王 淵，劉智斌，牛文民，王 強(qiáng)，李 杰，魯 剛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

嗅三針對阿爾茨海默病小鼠海馬區(qū)磷酸化P38MAPK和TNF-α表達(dá)的影響*

王 淵，劉智斌△，牛文民，王 強(qiáng)，李 杰，魯 剛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

目的：觀察嗅三針對阿爾茨海默病(AD)小鼠海馬磷酸化P38MAPK和TNF-α表達(dá)的影響，以闡明其基于嗅覺通路治療AD的作用機(jī)制。方法：將40只AD小鼠隨機(jī)分為模型組、嗅神經(jīng)切斷嗅三針組、嗅三針組、鹽酸多奈哌齊組，每組10只，另取10只同窩的陰性小鼠作為正常對照組。通過嗅三針對印堂穴和雙側(cè)迎香穴行電針刺激，每次10 min，以3 mg(kg·d)的劑量對鹽酸多奈哌齊組AD小鼠進(jìn)行灌胃，每周干預(yù)5次，間歇2 d，共干預(yù)4周。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測海馬p-p38MAPK蛋白，免疫組化法檢測TNF-α表達(dá)水平。結(jié)果：嗅三針刺激和鹽酸多奈哌齊灌胃能夠顯著降低海馬p-p38MAPK蛋白和TNF-α的表達(dá)，與AD模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05)。嗅神經(jīng)切斷嗅三針組對AD小鼠海馬p-p38MAPK蛋白和TNF-α的表達(dá)均無明顯影響，與AD模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，嗅三針組與鹽酸多奈哌齊組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：嗅三針具有調(diào)控P38MAPK通路，降低AD小鼠海馬炎癥因子TNF-α表達(dá)的作用，嗅覺通路的完整性可能是其發(fā)揮干預(yù)效應(yīng)的核心機(jī)制。

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以認(rèn)知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。現(xiàn)代研究表明，β-淀粉樣蛋白沉積，繼而激活小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG)，處于持續(xù)活化的狀態(tài)MG不斷地產(chǎn)生各種神經(jīng)毒性物質(zhì)和如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等致炎性因子，持續(xù)對于神經(jīng)產(chǎn)生泛化式損傷，MG又可以被受損的神經(jīng)元和神經(jīng)毒性物質(zhì)所激活引發(fā)神經(jīng)毒性循環(huán)鏈的產(chǎn)生，加速AD的發(fā)展[1-2]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)在MG的分化增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用，其中P38MAPK是MAPK家族中經(jīng)典的亞族通路之一[3-4]。多年以來，本研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用“嗅三針”療法治療AD，療效確切且優(yōu)勢明顯。本研究擬觀察嗅三針對保留和切斷嗅覺通路的AD小鼠海馬磷酸化P38MAPK和炎癥因子TNF-α表達(dá)的影響，為嗅三針治療AD提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 實(shí)驗(yàn)動物購自南京大學(xué)模式動物研究所為批號：SCXK(寧)2016-003，體重(35.8±4.22)g，7個月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(AD模型小鼠)40只，隨機(jī)分為4組，分別是AD模型組(model)、嗅三針組(XSZ)、嗅三針+嗅神經(jīng)切斷組(XSZ+XSJ)和鹽酸多奈哌齊組(Donepezil)，每組10只，并同窩陰性小鼠10只作為正常對照組(sham)。嗅三針組以嗅三針電刺激對其進(jìn)行干預(yù)；嗅三針+嗅神經(jīng)切斷組在切斷AD小鼠嗅神經(jīng)后對其進(jìn)行嗅三針電刺激；鹽酸多奈哌齊組以3 mg(kg·d)的鹽酸多奈哌齊組對其進(jìn)行灌胃；對模型組和正常組小鼠于每天同一時間進(jìn)行相同程度的抓取，不做任何干預(yù)；以上干預(yù)方式對于各組小鼠均為1次/d，1個療程為5 d，間歇2 d，共進(jìn)行4個療程。

2 主要試劑與儀器 抗TNF-α多克隆抗體(美國Neo-Markers公司)；兔抗鼠p-p38MAPK抗體(Santa Cruz公司)；兔抗鼠GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)； HANS-200A型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，JD801圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技公司)；華佗針灸針(規(guī)格0.25×13 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

