袁金海 顧學平 李 濤 李自峰 賈曉莉 魯麗莉 馬麗娟

（甘肅省臨澤縣種子管理局，臨澤 734200）

白菜型冬油菜抗寒性研究進展

袁金海 顧學平 李 濤 李自峰 賈曉莉 魯麗莉 馬麗娟

（甘肅省臨澤縣種子管理局，臨澤 734200）

抗寒性強是白菜型冬油菜能夠在-32℃極端低溫下安全越冬的一個關鍵因素。由于北方寒旱區(qū)冬寒春旱，積溫不夠，一般農(nóng)作物只能一年一熟，土地利用率低。此外，北方地區(qū)冬末春初的沙塵暴和揚沙天氣使得地區(qū)生態(tài)環(huán)境極其脆弱。因此，白菜型冬油菜抗寒品種的成功選育及推廣對提高北方地區(qū)生態(tài)效益和經(jīng)濟效益具有十分重要的意義。文章綜述了白菜型冬油菜抗寒性的最新研究進展，主要包括抗寒性機制研究、提高抗寒性方法及抗寒性育種等情況，以期為從事冬油菜育種工作者提供借鑒。

白菜型冬油菜；抗寒性；抗寒機理

植物抗寒性的形成源于植物長期對寒冷生境條件的適應，是在基因與環(huán)境互作的雙重條件下引起植物體內(nèi)多個信號系統(tǒng)參與抗寒應激的綜合反應過程。寒冷干燥是我國北方地區(qū)冬季典型的氣候特征，每年冬末春初的沙塵暴和揚沙天氣在北方已司空見慣。隨著北方寒旱區(qū)冬油菜成功北移[1]，隴油系列冬油菜品種為西北這片廣袤土地生態(tài)環(huán)境的改善、輪作制度的革新、經(jīng)濟效益的增加帶來了新的希望。十幾年來，伴隨著分子生物學和生物技術的發(fā)展，冬油菜抗寒性機理研究也不斷深入，已經(jīng)在生理生化[2-15]、相關基因克隆[16-24]、相關激素應答[25-30]、蛋白質(zhì)組學[31-37]等方面取得了一定成果，并在此基礎上提出了一系列作為鑒定其抗寒性的綜合指標。但是，冬油菜抗寒機理形成是一個復雜的過程，對于明確其抗寒性的響應模式及關鍵鏈式反應還需進一步深入研究。隨著轉(zhuǎn)錄組學的出現(xiàn)和發(fā)展，想必會為相關研究提供一個新的思路。本文就冬油菜北移工作開展以來所取得的研究成果作以總結(jié)，以期為冬油菜研究工作者提供參考和借鑒。

1 冬油菜抗寒性機制研究

1.1 細胞膜系統(tǒng)、組織含水量及花芽分化與抗寒性 研究發(fā)現(xiàn)：在植物逆境脅迫中，細胞膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化先于細胞其他結(jié)構(gòu)活性的變化，主要表現(xiàn)為細胞膜通透性的改變。蓋玥等[2]研究結(jié)果表明冬油菜隨著溫度的降低，葉片細胞膜透性顯著增加，且強抗寒品種膜透性增幅較小。同時，為了適應低溫脅迫，葉片組織含水量也明顯下降。張朋飛等[10]也指出，低溫脅迫下，冬油菜根部含水量呈“廠”字形變化；而花芽作為植株由營養(yǎng)生長向生殖生長過渡轉(zhuǎn)變的標志，其分化程度可以反映出品種的抗寒性強弱，北方寒旱區(qū)冬油菜花芽分化過程研究結(jié)果表明，與弱抗寒品種相比較，強抗寒品種花芽表現(xiàn)出分化早、分化速度慢的特點。

