張偉， 王巍杰， 張小樂

(1.華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學(xué) 輕工學(xué)院，河北 唐山 063000)

?

涂片顯微計數(shù)法快速測定發(fā)酵飼料中細菌總數(shù)

張偉1，2， 王巍杰1， 張小樂1

(1.華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學(xué) 輕工學(xué)院，河北 唐山 063000)

發(fā)酵飼料；細菌總數(shù)；快速測定；涂片顯微計數(shù)；隨機區(qū)組設(shè)計

針對血球計數(shù)板不適于計數(shù)個體較小的細菌的情況，研究構(gòu)建了一種涂片顯微計數(shù)法，用于快速測定發(fā)酵飼料中的細菌總數(shù)。樣品稀釋至10-2～10-3后，吸取5 μL稀釋液，與20 μL滅菌生理鹽水均勻混合后涂布于載玻片中央24 mm × 24 mm的正方形區(qū)域內(nèi)，經(jīng)革蘭氏染色后，根據(jù)隨機區(qū)組設(shè)計的5 × 5視野分布進行顯微計數(shù)，最后利用公式計算試樣中的細菌總數(shù)。平行實驗顯示，該法測定飼料中細菌總數(shù)的變異系數(shù)均小于15 %，重現(xiàn)性良好。利用國標(biāo)法對測定結(jié)果進行驗證，結(jié)果，p>0.05，表明2種方法無顯著性差異。該涂片顯微計數(shù)法較國標(biāo)方法更為簡單、快捷，而且經(jīng)革蘭氏染色還可以簡單鑒定菌體的形態(tài)與類型。

發(fā)酵飼料中的菌體種類繁多，大小各異，快速測定飼料中的細菌總數(shù)一直是一個難題。國標(biāo)中規(guī)定的稀釋平板菌落計數(shù)法步驟繁瑣、誤差大、耗時較長[1]；而比濁法、電阻抗法、酶聯(lián)免疫法、酶促生物發(fā)光法等又存在成本高、誤差大、精密度低等問題[2-4]；能夠快速直接測定菌體數(shù)量的血球計數(shù)板法由于設(shè)計原因容易導(dǎo)致油鏡難以聚焦，因此不適于測定體型較小的細菌[5-7]，所以需要根據(jù)飼料樣品的特殊性開發(fā)新的細菌總數(shù)測定方法。為了實現(xiàn)對發(fā)酵飼料中多種復(fù)合菌體細菌總數(shù)的快速測定，同時提高精密度、降低成本，本研究依據(jù)血球計數(shù)板的原理，結(jié)合革蘭氏染色和顯微鏡檢，利用統(tǒng)計學(xué)方法，構(gòu)建了一種涂片顯微計數(shù)法，并利用國標(biāo)法對測定結(jié)果進行了驗證。

1 實驗

1.1 實驗材料

快速革蘭氏染色液，由溫州市康泰生物科技有限公司提供，試劑盒組成R1：結(jié)晶紫染液，R2：革蘭氏碘液，R3：脫色液，R4：復(fù)染液。

EM菌(Effective Microorganisms，EM)，由河南農(nóng)富康生物科技有限責(zé)任公司提供，每克含5×1010個有效活菌。

活化培養(yǎng)基：2.0 %葡萄糖、1.0 %蛋白胨、0.05 %硫酸鎂、0.2 %磷酸二氫鉀、0.05 %酵母浸膏、0.003 %硫酸鐵、0.1 %氯化鈉，pH值7.2。

1.2 實驗儀器

生物顯微鏡，奧林巴斯(深圳)工業(yè)有限公司，CX 21型。

勻質(zhì)器，江蘇金壇市科學(xué)儀器廠，SK-1型。

立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司，BXM-30R型。

超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司，HJ-CJ-2D型。

單道連續(xù)可調(diào)移液器，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司，TopPette型。

