韓潤(rùn) 徐光臨 胡誠(chéng) 劉力 徐德生

·論著·

提取方式對(duì)干姜揮發(fā)油的急性毒性及成分影響

韓潤(rùn) 徐光臨 胡誠(chéng) 劉力 徐德生

目的對(duì)比超臨界萃取(SFE)和水蒸氣蒸餾(SD)兩種方法提取的干姜揮發(fā)油的急性毒性和化學(xué)成分。方法分別用兩種方法提取揮發(fā)油，采用經(jīng)典的毒性試驗(yàn)方法進(jìn)行比較性研究，記錄其毒性癥狀，死亡速率及體重變化，用Bliss法分別計(jì)算LD50及其95%可信度，用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)兩種工藝提出的揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析比較。結(jié)果小鼠主要中毒癥狀為，腹部刺激，呼吸急促等。死亡時(shí)間多集中在8小時(shí)以內(nèi)。干姜經(jīng)超臨界萃取提取的揮發(fā)油LD50=6.7174(4.066～8.108)mL/kg，折算生藥為L(zhǎng)D50=223.9(135.5～270.3) g/kg；經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取出的揮發(fā)油LD50=9.1109(8.133～10.206) mL/kg，折算生藥為L(zhǎng)D50=1012.3(903.7～1134)g/kg。兩種方法提取出來(lái)的揮發(fā)油化學(xué)成分不完全一致，SFE組相較于SD組提出的組分更多。結(jié)論采用SD法提取的干姜揮發(fā)油安全性更高，其原因是SFE提取的揮發(fā)油化學(xué)成分復(fù)雜。

干姜； 揮發(fā)油； 急性毒性； 氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀

干姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc的干燥根莖，冬季采挖，除去須根及泥沙，曬干或低溫干燥。趁鮮切片曬干或低溫干燥者稱為“干姜片”，具有溫中散寒，回陽(yáng)通脈，溫肺化飲的功效[1]。炮制后的干姜片含揮發(fā)油1%左右，現(xiàn)代藥理研究表明，干姜揮發(fā)油具有抗炎，抗腫瘤，促進(jìn)局部血液循環(huán)的作用。揮發(fā)油提取工藝中，常采用傳統(tǒng)的水蒸氣提取，隨著工藝的發(fā)展，超臨界萃取揮發(fā)油的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但在工藝的安全性上研究較少，缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)主要考察兩種提取方法提取干姜揮發(fā)油的安全性，并采用GC-MS法初步分析化學(xué)成分的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干姜購(gòu)自上海虹橋中藥飲片公司(批號(hào)：150918)產(chǎn)地：山東，經(jīng)上海虹橋中藥飲片有限公司質(zhì)檢科授權(quán)人陳燕軍鑒定為姜科植物干姜的飲片，質(zhì)量符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015版標(biāo)準(zhǔn)。

健康ICR小鼠，SPF級(jí)，體重18～22 g，雌雄各半，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物置于(22±1)℃控溫和光暗周期為12小時(shí)環(huán)境下，給予清潔級(jí)普通小鼠飼料飼養(yǎng)(上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

ZDHW型調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，HH-SH-4型單列四孔水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，DZF-1型真空干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)計(jì)廠)，HA220-50-06型超臨界萃取儀(海安華陽(yáng)超臨界科技有限公司)，ANY220型電子天平(島津分析天平)，AGILENT 7890B/5977A GC/MSD型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)AGILENT公司)。

吐溫-80(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150121)，無(wú)水硫酸鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130328)，乙醚(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20131102)。

1.2 供試樣品的制備

1.2.1 水蒸氣蒸餾法(SD)提取揮發(fā)油 稱取干姜飲片300 g，置于3000 mL圓底燒瓶中，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版干姜揮發(fā)油提取甲法(干姜揮發(fā)油相對(duì)密度小于1)，加蒸餾水2100 mL，加熱至微沸并回流提取6小時(shí)，放冷0.5小時(shí)，讀取體積。得油率為0.9%。

1.2.2 超臨界萃取法(SFE)提取揮發(fā)油 將干姜飲片打粉過(guò)篩，取其10目至30目粉末400 g，50℃減壓真空干燥3小時(shí)，置CO2超臨界萃取儀萃取。萃取條件為：進(jìn)樣壓力25 MPa，進(jìn)樣溫度55℃，流量為25～35 L/h，分離Ⅰ溫度為58℃，分離Ⅱ溫度為36℃，萃取2小時(shí)。總得油率為3.0%。