1.2 植株生育期及細胞酶系統(tǒng)與抗寒性 孫萬倉等[4]認為可以從植物學形態(tài)和生長發(fā)育進程兩方面來判斷冬油菜的抗寒性。強抗寒品種植株在越冬前生長緩慢，作為地上部分的葉片進入枯葉期早，根系發(fā)達，能夠為越冬期貯備大量的有機物，翌年返青時間晚，生長發(fā)育周期長。冬油菜北移（如由天水北移到張掖）后，整個生育期呈“短—長—短”的特點，且產(chǎn)量發(fā)生較大的變化，抗寒性弱的早熟品種產(chǎn)量下降，而抗寒性強的晚熟品種增產(chǎn)顯著[8]。低溫條件下，白菜型冬油菜抗氧化酶活性變化與細胞冰凍狀態(tài)之間的相關性表明[11]，強抗寒品種在冷凍后葉片不產(chǎn)生水漬或水漬較少，其根在凍后受冷害程度較輕，弱抗寒品種則相反。蒲媛媛等[9]、劉自剛等[12]對低溫脅迫下白菜型冬油菜不同抗寒品種的生理特性研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，強抗寒和弱抗寒品種油菜葉片SOD和CAT酶活性、可溶性蛋白含量、MDA含量隨溫度的降低均呈現(xiàn)先升高后下降的變化規(guī)律，且抗寒性強的品種能保持較高低溫SOD、CAT活性、可溶性蛋白含量和較低的MDA含量。武軍艷等[13]研究了冬油菜唯一能夠越冬的根部器官，發(fā)現(xiàn)根部相關的酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗寒性存在相關性，降溫后，各測量指標與越冬率相關性顯著或極顯著，而降溫前，相關性則不顯著。此外，史鵬輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，可以利用同工酶譜帶對冬油菜抗寒性進行鑒定分類，譜帶數(shù)越多且譜帶越寬的品種抗寒性越強。

1.3 光合特性與抗寒性 光合速率作為衡量植物生長發(fā)育狀況的重要指標，能夠直接反映植物受逆境脅迫的程度。植物光合器官對低溫反應靈敏，劉自剛等[12]研究夜間低溫對白菜型冬油菜光合機構(gòu)的影響結(jié)果表明，夜間溫度降至5℃處理7d后，不同抗寒品種氣孔導度、胞間CO2濃度、凈光合速率（Pn）均下降，且弱抗寒品種葉片氣孔大多數(shù)處于半開半閉的狀態(tài)，而強抗寒品種氣孔仍然保持著完全開放的狀態(tài)，其光合速率、根冠比、根部干物質(zhì)積累均顯著高于弱抗寒品種。研究發(fā)現(xiàn)，葉片柵欄組織與海綿組織比例，海綿組織厚度，葉片厚度，葉片上、下表皮厚度，葉片氣孔的密度及大小與植物抗寒性密切相關。許耀照等[15]對冬油菜葉片解剖結(jié)構(gòu)研究指出白菜型冬油菜在冬前低溫條件下無光合午休現(xiàn)象，且Pn變化表現(xiàn)為“單峰”曲線，同時強抗寒品種葉片組織結(jié)構(gòu)（氣孔密度、面積、周長等）變幅較小，光抑制程度較強。低溫條件下，氣孔對大氣濕度和光照反應不敏感，導致植物氣孔密度變小，長度變短，有利于植物在低溫脅迫下維持較高的組織含水量，提高水分利用率。

1.4 植物激素與抗寒性 生產(chǎn)上常采用控制植物生長調(diào)節(jié)劑（植物激素）來提高作物的抗寒性，通過借鑒前人的研究經(jīng)驗，利用植物激素進行抗寒性的研究在冬油菜生產(chǎn)上得到了進一步應用。方彥等[25]冬油菜浸種試驗表明，30mg/L濃度的ABA是冬油菜抗寒性最佳誘導劑。張騰國等[38]認為MAPKK抑制劑能夠通過控制冬油菜光合作用，改變相關酶的表達活性提高植株抗寒能力。劉海卿等[28]通過冬油菜不同葉齡期噴施一定濃度的外源ABA研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的ABA能夠明顯提高冬油菜的越冬率，且在6葉期噴施條件下抗寒性提高最為顯著，進一步豐富了武軍艷等[26]的前期研究結(jié)果。隨著研究的深入，最終確定了冬油菜葉片最佳的外源ABA噴施濃度為20mg/L[27]。陳奇等[30]在自然降溫過程中測定了冬油菜6個溫度（25℃、12℃、8℃、3℃、-1℃、-4℃）梯度下內(nèi)源激素ABA、GA3、IAA、ZR含量及其比值的變化，試驗結(jié)果表明：較高的ABA含量和較低的GA3、IAA、ZR含量能夠促進冬油菜抗寒性的形成，進而提高其抗寒能力。