1.3 樣品測定過程

(1)發(fā)酵飼料的制備

將EM菌在無菌條件下接種于活化培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min下培養(yǎng)24 h進行活化。將活化的EM菌接種于發(fā)酵飼料的原料中，35 ℃下需氧發(fā)酵72 h。

(2)試樣的梯度稀釋

無菌條件下稱取試樣10 g，轉(zhuǎn)入含有90 mL、0.85 %生理鹽水的三角瓶(三角瓶中含有適量的玻璃珠)，置于勻質(zhì)器上，8 000 r/min處理1 min，經(jīng)充分混勻后，即可獲得10-1的稀釋液。重復(fù)上述操作，進行10倍梯度稀釋，依次獲得等梯度稀釋液[8]。

(3)涂片染色

將蓋玻片置于載玻片中央位置，用玻璃刀沿其四周輕輕劃出24 mm × 24 mm的矩形加樣區(qū)(注意劃線不要留有過深痕跡，避免因毛細作用對加樣后樣品懸液的均勻分散產(chǎn)生影響)。選擇10-2～10-3的稀釋度，分別移取5 μL試樣稀釋液和20 μL滅菌生理鹽水加于潔凈、滅菌的加樣區(qū)，混合均勻后涂布于整個加樣區(qū)，每個稀釋度作3個平行。試樣風(fēng)干后進行革蘭氏染色，然后用油鏡進行顯微鏡鏡檢。

(4)顯微計數(shù)

(1)

(2)

(3)

其中：

φ — FOV的直徑，單位：毫米(mm)；

FN— 視場數(shù)，是指以毫米為單位限定試樣成像范圍的目鏡光闌直徑，(本例中為20 mm)；

X— 物鏡的倍率(本例中為100)；

s— FOV的面積，單位：平方毫米(mm2)；

T— 試樣中的細菌總數(shù)，單位：個/克(毫升)；

d— 稀釋度，待測試樣的稀釋倍數(shù)。

S— 加樣區(qū)面積，單位：平方毫米(mm2)；

V— 菌懸液體積，單位：微升(μL)；

(5)細菌總數(shù)的報告

每一稀釋度使用3個涂片的平均數(shù)，3個涂片所得數(shù)值相互間存在1個及以上數(shù)量級的誤差，則不宜采用該稀釋度的涂片計數(shù)。

選擇25個視野平均數(shù)在10～100之間的涂片作為細菌總數(shù)的測定標(biāo)準(zhǔn)，按公式(3)報告之。若2個稀釋度的視野平均數(shù)均在10～100之間，則按公式(3)分別計算出細菌總數(shù)，然后視兩者之比來決定如何報告，若其比值小于或等于2，報告其平均數(shù)；若大于2則報告其中較小的。若2個稀釋度的視野平均數(shù)均不在10～100之間，則以最接近10或100的視野平均數(shù)，按公式(3)報告之。若2個稀釋度的視野平均數(shù)均遠遠大于100，則應(yīng)取更高稀釋度的樣品進行測試，直至視野平均數(shù)為10～100之間后，按公式(3)報告之。若2個稀釋度的平均細菌總數(shù)均遠遠小于10，則應(yīng)取較低稀釋度的樣品進行測試，直至視野平均數(shù)為10～100之間后，按公式(3)報告之[8]。

報告試樣中的細菌總數(shù)時，采用3位有效數(shù)字乘以10的指數(shù)次方的形式來表示，3位有效數(shù)字后的數(shù)值以四舍五入的方式取舍。

1.4 生理鹽水體積的選擇

按照1.3中(3)的方法進行制樣。移取10-2稀釋度的稀釋液5 μL，滴于載玻片中央24 mm ×24 mm的加樣區(qū)，然后設(shè)計迭代實驗，從250 μL開始，分別加入不同體積的滅菌生理鹽水，利用牙簽將混合液均勻涂布于整個加樣區(qū)，觀察混合液在加樣區(qū)的涂布情況，并以此判斷最佳的生理鹽水體積，平行測定3次，觀察結(jié)果。