1.2.3 揮發(fā)油的乳化 乳化配比為，油∶吐溫-80∶水=2∶1∶4.2，乳化溫度為50℃。為了便于調(diào)整劑量，促進(jìn)小鼠胃部吸收以及保證給藥濃度的均一性，在灌胃前對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行了乳化，乳化劑采用吐溫-80。吐溫-80小白鼠經(jīng)口LD50為25 g/kg(參照美國(guó)科學(xué)院毒性物質(zhì)分級(jí)屬于無(wú)毒性)。乳化指標(biāo)為肉眼觀看色澤均一，無(wú)掛壁，無(wú)分層，在此基礎(chǔ)上盡可能減少用量。

1.3 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)方法：取60只小鼠，雌雄各半進(jìn)行預(yù)分組。將雄鼠和雌鼠按照體重接近的原則分開(kāi)放入6個(gè)組別中，雄鼠3組，雌鼠3組，并分別做好標(biāo)記記下體重。在30只雄鼠中，每組隨機(jī)抽取一只，組成一個(gè)任意組，共分為10組雄鼠。雌鼠同上。最后分出5個(gè)劑量組，每組12只，然后每個(gè)劑量再分兩組，分別為SD組和SFE組。每組6只，雌雄各半。由此方法分組可使得每組小鼠體重盡量分布趨于一致。

正式實(shí)驗(yàn)方法：取110只小鼠，雌雄各半。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)的分組辦法分出11組，每組10只，雌雄各半。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出最大全活劑量和最小全死劑量然后中間增加三個(gè)劑量組，相鄰兩個(gè)劑量組間比值r=0.8，5個(gè)劑量組平行用于SD組和SFE組。最后一組空白對(duì)照組為乳化劑。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得，水蒸氣蒸餾組和超臨界組的最大全活量及最小全死量不盡相同，選取最大區(qū)間范圍后再安插三個(gè)劑量組得到最終設(shè)置給油量(凈油量，不含乳化劑)：5.83、7.29、9.11、11.39、14.23 mL/kg。SFE組對(duì)應(yīng)生藥劑量：194.33、243、303.67、379.67、474.33 g/kg；SD組對(duì)應(yīng)生藥劑量：647.78、810、1012.22、1265.56、1581.11 g/kg。每組10只，雌雄各半。灌胃前禁食不禁水12小時(shí)。最終稀釋后采用等濃度不同體積的給藥方式，不同劑量之間的給藥體積差異給予相應(yīng)的空白乳化劑補(bǔ)齊，空白組為最高劑量組等體積的乳化劑。灌胃給藥后，0.5、1、2、4、8、12小時(shí)觀察一次，以后每天至少觀察一次并稱取體重，共14天。

1.4 GC-MS法分析揮發(fā)油化學(xué)成分

色譜條件：色譜柱：Agilent 19091S-433UI，HP-5MS，(325℃:30 m×250 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度為250℃。程序升溫：起始溫度60℃，3℃/min升至80℃，保持10分鐘，3℃/min升至140℃，保持15分鐘，6℃/min升至270℃，保持10分鐘。分流比：5∶1。載氣：高純氮?dú)狻?/p>

質(zhì)譜條件：離子源溫度250℃；進(jìn)樣口溫度280℃；電子能量70 ev。調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧，質(zhì)量掃描方式：全部掃描范圍：10～400 m/z。

揮發(fā)油樣品的處理：取適量揮發(fā)油，加入適量無(wú)水硫酸鈉，3000 r/min離心5分鐘，過(guò)濾取上清液，經(jīng)乙醚稀釋1000倍后進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1 μL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠給藥后總體狀況

給藥后，多數(shù)小鼠均有不同程度的毒性反應(yīng)，輕度毒性反應(yīng)有不安，煩躁，但在進(jìn)水進(jìn)食后有所改善，自行恢復(fù)，明顯中毒癥狀有腹部刺激，運(yùn)動(dòng)減少，眼瞼下垂。重度毒性反應(yīng)有抽搐震顫。隨著時(shí)間的發(fā)展，出現(xiàn)明顯毒性和重度毒性反應(yīng)的老鼠大部分在一天之內(nèi)死亡。第4、5劑量組給藥后有立即死亡出現(xiàn)。也有部分老鼠的癥狀在2～3天后恢復(fù)至正常?？瞻捉M中小鼠均表現(xiàn)正常，未見(jiàn)任何異常形態(tài)。

