藍(lán)倫禮 劉夢(mèng)楚 鄒曉紅 曾元兒 曹騁 劉慶飛 李小瑩 江濱

·論著·

腎茶總黃酮的提取純化工藝優(yōu)化

藍(lán)倫禮 劉夢(mèng)楚 鄒曉紅 曾元兒 曹騁 劉慶飛 李小瑩 江濱

目的應(yīng)用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化腎茶提取工藝，運(yùn)用大孔吸附樹脂優(yōu)選腎茶總黃酮的純化工藝。方法以腎茶總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比和提取時(shí)間為考察因素，采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化加熱回流提取工藝，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)考察大孔吸附樹脂對(duì)腎茶總黃酮的純化效果，并研究各因素條件對(duì)其純化效果的影響，篩選主要影響指標(biāo)的最佳工藝條件。結(jié)果腎茶最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為52.52%，液料比(mL∶g)為15∶1，提取時(shí)間為90分鐘。DM-130大孔吸附樹脂較適合腎茶總黃酮的純化，靜態(tài)吸附生藥濃度為0.1 g/mL，藥液pH值為2；動(dòng)態(tài)吸附上樣量為60 mL，吸附時(shí)間為50分鐘，除雜水用量為3倍柱體積，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為3倍樹脂體積。結(jié)論Box-Behnken效應(yīng)面法用于優(yōu)選腎茶的提取工藝是可行的，建立的數(shù)學(xué)模型和實(shí)驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)相符，DM-130大孔吸附樹脂較適合腎茶總黃酮的純化。

腎茶； 總黃酮； Box-Behnken效應(yīng)面法； 大孔吸附樹脂

腎茶為唇形科植物Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C. Y.WuexH.的全草，因其花朵形似貓須，故又名貓須草，是東南亞常見的草藥，廣泛分布于印度東部、泰國、印度尼西亞與澳大利亞等地。中國所產(chǎn)腎茶，主產(chǎn)于廣西、廣東、云南、福建、臺(tái)灣等地。傣醫(yī)藥稱其為“雅娜妙”，據(jù)“貝葉經(jīng)”版傣醫(yī)藥《檔哈雅》記載，傣家人飲用腎茶已有上千年歷史，被歷代醫(yī)家和宮廷尊為“圣茶”[1]。腎茶全草入藥，性涼味甘、淡、微苦，具利尿消炎、抗菌排石、清熱除濕之功，是著名的藥食兩用植物。藥理研究表明，腎茶具有利尿、排尿石、抗炎、抗菌、健腎、改善慢性腎功能衰竭和免疫調(diào)節(jié)作用[2]。

腎茶含有的化學(xué)成分主要為黃酮類、酚酸類、二萜類、甾體皂苷類、烷基糖苷類、木脂素類化合物、蒽醌類、多肽、有機(jī)酸等[3]。

腎茶中的黃酮類成分是一類生物活性較強(qiáng)的成分[4]，其中腎茶的七種甲氧基黃酮作為腺苷A1受體拮抗劑，具有較強(qiáng)的利尿作用，故分離純化腎茶總黃酮的研究需加快，以有助于推動(dòng)腎茶的開發(fā)與應(yīng)用。本試驗(yàn)以腎茶為原料，以乙醇為提取溶劑，采用NaNO2—Al(NO3)3比色法檢測(cè)腎茶中總黃酮的含量，選擇Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化腎茶總黃酮的提取工藝，采用大孔吸附樹脂法對(duì)腎茶乙醇提取物中的總黃酮進(jìn)行純化，優(yōu)化最佳純化工藝，以期為腎茶總黃酮的后期制劑開發(fā)提供一定的參考。

1 材料

1.1 藥物

腎茶，采自云南省西雙版納，批號(hào)20140605，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所西雙版納分所李學(xué)蘭教授鑒定為唇形科腎茶屬腎茶Clerodendranthusspicatus(Thunb.) C. Y. Wu的地上部分。蘆丁對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)131208，純度≥98%)。

1.2 試劑

DM-130大孔吸附樹脂(鄭州勤實(shí)科技有限公司，批號(hào)20140805)。色譜甲醇購自德國默克有限公司，其余化學(xué)試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 儀器

LC-20AT髙效液相色譜儀(日本島津公司)，色譜柱Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司)，L5S型紫外-可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。HH-2K6二列六孔水浴鍋(公益市予華儀器有限責(zé)任公司)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，7C-15套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000(上海亞榮生化儀器廠)，AEG-220型分析天平。