1.5 菌懸液稀釋度的選擇

移取10-1～10-5稀釋度的菌懸液各5 μL，分別與20 μL滅菌生理鹽水均勻混合于24 mm × 24 mm的加樣區(qū)，涂片、風(fēng)干、染色后，按照隨機區(qū)組設(shè)計的5 × 5視野分布，利用1.3中的方法，平行3次測定相同發(fā)酵條件的飼料中的細菌總數(shù)。

1.6 視野分布的選擇

依據(jù)隨機區(qū)組設(shè)計的局部控制原則，設(shè)定4 × 4，4 × 5，5 × 4，5 × 5，9 × 4，9 × 5共6組不同的視野分布，示意圖如圖1。利用1.3中方法，平行3次測定相同發(fā)酵條件的飼料中細菌總數(shù)。

圖1 隨機區(qū)組設(shè)計的視野分布

注：每個網(wǎng)格圖均為大小為24 mm × 24 mm的矩形加樣區(qū)，每小格邊長為1 mm。圖中黑點為視野位置。

1.7 實際樣品的測定和驗證試驗

隨機抽取3種不同發(fā)酵條件的飼料樣品，分別用涂片顯微計數(shù)法和國標(biāo)GB-T 13093- 2006 《飼料中細菌總數(shù)的測定》中方法，測定樣品中的細菌總數(shù)。每個樣品平行測定5次，分析涂片顯微計數(shù)法的精密度和重現(xiàn)性，并根據(jù)實驗結(jié)果比較兩種方法的顯著性差異水平。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 生理鹽水體積的確定

生理鹽水的體積直接影響涂層的厚度和菌懸液的涂布情況，體積過大，則混合液涂層過厚，風(fēng)干時間太久，延長了測定時間，甚至還會溢出加樣區(qū)域，影響測定的準(zhǔn)確度；而如果體積過小，則有可能無法使菌懸液完全覆蓋整個加樣區(qū)域，同樣也會影響測定的準(zhǔn)確度。表1是迭代實驗中加入不同體積滅菌生理鹽水后在加樣區(qū)域的涂布情況。從表1可知，當(dāng)生理鹽水體積為20 μL時，菌體懸液可以涂布整個加樣區(qū)，沒有可見溢出或者無法涂滿整個加樣區(qū)的現(xiàn)象，故選擇20 μL的生理鹽水較為適宜。每組待測樣品平行重復(fù)3次，觀察結(jié)果一致。根據(jù)計算，生理鹽水和菌懸液的總體積為25 μL，均勻涂布于加樣區(qū)后的試樣厚度約為43 μm，比較利于稀釋液中的細菌分散成單層，方便后續(xù)觀察和檢測計數(shù)，而且涂層很薄，利于試樣的風(fēng)干。

表1 迭代實驗的結(jié)果

2.2 菌懸液稀釋度的確定

利用不同稀釋度的菌懸液測定細菌總數(shù)時視野中的菌體數(shù)見表2。由表2可知，當(dāng)稀釋度為10-1時，菌體濃度過高，加樣區(qū)細菌菌體堆積，不能單層分散開，視野中的細菌平均數(shù)(MN)過多；當(dāng)稀釋度為10-3及以上時，稀釋度過高，稀釋液中菌體太少，鏡檢計數(shù)誤差較大，實驗結(jié)果不準(zhǔn)確；當(dāng)稀釋度為10-2時，菌體能夠均勻分散成單層，數(shù)量適中，易于觀察，便于計數(shù)，且誤差較低。因此，在本例中，選擇10-2為適宜的稀釋度。需要指出的是，涂片顯微計數(shù)法適用于單位質(zhì)量(或體積)細菌總數(shù)相對較多的試樣 (一般至少為108 個/g)。而發(fā)酵飼料常以EM菌、乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等厭氧或兼性厭氧菌進行固態(tài)發(fā)酵，在人為控制條件下，因其生長所需營養(yǎng)條件簡單，易形成優(yōu)勢群落，且隨著發(fā)酵時間的延長，益生菌的數(shù)量也會隨之增加，所以為了提高本方法的普適性，綜合考慮，一般選擇10-2～10-32個稀釋度進行發(fā)酵飼料中細菌總數(shù)的測定較為適宜。