2.2 SD組和SFE組小鼠的死亡速率情況對(duì)比

兩組藥物給藥后分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96小時(shí)觀察死亡情況。SD組的小鼠出現(xiàn)毒性癥狀相對(duì)遲緩，溫和，并且癥狀較輕，2天以后逐漸恢復(fù)不再出現(xiàn)死亡。SFE組小鼠中毒及死亡速率較SD組更快、更急，癥狀更重，3天以后才逐漸恢復(fù)不再出現(xiàn)死亡。由于高劑量死亡數(shù)高，而低劑量幾乎無(wú)死亡，不能很好地反映死亡速率變化情況，故以兩組藥物的中間劑量存活情況進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 SD組和SFE組小鼠存活數(shù)時(shí)間對(duì)比圖

2.3 SD組和SFE組存活小鼠的體重狀況對(duì)比

在給藥的第一周內(nèi)，兩組小鼠各劑量組的體重相較于空白組影響以及組間影響均有顯著性差異(P<0.05)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SFE組對(duì)體重的影響大于SD組，高劑量組甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。給藥后第二周兩組小鼠體重均有不同程度恢復(fù)并加速增長(zhǎng)，SD組在一周以后的體重增長(zhǎng)狀況高于空白組，體重差異與空白組逐漸減小，恢復(fù)情況好于SFE組。體重均值增長(zhǎng)變化分別選取有代表性的兩組別進(jìn)行對(duì)比，見(jiàn)表1。

2.4 兩種揮發(fā)油LD50結(jié)果

兩種揮發(fā)油的LD50結(jié)果見(jiàn)表2。采用Bliss法并根據(jù)表2計(jì)算得：SD組的回歸方程y(Probit)=-5.3045+10.739Log(D)；半數(shù)致死量LD50=9.1109 mL/kg；LD50(Feiller校正)95%的可信限=8.133～10.206 mL/kg；對(duì)應(yīng)生藥LD50=1012.3(903.7～1134) g/kg；LD50=6.4031 mL/kg；LD95=12.964 mL/kg。SFE組的回歸方程y(Probit)=0.9569+4.8876Log(D)；半數(shù)致死量LD50=6.7174 mL/kg；LD50(Feiller校正)95%的可信限=4.066～8.1078 mL/kg；對(duì)應(yīng)生藥LD50=223.9(135.5～270.3) g/kg；LD50=3.0949 mL/kg；LD95=14.58 mL/kg。

表1 SD組和SFE組小鼠體重對(duì)比表

表2 SD組和SFE組的LD50結(jié)果

圖2 SD組和SFE組干姜揮發(fā)油總離子流圖(紅色：SD組；綠色：SFE組)

2.5 SD組與SFE組的揮發(fā)油化學(xué)成分對(duì)比

對(duì)兩組樣品平行進(jìn)樣，采用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以面積歸一法對(duì)比各成分的相對(duì)含量。按照前述GC-MS條件得出總離子流圖及對(duì)比圖見(jiàn)圖2、圖3。

筆者對(duì)總離子圖中各峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，得到各峰質(zhì)譜圖，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)NIST檢索，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]，對(duì)干姜揮發(fā)油成分進(jìn)行初步分析。

從提取方法對(duì)化學(xué)成分產(chǎn)生的影響上看，成分大體一致。SFE組總體提出的成分多于SD組，并且在相同的進(jìn)樣體積條件下平行進(jìn)樣，大部分組分峰面積也大于SD組，從這一方面也可以看到SFE組比SD組成分多而雜。具體來(lái)看，SFE組有利于提取分子量較大和沸點(diǎn)較高的組分，而SD組則有利于提取小分子和沸點(diǎn)較低的組分。推測(cè)應(yīng)該是SD的溶劑水沸點(diǎn)在100°C左右，在密閉的環(huán)境下提取過(guò)程中對(duì)高沸點(diǎn)的成分提取能力有限，并且高溫會(huì)破壞一些成分的提取，而SFE萃取溫度偏低，且壓力高，因而在不破壞一些組分的情況下，可以提取更多高沸點(diǎn)的組分。

圖3 SD組和SFE組干姜揮發(fā)油疊加總離子圖(紅色：SD組；綠色：SFE組)