2 方法與結(jié)果

2.1 腎茶乙醇提取物的制備

腎茶藥材，用粉碎機(jī)粉碎，過10目篩，備用。稱取腎茶粉末5 g，置圓底燒瓶中，按設(shè)定的提取條件(乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和提取時(shí)間)進(jìn)行回流提取，提取時(shí)將反應(yīng)容器置于套式恒溫器中，提取結(jié)束后得腎茶提取液，過濾，蒸干，稱重，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算腎茶總黃酮提取率。

2.2 腎茶總黃酮的含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取“2.1”項(xiàng)下蒸干的腎茶提取物1 g置于50 mL容量瓶，甲醇定容，再取10 mL置于25 mL容量瓶，甲醇定容，超聲，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品50 mg，精密測(cè)定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取10 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得蘆丁含量為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL與6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在500 nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值(X)和蘆丁含量(Y)繪制總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=12.566X+0.0249(r=0.9998)，表明對(duì)照品溶液在0.008 mg/mL～0.048 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 樣品黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定 精密稱取腎茶樣品溶液3 mL置于25 mL容量瓶中，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，于波長500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝條件

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，腎茶提取較顯著的影響因素有：乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液料比和提取時(shí)間和提取次數(shù)。數(shù)據(jù)結(jié)果在模型擬合中，由于處理非連續(xù)變量比較困難，提取溫度暫定為微沸，提取次數(shù)為2次，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)各因素進(jìn)行3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因子編碼值、試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。按其選擇的因素和水平進(jìn)行提取，提取液過濾，蒸干，稱重，再取一定量干粉用蒸餾水溶解，定容于25 mL容量瓶，超聲助溶，作為供試品溶液。取供試品溶液適量，其余操作同2.2.4項(xiàng)，測(cè)定供試品中總黃酮含量。

2.3.2 模型擬合及二次回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行效應(yīng)面試驗(yàn)分析，以腎茶總黃酮得率(Y)為效應(yīng)值，3個(gè)參數(shù)(A、B、C)為自變量分別對(duì)各因素(自變量)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合。多元線性的回歸方程為：Y=+34.14+1.44×A+0.098×B+1.12×C(R2=0.4719)；二次回歸模型方程為Y=+34.77+1.44×A+0.098×B+1.12×C+1.26×A×B-0.51×A×C-0.61×B×C-1.71×A2+0.39×B2-0.025×C2(R2=0.8544,P<0.05)，由上述兩個(gè)方程可知，對(duì)于腎茶總黃酮的得率，二次多項(xiàng)式的擬合度優(yōu)于多元線性模型，方差分析結(jié)果表明：擬合得到的回歸方程P<0.05，表示該模型在本試驗(yàn)研究的范圍內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從腎茶總黃酮得率的方差分析結(jié)果可知，在本試驗(yàn)設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)腎茶總黃酮有顯著的影響，二次項(xiàng)中的A2的偏回歸系數(shù)達(dá)顯著性水平P<0.05，較好地反映了腎茶總黃酮與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間的關(guān)系。而交互項(xiàng)AB、AC、BC無顯著影響(P>0.05)，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)值為0.292(P>0.05)，說明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，對(duì)模型是有利的，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。另外，此模型的變異系數(shù)(CV)為3.17%，且在可接受范圍內(nèi)，表明此模型的重復(fù)性較好。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.3 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測(cè) 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，根據(jù)Design-Expert8.05b軟件畫等高曲線及效應(yīng)曲面圖，考察三個(gè)自變量乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比，提取時(shí)間對(duì)腎茶總黃酮得率影響，結(jié)果見圖1～3。

根據(jù)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，腎茶總黃酮得率最優(yōu)值為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為52.52%，液料比(mL∶g)為15∶1，提取時(shí)間為90分鐘，預(yù)測(cè)值為36.78%。

根據(jù)預(yù)測(cè)最優(yōu)條件下，進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表3，總黃酮的平均得率為37.24%，偏差率為(37.24-36.78)/36.78×100%=1.25%，實(shí)際結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值接近，表明所建立的數(shù)學(xué)模型的預(yù)測(cè)性良好，所選工藝條件具有較好的重現(xiàn)性[5]。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)腎茶總黃酮得率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)腎茶總黃酮得率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖3 提取時(shí)間和液料比對(duì)腎茶總黃酮得率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

