明顯損傷腦組織，且與細胞凋亡有關(guān)[2]。本實驗TUNEL-staining結(jié)果顯示模型組在再灌注6小時后凋亡明顯，而GSPE組再灌注6小時后與模型組比較凋亡明顯減少，提示GSPE可以減輕缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷機制十分復(fù)雜，近年來人們逐漸證實自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血病理反應(yīng)中的核心環(huán)節(jié)。自由基是機體正常代謝產(chǎn)物，在機體多種生理活動中是不可缺少的。但如果自由基過多堆積，超出機體抗氧化系統(tǒng)拮抗能力時就可損傷正常組織功能。缺血后再灌注可以使自由基連鎖反應(yīng)激化，加重缺血損傷[4]。SOD可有效地清除自由基反應(yīng)的啟動因子來抑制自由基反應(yīng)，因此組織中SOD活性的高低間接反映機體清除氧自由基的能力；GSH-Px能有效地阻斷或減輕脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)，減少脂自由基對生物體的損害；而MDA是自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA的高低可間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[5]。本實驗?zāi)Ｐ徒M中腦組織MDA含量于再灌注后6小時即開始上升，24小時達到高峰，而腦組織SOD活性由于消耗過多在術(shù)后1小時即開始下降，72小時降至最低水平，GSH-Px于再灌注6小時后開始下降，24小時降至最低，隨后逐漸恢復(fù)正常。GSPE組相應(yīng)時間點MDA含量、GSH-Px含量及SOD活力與模型組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

先前實驗研究發(fā)現(xiàn)GSPE對小鼠深低溫缺血再灌注腦的保護作用與AKT-Caspase3有一定的關(guān)聯(lián)[6]，另外Gemma等[7]研究表明GSPE能夠誘導(dǎo)胰島素自主磷酸化從而上調(diào)葡萄糖，由此可見在深低溫缺血再灌注過程中，GSPE可通過多種途徑發(fā)揮其腦保護作用，其中誘導(dǎo)SOD、GSH-Px生成，清除MDA是一條重要途徑。

[1] Feng Y,Liu YM,Leblanc MH,et al.Grape seed extract given three hours after injury suppresses lipid peroxidation and reduces hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats[J].Pediatr Res,2007,61(3):295-300.

[2] 馬志飛,莫緒明,楊中洲,等.深低溫低流量AKT1+/-轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建與初步表型分析[J].江蘇醫(yī)藥,2010,36(8):909-912.

[3] Ananiadou OG,Bibou K,Drossos GE,et al.Effect of profound hypothermia during circulatory arrest on neurologic injury and apoptotic repressor protein Bcl-2 expression in an acute porcine model[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2007,133(4):919-926.

[4] 崔福愛,安玉會,王秀利,等.酸性神經(jīng)肽1對VD小鼠腦內(nèi)SOD、MDA和NO的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003,41(1):14-15.

[5] 何曉敏,莫緒明,陳鳳,等.去鐵胺預(yù)處理對幼齡大鼠深低溫腦缺血/再灌注損傷的影響[J].中華實驗外科雜志,2008,25(12):909-912.

[6] 王怡悅,莫緒明,馬志飛,等.葡萄籽原花青素可能通過AKT-Caspase3途徑對深低溫缺血再灌注腦起保護作用[J].中華實驗外科雜志,2011,28(12):2177-2179.

[7] Gemma M,Sheela O,Montserrat V,et al.Oligomers of grape-seed procyanidin extract activate the insulin receptor and key targets of the insulin signaling pathway differently from insulin[J].J Nutr Biochem,21(6):476-486.

Protectionofrapeseedproanthocyanidinextractoncerebralischemia-reperfusioninducedbydeephypothermiainmice

WANGYiyue,HEKan,YEQian.

Rehabilitationacademyofsciences,NanjingNormalUniversityOfSpecialEducation,Nanjing210023,China

ObjectiveTo determine the protection mechanism of Grape seed proanthocyanidin extract(GSPE) on rat model of cerebral ischemia/reperfusion(I/R) induced by deep hypothermic.Methods120 three-week-old C57/BL6 mice were randomly divided into sham operation group，model group and GSPE group. Each group was redistributed into four subgroup of 1, 6, 24, 72h. The GSPE group was gavage with grape seed proanthocyanidin extract 2 ml/10 g (100 mg/kg), once a day for two weeks; while the sham group and model group was given the same amount of double-distilled water. The last intragastric administration were 30min before surgery, the model group and the sham group was treated with the same volume of double-distilled water. SOD, MDA, GSH-Px was detected in each time point, and the apoptotic level of cerebral cells was detected by Tunel staning. ANOVA and Bonferroni pairwise comparison method was used to compare each time point between the groups.ResultsSOD, GSH-px in GSPE group was significantly higher than those in the model group at different time points in reperfusion(P<0.05), MDA in GSPE group were higher than that in the sham operation group(P<0.05) in 1, 6, 24h, but lower than those in the model group in 6, 24h(P<0.05); compared with the sham operation group, the pathologic apoptosis was significantly in reperfusion at each time point in model group and GSPE group(P<0.05), compared with the model group, the pathologic apoptosis in GSPE group at each time point was alleviated(P<0.05).ConclusionGSPE has a protective effect against deep hypothermic cerebral I/R injury through inducing SOD, GSH-Px and eliminating MDA.

Grape seed proanthocyanidin extract; Cerebral ischemia-reperfusion; Superoxide dismutase; Glutathione peroxidase; Malonyldialdehyde; Apoptosis

210023 南京特殊教育師范學(xué)院康復(fù)科學(xué)學(xué)院

王怡悅(1985- )，女，碩士，助教，主治醫(yī)師。研究方向：深低溫缺血再灌注腦保護。E-mail:yiyuew@163.com

何侃(1963- )，女，本科，教授。研究方向：特殊兒童心理康復(fù)。E-mail:952729825@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.09.005

2016-09-24)

(本文編輯： 禹佳)