1.5 抗寒相關基因與抗寒性 曾秀存等[16-18]研究發(fā)現(xiàn)，白菜型冬油菜的抗寒性的增強，主要受APX基因、Fe-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因的調(diào)控表達。半定量RT-PCR及酶活性分析表明，APX基因、Fe-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因的表達量伴隨著低溫程度的逐級加劇，均呈“上升—下降—上升”的趨勢，與實際生產(chǎn)中田間冬油菜的生長習性相吻合，說明APX基因、Fe-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因?qū)儆诘蜏卣T導表達的抗逆基因。張騰國等[19-22]利用RACE技術從隴油6號中分別克隆了BnICE1、BnMKK4、CBF、COR、BnMKK2、BnMPK6 和MKK2基因，實時熒光定量表明BnICE1的轉(zhuǎn)錄受到低溫脅迫誘導，在油菜抵御寒冷等環(huán)境脅迫的過程中發(fā)揮作用。馬驪等[23]研究發(fā)現(xiàn)白菜型冬油菜BnCOR25、BnICE1和Cu/Zn-SOD基因在低溫下被誘導表達，其相對表達量隨溫度的降低均上升，且均在-4℃時到達峰值。后來本課題組利用雙向電泳對分離出的類甜蛋白進行了基因克隆和表達分析[24]，其結(jié)果與曾秀存等[16-18]抗寒性分析試驗結(jié)果相同。

1.6 抗寒相關蛋白與抗寒性 當植物遭受不良環(huán)境的脅迫時，作為植物體的第一道天然屏障——質(zhì)外體，為了響應逆境脅迫，從而激發(fā)質(zhì)外體信號系統(tǒng)的表達，以此來抵御相關的外來脅迫。袁金海等[33]對冬油菜質(zhì)外體蛋白的提取方法進行了探究，在保證高提取率和低污染率的情況下明確了適合冬油菜質(zhì)外體蛋白的提取方法，為進一步研究抗寒相關蛋白奠定了基礎。

抗凍蛋白（AFPs）是一類具有抑制胞內(nèi)冰晶形成且對已經(jīng)形成的冰晶具有抑制其體積繼續(xù)增大的抗凍活性物質(zhì)。1992年，M.Griffith等[39]第一次從經(jīng)低溫鍛煉的冬黑麥葉片質(zhì)外體中得到并部分純化了AFPs，開啟了植物抗凍蛋白的研究。受前人研究的啟發(fā)，史鵬輝[31]從冬油菜隴油6號的葉片及根部提取了質(zhì)外體蛋白，電泳結(jié)果表明在33～45kD之間出現(xiàn)了一條特異性條帶，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定為β-1，3-葡聚糖酶，該酶在冬黑麥中已被證明為抗凍蛋白，具有冰晶修飾活性。楊剛等[32]對經(jīng)過冷馴化的隴油6號葉片和根部質(zhì)外體蛋白提取液進行活性分析發(fā)現(xiàn)，冷馴化后其提取液具有極強的冰晶抑制活性。劉自剛等[34]比較了-20℃條件貯存的經(jīng)過低溫處理的隴油7號葉片質(zhì)外體蛋白提取液冰晶形態(tài)，再次證明和豐富了課題組先前的研究結(jié)果，向更加精準地明確冬油菜的抗寒機理邁進了可喜的一步。

目前，雙向電泳技術作為蛋白質(zhì)組學研究的首選技術，在研究作物抗逆性差異蛋白質(zhì)的分析及鑒定中越來越受到研究者的青睞。陳奇等[35]在蒲媛媛[36]的研究基礎上首次對適合于冬油菜雙向電泳技術進行了優(yōu)化，并且分離出了白菜型冬油菜隴油7號響應低溫脅迫的關鍵蛋白——類甜蛋白。袁金海等[37]模擬我國北方初春顯著的倒春寒現(xiàn)象，利用雙向電泳技術成功分離出了雙半胱氨酸型氧化還原蛋白酶過氧化物酶（2-Cysperoxiredoxin），為進一步明確冬油菜響應反復低溫脅迫與恢復的氣候條件機理提供了理論基礎。