編號(hào)總黃酮得率(%)平均得率(%)RSD(%)1234536．0337．6138．6937．2935．5737．242．73

2.4 大孔吸附樹脂純化腎茶總黃酮

腎茶經(jīng)過乙醇提取后，即得乙醇粗提物，首先篩選最適宜腎茶總黃酮純化的大孔樹脂類型，并通過單因素試驗(yàn)考察該樹脂對(duì)腎茶總黃酮的最優(yōu)吸附和解吸附條件，確立大孔樹脂純化腎茶總黃酮的最佳純化工藝。

2.4.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取DM-130大孔吸附樹脂適量，濕法裝柱后，于無水乙醇浸泡24小時(shí)后放出浸液，繼續(xù)用95%乙醇沖洗至洗出液加水(1∶5)不出現(xiàn)白色渾濁為止，再用蒸餾水洗至無醇味，取出樹脂，密封保存，備用。

2.4.2 藥液質(zhì)量濃度對(duì)DM-130大孔樹脂吸附的影響 分別量取腎茶醇提物1.03 g、2.06 g、3.09 g、4.12 g、5.15 g、6.18 g溶于50 mL水中(分別相當(dāng)于生藥濃度0.1 g/mL，0.2 g/mL，0.3 g/mL，0.4 g/mL，0.5 g/mL，0.6 g/mL)，配制后，分別置于6個(gè)加有5 g經(jīng)預(yù)處理后的DM-130大孔吸附樹脂的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩器，在25℃條件下，以120 rpm振蕩24小時(shí)。靜態(tài)吸附12小時(shí)后，各吸取上層藥液1 mL測(cè)吸光度，并算出吸附率，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，上樣質(zhì)量濃度是影響吸附純化的重要因素。本次試驗(yàn)中當(dāng)上樣質(zhì)量濃度在0.1 g/mL～0.6 g/mL濃度范圍時(shí)，上樣質(zhì)量濃度越小，吸附率越高，總黃酮被吸附量越大，因此選擇最佳吸附質(zhì)量濃度為0.1 g/mL。

表4 生藥濃度對(duì)吸附的影響

2.4.3 藥液pH值對(duì)DM-130大孔樹脂吸附的影響 稱取經(jīng)預(yù)處理好的樹脂5 g共9份，分別置于250 mL錐形瓶中，精密加入50 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10的藥液，依“2.5.2”項(xiàng)下同法振蕩，靜態(tài)吸附12小時(shí)后，各吸取上層藥液1 mL測(cè)吸光度，并計(jì)算吸附率。結(jié)果pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10時(shí)的吸附率分別為92.51%、90.98%、84.56%、71.99%、70.15%、68.98%、67.89%、61.30%和57.69%，由此可見吸附率隨著pH值得升高逐漸降低，在pH值為2的時(shí)候，吸附率最高，所以選擇把藥液的pH值調(diào)為2。

2.4.4 藥液上樣量的考察 稱取濕樹脂28 g，量得樹脂高10 cm，1 BV=39 mL，濕法裝柱后，加入濃度為0.1 g/mL，pH值為2的藥液，以3 BV/H的流速即約為60滴/min收集洗脫液，每10 mL收集一次，測(cè)量其吸光度并算出總黃酮的含量及泄漏率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知當(dāng)上樣量超過60 mL時(shí)泄漏量增多，故最佳上樣量為60 mL。泄露曲線的繪制如圖4。

圖4 泄漏曲線的繪制

2.4.5 除雜蒸餾水用量的考察 取5根吸附生藥濃度為0.1 g/mL，pH值為2的腎茶藥液至飽和狀態(tài)的DM-130大孔吸附樹脂柱，分別用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV的蒸餾水沖洗，每根柱每1 BV收集洗脫液一份，共收集20份洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的量。結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，吸附后用蒸餾水沖洗對(duì)已經(jīng)吸附的總黃酮有一定的損失，而蒸餾水沖洗的體積越大，損失量就越多，但蒸餾水洗可以除去非黃酮類，提高總黃酮的純度。經(jīng)綜合考慮，沖洗雜質(zhì)用水體積以3 BV為宜。

圖5 洗脫用水量對(duì)腎茶總黃酮含量的影響

2.4.6 洗脫劑濃度的考察 取5根經(jīng)吸附濃度為0.1 g/mL，pH值為2的腎茶藥液至飽和的DM-130大孔樹脂，分別用水洗脫除雜至無色，然后用體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫劑，測(cè)定洗脫劑中總黃酮的量，并算出總黃酮的洗脫率。并取洗脫液過0.45 μm微孔濾膜，取20 μL進(jìn)行HPLC分析。色譜條件為：Unitary C18色譜柱，以甲醇-水(含0.1%甲酸)為流動(dòng)相，梯度洗脫見表5，流速：1 mL/min，柱溫：30℃，檢測(cè)波長：254 nm。結(jié)果見表6、圖6。從上而下分別為：50%乙醇洗脫液，60%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液，80%乙醇洗脫液，90%乙醇洗脫液。