表2 不同稀釋度菌懸液測得的視野中的菌體數(shù)

根據(jù)1.3中細菌總數(shù)的報告規(guī)則，選擇10-2的細菌平均數(shù)較為合適，由公式(3)計算可得，發(fā)酵飼料樣品中的細菌總數(shù)為1.38 × 1010個/g。

2.3 視野分布的確定

依據(jù)隨機區(qū)組設(shè)計原則設(shè)定的6種不同視野分布測定的視野中細菌的平均數(shù)量見表3。由表3可知，隨機區(qū)組設(shè)計為4 × 4，4 × 5時，分散不均勻，區(qū)組數(shù)少，不具有組內(nèi)同質(zhì)性，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)大，誤差較大，不能代表加樣區(qū)內(nèi)的整體細菌分布。隨機區(qū)組設(shè)計為9 × 4，9 × 5時，能夠完全代表加樣區(qū)細菌總數(shù)，但區(qū)組數(shù)增多，處理量過大，局部控制的效率降低。綜合考慮，當(dāng)隨機區(qū)組設(shè)計為5 × 5時，既能夠代表加樣區(qū)整體的細菌分布，標(biāo)準(zhǔn)差較小，而且數(shù)據(jù)處理量適中，因此，選擇5 × 5隨機區(qū)組設(shè)計，25個視野數(shù)進行顯微計數(shù)較為適宜。

表3 不同視野分布設(shè)計視野中的菌體平均數(shù)

2.4 方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度

為了考察涂片顯微計數(shù)法檢測結(jié)果的重現(xiàn)性、可靠性，分別測定了3種不同發(fā)酵條件的飼料樣品中的細菌總數(shù)，各平行測定5次，結(jié)果見表4。從表4可以看出，4種飼料中細菌總數(shù)測定的變異系數(shù)(C.V./ %)均低于15 %，說明試樣間的測定結(jié)果無明顯差異，方法的重現(xiàn)性較好。與之相比，國標(biāo)法測定的誤差較大，而且步驟繁瑣，耗時較長。

國標(biāo)法測定上述3種飼料中的細菌總數(shù)結(jié)果也列于表4中。分別對表4中2種方法所得的3組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，結(jié)果均為p>0.05，表明本研究所建立的涂片顯微計數(shù)法與國標(biāo)中的稀釋平板菌落計數(shù)法不存在顯著性差異，可以用于發(fā)酵飼料中細菌總數(shù)的測定。

表4 涂片顯微計數(shù)法與國標(biāo)法測定細菌總數(shù)

圖2(a)為飼料A第1組中央?yún)^(qū)域中央視野的鏡檢圖(圖中暗灰色斑點與圖中陽性菌、陰性菌不在同一焦距平面，是載玻片和物鏡上的雜質(zhì))，視野中共出現(xiàn)22個革蘭氏陽性菌(藍圈標(biāo)記)和2個革蘭氏陰性菌(紅圈標(biāo)記)。經(jīng)革蘭氏染色，可以清晰分辨革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，還可簡單觀察細菌的形態(tài)，通過比對標(biāo)準(zhǔn)圖樣，對細菌的鑒定、分離、純化等后續(xù)操作具有一定指導(dǎo)意義。此外，由圖2(a)可知，EM菌經(jīng)發(fā)酵后，微小細菌占據(jù)優(yōu)勢地位，圖中可見最小革蘭氏陽性菌，經(jīng)測算直徑為1 μm左右，相比于血球計數(shù)板法，涂片顯微計數(shù)法可以提高微小細菌的檢出率，提高測定結(jié)果的精確度。圖2(b)為產(chǎn)朊假絲酵母菌革蘭氏染色后的鏡檢圖(也可用美藍染色法)，視野中菌體形態(tài)清晰，均勻分散，說明本方法在測定多種復(fù)合菌種時，還可對常見的酵母菌進行計數(shù)，并為其鑒定提供依據(jù)。