通過以上研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，白菜型冬油菜響應抗寒機制模式如下（圖1）。

2 冬油菜抗寒性提高方法與措施

圖1 白菜型冬油菜響應抗寒機制模式

目前，隨著一系列超強抗寒品種的成功選育，以隴油6號、隴油7號為典型代表的品種得到大范圍的應用和推廣，研究表明，可以通過采用覆蓋處理、改變施肥方式、調(diào)整播期、控制群體密度、激素浸種、化學誘變劑處理、葉面噴施激素等提高冬油菜的越冬率和抗寒性。孫萬倉等[3]研究發(fā)現(xiàn)，甘肅中部、北部露地栽培的冬油菜越冬率為77%，通過不同覆蓋方式處理，其越冬率較露地提高1.3%～19.0%，且覆蓋效果表現(xiàn)為地膜覆蓋＞秸稈覆蓋＞農(nóng)家肥+土覆蓋＞農(nóng)家肥覆蓋，說明覆蓋處理對冬油菜具有良好的保墑防凍作用。曾軍等[5]研究結(jié)果表明，科學合理的施肥方式能夠最大限度的保證冬油菜安全越冬，冬前施種肥、冬前追肥以及冬前施種肥和冬前追肥的施肥方式對冬油菜的生長發(fā)育有著顯著的影響，通過不同的施肥方式處理，冬油菜的越冬率可提高2～3個百分點。春化對冬油菜花芽分化有著顯著的影響，這主要表現(xiàn)在適宜播期的確定，燕妮等[6]認為，適期早播可提高冬油菜的越冬率，主要原因為不同播期導致冬油菜的苗齡不同，進而影響其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和細胞保護性酶活性等生理生化特性的變化程度不同。葉劍等[7]指出，合理的種植密度能夠提高冬油菜的壯苗率，有利于其安全越冬，在種植密度為60萬株/hm2的情況下越冬率為89%，當種植密度擴大1倍（120萬株/hm2）時，其越冬率反而降為80%，由此可見，合理的種植密度也是提高冬油菜越冬率的關鍵技術之一。方彥等[25]研究了不同濃度ABA浸種對冬油菜抗寒性的誘導效應，試驗結(jié)果表明冬油菜抗寒性的提高主要借助于ABA能誘導細胞保護酶活性的變化，進而通過酶系統(tǒng)的連鎖反應來減輕低溫對細胞的傷害程度?；瘜W誘變劑在提高作物抗逆性方面已得到了大量的應用，課題組發(fā)現(xiàn)，一定體積分數(shù)的EMS誘變劑能提高細胞膜保護酶活性，酶活性越高消除氧自由基的能力越強，從而提高冬油菜對低溫的耐受能力[40]。武軍艷等[26-27]、劉海卿等[28-29]對利用葉面噴施激素提高冬油菜抗寒性技術進行了多年研究，表明外源ABA能夠顯著提高細胞保護酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理生化物質(zhì)含量，緩解零下低溫對冬油菜的凍害；郭仁迪等[41]在此基礎上，研制出了適宜于提高冬油菜抗寒性的新型抗寒復合劑（20mg/L ABA+300mg/L PEG-6000+50mg/L PP333），其對冬油菜越冬率較對照提高18.87個百分點，產(chǎn)量和經(jīng)濟系數(shù)增加顯著。

3 抗寒性育種成就

選擇更寒冷的生態(tài)環(huán)境和抗寒性強的基因型進行輪回選擇是改良北方冬油菜抗寒性的有效途徑[42]，目前，生產(chǎn)上應用和推廣的抗寒豐產(chǎn)良種隴油系列品種都是通過輪回選擇育成的。植物的抗寒性是由多基因控制下的數(shù)量性狀不斷累積并逐漸提高，孫萬倉科研團隊成功培育的隴油6號、隴油7號等隴油系列超強抗寒品種可耐-32℃，其抗寒性已達到國際領先水平。隴油6號等抗寒品種的選育，把我國冬油菜種植范圍由35°N向北推至40°N～48°N，向北推移了5～13個緯度，打破了業(yè)內(nèi)人士關于我國原有冬春油菜產(chǎn)區(qū)呈似“廠”型的分界線，對我國油菜產(chǎn)區(qū)進行了重新區(qū)劃。楊建勝等[40]研究了經(jīng)EMS處理的隴油7號種子，其生育期各項生理指標表明EMS能夠提高冬油菜的抗寒性?？购缡炱贩N隴油9號的選育更大程度地滿足了我國北方一年多熟的耕作制度。今天，在國家“一帶一路”偉大戰(zhàn)略背景下，在以“生態(tài)文明”為時代主題的號召下，冬油菜種植和推廣將會帶來更加顯著的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益。

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2017-09-13）