從化學(xué)成分對(duì)安全性產(chǎn)生的影響上看，筆者從SD組樣品中分離得到了91種成分，鑒定了其中41種。SFE組樣品中分離得到了108種成分，鑒定了其中36種。兩組中主要成分都集中在單萜烯類、倍半萜烯類以及含氧衍生物，其中兩組分含量最高的均為α-姜烯，單品主要應(yīng)用于調(diào)味劑。其次是α-姜黃烯和1-b-Bisabolene,且SFE組含量明顯高于SD組，另外在40.9分鐘出峰的成分2,4-二叔丁基苯酚在SD組中未見(jiàn)發(fā)現(xiàn)。SD組在20分鐘前提出的小分子成分顯著高于SFE組，以α-蒎烯、坎烯以及α-松油醇最顯著，這三種成分都是松節(jié)油的主要成分來(lái)源，現(xiàn)也被用作殺蟲(chóng)劑[13]，也是目前公認(rèn)具有腎毒性的成分。SFE組在50分鐘后提出的大分子成分顯著高于SD組，以正二十一烷，正二十四烷以及2，2-雙(甲基溴)-1，1-聯(lián)苯為代表，這類高沸點(diǎn)的長(zhǎng)鏈烷烴，尤其長(zhǎng)鏈芳香烴對(duì)中樞神經(jīng)有明顯的致毒作用，大劑量甚至引起心跳停止。因此可以初步推斷，影響SFE組的LD50偏小的原因可能與高沸點(diǎn)的長(zhǎng)鏈烷烴有關(guān)。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)從LD50數(shù)值的角度評(píng)價(jià)，根據(jù)物質(zhì)的半數(shù)致死劑量LD50值，美國(guó)科學(xué)院把毒性物質(zhì)危險(xiǎn)劃分為五個(gè)等級(jí)，LD50大于15 g/kg屬于無(wú)毒性，干姜揮發(fā)油屬于無(wú)毒性。

近年來(lái)，針對(duì)多種提取方法應(yīng)用于揮發(fā)油的提取安全性問(wèn)題，已進(jìn)行過(guò)部分品種的研究，例如苦豆子[6]、艾葉[7]、甘草[8]、北豆根[9]、鴉膽子[10]、吳茱萸[11]、細(xì)辛[12]。本文首次對(duì)干姜揮發(fā)油進(jìn)行了提取方法的安全性對(duì)比，并結(jié)合化學(xué)成分進(jìn)行了初步分析。

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Effectofdifferentextractingmethodsonacutetoxicityandchemicalcompositionofrhizomazingiberisvolatileoil

HANRun,XUGuanglin,HUCheng,etal.

CardiovascularDepartmentofShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTCM,Shanghai200021,China

XUDesheng，E-mail:xudes1953@126.com

ObjectiveComparison of supercritical fluid extraction (SFE) and steam distillation (SD) on acute toxicity and chemical composition of ginger volatile oil.MethodThe essential oils were extracted by SFE and SD method respectively. A comparative study was conducted by classical toxicity test. The toxic symptoms, death rate and the change of weight was recorded, LD50and 95% confidence respectively was calculated by Bliss method, chemical constituents of volatile oil were analyzed and compared by gas chromatography mass spectrometry instrument (GC-MS).ResultsMain toxic symptoms of mice were abdominal irritation, shortness of breath and so on. The time of death was concentrated in 8 hours.The LD50of volatile oil extracted by SFE was 6.7174(4.066～8.1078) mL/kg while that was 9.1109(8.1327～10.206) mL/kg of SD, the conversion of crude drug was 223.9 g/kg and 1012.3 g/kg respectively. The chemical composition of volatile oil extracted by the two methods was not completely consistent, and the chemical composition of SFE group was more than the SD group.ConclusionThe extraction of volatile oil of rhizoma zingiberis by SD method has higher safety, the reason is that the chemical composition of volatile oil extracted from SFE is complex.

Rhizoma zingiberis； Volatile oil； Acute toxicity； GC-MS

上海市科委資助項(xiàng)目(12401901400)

200021 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科[韓潤(rùn)(碩士研究生)、徐光臨(博士研究生)、劉力、徐德生]；上海中醫(yī)藥大學(xué)[胡誠(chéng)(碩士研究生)]

韓潤(rùn)(1990- )，女，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：藥物新劑型的研究。E-mail：234123581@qq.com

徐德生(1953- )，博士，博士生導(dǎo)師，主任藥師。研究方向：藥物新劑型的研究。E-mail：xudes1953@126.com

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.09.002

2016-10-29)

(本文編輯： 禹佳)