圖2 EM菌發(fā)酵飼料樣品

3 結(jié)論

(1)研究設(shè)計了一種涂片顯微計數(shù)法，用于發(fā)酵飼料中細菌總數(shù)的測定。該方法將一定量適當(dāng)稀釋的試樣涂布于載玻片上特定的加樣區(qū)，經(jīng)革蘭氏染色后直接用油鏡對選定區(qū)域內(nèi)各個視野中的菌體進行計數(shù)，最后根據(jù)公式推算試樣中的細菌總數(shù)。

(2)涂片顯微計數(shù)法具有較高的重現(xiàn)性，且與國標(biāo)法測得的數(shù)據(jù)基本一致，但與國標(biāo)方法相比，可以減小測定誤差，經(jīng)革蘭氏染色，還可以簡單鑒定細菌的形態(tài)與類型。

(3)由于利用油鏡進行觀察，可以直接、實時、快速測定較小的細菌。該方法操作方便、成本低廉、精密度高，無需標(biāo)準(zhǔn)濃度的菌液作對比，通過鏡檢還可以排除雜質(zhì)的干擾，適于測定高濃度、含多種復(fù)合菌體的飼料樣品中的細菌總數(shù)。

[1] 林杰，柯璐，林霖，等. 飼料中沙門氏菌的平板計數(shù)檢測法研究[J]. 中國飼料, 2015,1: 25-26.

[2] 張裕民. 可見分光光度法對3種細菌計數(shù)的研究[J]. 中國藥事, 2015, 29 (10): 1066-1068.

[3] 王祖峰，張建強，龐洪帥，等. 濁度儀法測定單胞藻密度的初步研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34 (11): 714-717.

[4] 劉慧慧. 酶促細菌生物發(fā)光體系的建立及其在細菌總數(shù)檢測方面的應(yīng)用[D]. 青島:中國海洋大學(xué), 2014.

[5] 錢奎梅，劉霞，陳宇煒. 淡水浮游植物計數(shù)與定量方法[J]. 湖泊科學(xué), 2015, 27 (5): 767-775.

[6] 李光澤. 食品微生物檢驗菌落總數(shù)測定方法的效果分析[J]. 中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè), 2016, 13 (1): 134-135.

[7] 曾曉暉，張雅麗，洪素云，等. 一種顯微計數(shù)新方法ADAM-rWBC在成分血殘留白細胞檢測中的應(yīng)用[J]. 臨床輸血與檢驗, 2016, 18 (1): 51-56.

[8] GB/T 13093-2006，飼料中細菌總數(shù)的測定[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

Smear Microscopic Counting Method for Rapid Determination of Total Bacteria in Fermented Feed

ZHANG Wei1,2, WANG Wei-jie1, ZHANG Xiao-le1

(1. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063000, China;2. Qinggong College, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063000, China)

fermented feed; the total number of bacteria; rapid determination; microscopic and counting; randomized block design

Blood cell counter is not suitable for determination of bacteria with tiny size, so a smear microscopic counting method was built for rapid determination of total bacteria in fermented feed in this research. After being diluted to 10-2～10-3through gradient dilution, 5 μL of the sample, mixed with 20 μL of sterile saline evenly, was smeared onto a field (24 × 24 mm2) of the slide, followed by Gram staining and microscopic counting the total bacteria by the randomized block designed distribution of the strain and statistical methods. Parallel experiments showed that the method had a good repeatability with coefficient of variation of less than 15%. The smear microscopic counting method was also verified with standard method and the result (p>0.05) showed no significant difference. Compared with standard method, the smear microscopy counting is simpler and quicker, and is more suitible for the determination of total bacteria in fermented feed. The Gram staining can also help to identify the morphology and type of the bacteria.

2095-2716(2017)01-0114-07

Q93-332

A