圖6 不同濃度的乙醇洗脫液HPLC圖

由表6和圖6得知：體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇洗脫之后，洗脫劑中總黃酮的含量分別為87.96%、91.00%、96.01%、75.64%和94.71%，可見使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗脫后，洗脫劑中總黃酮含量和總黃酮的洗脫率均最高，由圖6可知，70%乙醇洗脫液的峰面積較大，含量較高，故選擇體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為洗脫劑。

表5 梯度洗脫程序

表6 洗脫劑濃度對(duì)腎茶總黃酮含量的影響

2.4.7 吸附時(shí)間的考察 精密吸取0.1 g/mL，pH值為2的腎茶醇提物溶液60 mL(按泄漏時(shí)上樣量確定)，分別通過5根預(yù)處理好的DM-130樹脂柱后，分別靜置吸附20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘，5根樹脂柱分別用3 BV蒸餾水洗脫至洗脫液無色，再用70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，同“2.2.3”標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起依法測(cè)定吸收度，測(cè)定其總黃酮的量，計(jì)算總黃酮洗脫率，并且按權(quán)重比例計(jì)算(權(quán)重比例=洗脫液中總黃酮含量×0.5+總黃酮洗脫率×0.5)。結(jié)果見表7。由結(jié)果顯示，靜置50分鐘后洗脫液中總黃酮洗脫率最高，靜置時(shí)間過長過短均偏低，這可能與時(shí)間過長解吸困難，時(shí)間過短吸附不完全有關(guān)。根據(jù)權(quán)重比例篩選最優(yōu)吸附時(shí)間，可通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜置50分鐘時(shí)權(quán)重比例最高，故確定最佳吸附時(shí)間為50分鐘。

表7 吸附時(shí)間的對(duì)總黃酮含量的影響

2.4.8 洗脫劑用量的考察 取含生藥濃度為0.1 g/mL，pH值為2的腎茶藥液至飽和的DM-130大孔樹脂，用3 BV的水洗脫除雜，再用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇進(jìn)行洗脫，每0.5 BV收集一份洗脫液，共收集6份，平行操作3根層析柱，測(cè)定其總黃酮的含量及總黃酮的洗脫率。結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫劑的用量高于3BV時(shí)，總黃酮的含量略低，可以認(rèn)為樹脂上吸附的總黃酮已經(jīng)接近洗脫完全。故確定洗脫劑的用量為3BV。

2.4.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 取60 mL生藥濃度為0.1 g/mL、pH值為2的腎茶乙醇提液通過已經(jīng)處理好的DM-130樹脂柱，吸附50分鐘后，先用3 BV的蒸餾水洗脫至無色，再用3 BV的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，即得大孔樹脂純化的腎茶總黃酮，并且計(jì)算總黃酮洗脫率。相同條件的試驗(yàn)重復(fù)5次，原液提取物中總黃酮含量均值為36.37%，純化后總黃酮含量均值達(dá)90.01%，RSD值為3.36%；總黃酮洗脫率均值達(dá)91.75%，RSD值為3.673%?？梢娊?jīng)過DM-130大孔吸附樹脂純化的腎茶總黃酮的含量由原來的36.37%提高到90.01%，故該工藝基本穩(wěn)定可行。

圖7 洗脫劑用量的考察

3 討論

隨著對(duì)腎茶總黃酮研究的深入，發(fā)現(xiàn)其生物活性廣泛，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[6]，對(duì)腎臟系統(tǒng)的相關(guān)疾病有較明顯的防治作用。腎茶總黃酮對(duì)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的帕金森病大鼠模型和細(xì)胞模型具有明顯的保護(hù)作用，其可能的作用機(jī)制與減少抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷相關(guān)。因此優(yōu)化出最佳的腎茶總黃酮提取純化工藝尤為重要。

在多指標(biāo)工藝篩選的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，不同指標(biāo)間通常相互影響，對(duì)某一項(xiàng)指標(biāo)有利的條件但可能不利于另一指標(biāo)，最終選擇條件往往依據(jù)這些指標(biāo)的綜合效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken法考察腎茶總黃酮提取工藝優(yōu)化中3個(gè)指標(biāo)，并成功建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化與預(yù)測(cè)分析，優(yōu)選的制備工藝實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值較好地吻合，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)腎茶總黃酮得率均有顯著性影響，各因素間存在不同程度的交互作用，由結(jié)果可知，Box-Behnken法設(shè)計(jì)的理論值與試驗(yàn)值相差小，采用非線性擬合模型較接近客觀事實(shí)，效應(yīng)面三維圖使因素對(duì)指標(biāo)的影響更為直觀、方便，且試驗(yàn)精度高，避免了傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)法的不足，具有實(shí)驗(yàn)精度高、模型預(yù)測(cè)性好的優(yōu)點(diǎn)[8]，為腎茶總黃酮的提取工藝提供了較為合理的數(shù)據(jù)。

DM-130大孔吸附樹脂純化腎茶總黃酮具有吸附快、解吸率高等特點(diǎn)，DM-130大孔吸附樹脂對(duì)腎茶總黃酮有良好的吸附性能，篩選出最佳純化工藝為：以60 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL、pH值為2的腎茶提取液上DM-130大孔吸附樹脂柱(約28 g)，吸附飽和50分鐘后，用3 BV的蒸餾水洗脫至溶液無色，棄去，再用3BV的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，即得大孔樹脂純化的腎茶總黃酮。在此條件下，用DM-130大孔吸附樹脂純化腎茶總黃酮，腎茶總黃酮的含量由原來的37.24%提高到90.01%。且大孔樹脂可回收再利用，適用于工業(yè)化的大提取，故確定了腎茶總黃酮分離純化的最佳工藝條件。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明了腎茶總黃酮的提取受多因素的影響，選用Box-Behnken法對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比提取時(shí)間等三個(gè)主要變量進(jìn)行了優(yōu)化以獲得最高的提取效率，說明Box-Behnken法是一種有效的和確實(shí)可行的提取腎茶總黃酮的方法。腎茶乙醇提取物經(jīng)DM-130大孔吸附樹脂純化后腎茶總黃酮的純度得到最大提高，對(duì)腎茶總黃酮后期的研究和開發(fā)提供了一些基礎(chǔ)。但大孔樹脂純化總黃酮需要控制的因素較多，需要前期科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和后期精準(zhǔn)的操作。

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OptimizationofextractionandpurificationtechnologyofgeneralflavonefromClerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.

WuLANLunli，LIUMengchu，ZOUXiaohong,etal.

TraditionalChinesemedicineanalysislaboratory，CollegeoftraditionalChinesemedicine，GuangzhouuniversityofChinesemedicineinstitute，Guangzhou，510006

JIANGBin，E-mail：gzjiangbin@hotmail.com

ObjectiveTo optimize extraction- technology of total flavonoids fromClerodendranthusspicatus(Thunb) C.Y.Wu by Box-Behnken design response surface methodology. To establish the purification technology of total flavonoids ofClerodendranthusspicatus.MethodsEthanol content, liquid-solid ratio and extraction time were used to examine the yield of total flavonoids. The Box-Behnken effect surface method was used to optimize the extraction process of heating reflux. The static and dynamic adsorption was used to observe the macroporous adsorption resin purification effect of total flavonoids ofClerodendranthusspicatus. The best purification process conditions were screened out and optimized.ResultsThe best extraction technology：Optimum process parameters were obtained as followings: the ethanol content was 52.52%, liquid-solid ratio was 15∶1, extraction duration was 90 min. DM-130 macroporous adsorption resin was suitable for purification of total flavonoids, The static adsorption concentration was 0.1 g/mL, pH was 2; Loading quantity of sample of dynamic adsorption was 60 mL, the adsorption time was 50 minutes. Water usage of edulcoration was three times as much as column volume; elution solvent was 70% ethanol, elution solvent volume was 3 three times as much as resin volume.ConclusionBox-Behnken design for optimization of extraction technology ofClerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu is feasible, The established mathematical model agrees well with the experimental observations. DM-130 is the best kind of macroporous resin for purification ofClerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu.

Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu; General flavone; Box-Behnken design response surface methodology; Macroporous resin

南藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心專項(xiàng)基金(2011)

510006 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥分析實(shí)驗(yàn)室[藍(lán)倫禮(博士研究生)、劉夢(mèng)楚、鄒曉紅、曾元兒、曹騁、劉慶飛、李小瑩、江濱]

藍(lán)倫禮(1981- )，女，2013級(jí)在讀博士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量分析。E-mail：lanlunli@yeah.net

江濱(1954- )，女，本科，教授。研究方向：中藥質(zhì)量分析。E-mail：gzjiangbin@hotmail.com

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.09.001

2016-09-22)

(本文編輯： 董歷華)