3 嗅神經(jīng)切斷術(shù) 采用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)將AD小鼠進(jìn)行麻醉，用腦立體定位儀將其固定，切開小鼠顱頂正中的皮膚并將其前囟小范圍分離暴露，分別于鼻額縫、矢狀靜脈竇和眼眶上內(nèi)側(cè)緣之間，鉆兩個小孔深度至暴露嗅球，直徑均為1 mm，以不使嗅球損傷為度，對于嗅球前端的硬腦膜，應(yīng)用顯微解剖鑷將其提起，對于嗅神經(jīng)采用銳性切斷術(shù)，盡量避免使嗅球受到損傷，采用明膠海綿對相應(yīng)部位進(jìn)行壓迫止血，將青、鏈霉素點(diǎn)于傷口處，最后對傷口進(jìn)行縫合[5]。

4 嗅三針干預(yù)方法 嗅三針干預(yù)穴位取雙側(cè)迎香穴及印堂穴。迎香穴定位：小鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處；印堂穴定位：小鼠兩眼眶上緣中點(diǎn)連線與正中線交點(diǎn)[6]。操作方法：迎香穴向內(nèi)上方斜刺2 mm，印堂穴向鼻根部平刺2 mm；正極接印堂穴，負(fù)極接一側(cè)迎香穴，刺激10 min；負(fù)極換接另測迎香穴，刺激10 min。刺激參數(shù)：疏密波，頻率為2/15 HZ，強(qiáng)度為1 mA。

5 免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測小鼠海馬區(qū)p-p38MAPK表達(dá) 干預(yù)結(jié)束后，采用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)將小鼠進(jìn)行麻醉，將其海馬組織快速取出并置于EP管，迅速放入液氮后，置于-80℃冰箱進(jìn)行保存。WB檢測步驟如下：將等量大小的海馬樣本剪取后放置于EP管中，再將RIPA蛋白裂解液(等體積預(yù)冷)加入每份樣本之中，采用超聲破碎儀對其研磨，接著在4℃的條件下采用1500 r/min的轉(zhuǎn)速的高速冷凍離心機(jī)對其進(jìn)行離心。對于各樣本蛋白濃度采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行測定，將目標(biāo)蛋白上樣并電泳1 h后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上并進(jìn)行封閉，之后將一抗兔抗鼠p-p38MAPK(1∶100)加入其中，在4℃的條件下孵育過夜，然后經(jīng)二抗HRP-羊抗兔IgG(1∶100)，常溫下孵育1 h，并進(jìn)行TBST洗滌，顯影采用ECL試劑盒，時間為5 min，將目標(biāo)蛋白曝光完畢后，對于目標(biāo)條帶灰度值的計(jì)算采用凝膠成像分析系統(tǒng)。

6 免疫組化法檢測小鼠海馬區(qū)TNF-α的表達(dá) 操作步驟參照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。隨機(jī)觀察每張切片中5個高倍視野下的海馬區(qū)域，采用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對視野進(jìn)行TNF-α灰度值測定并記錄相應(yīng)結(jié)果。

結(jié) 果

1 嗅三針對AD模型小鼠海馬p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平的影響 通過對小鼠海馬區(qū)p-p38MAPK蛋白的檢測，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，我們發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組表達(dá)顯著增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與模型組比較，嗅三針組表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，嗅三針+嗅神經(jīng)切斷組的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；嗅三針組與鹽酸多奈哌齊組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖1，表1。

圖1 各組小鼠海馬p-p38MAPK蛋白表達(dá)的比較

表1 各組小鼠海馬p-p38MAPK蛋白表達(dá)的比較

2 嗅三針對AD模型小鼠海馬內(nèi)TNF-α表達(dá)水平的影響 通過對小鼠海馬區(qū)TNF-α表達(dá)的檢測，經(jīng)圖像分析測試，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α均表達(dá)于各組小鼠海馬中。對于的TNF-α表達(dá)，與正常組比較，TNF-α平均灰度值在模型組中表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低(P<0.01)，表明模型組海馬TNF-α呈強(qiáng)陽性表達(dá)；與模型組比較，嗅三針組表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，嗅三針+嗅神經(jīng)切斷組表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組表達(dá)顯著降低(P<0.05)；嗅三針組與鹽酸多奈哌齊組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表2 各組小鼠海馬內(nèi)TNF-α平均灰度值的比較

討 論

嗅覺系統(tǒng)的中樞神經(jīng)位于大腦的梨狀區(qū)皮質(zhì)區(qū)域、杏仁核和顳葉，這與AD早期病變的發(fā)病區(qū)域重合率較高，具有明顯的相關(guān)性，AD早期的主要臨床癥狀以嗅覺功能障礙持續(xù)時間最長，目前尚未有終止或逆轉(zhuǎn)AD發(fā)病進(jìn)程的藥物，故盡早確診病例、對癥治療、延緩病情進(jìn)展是目前治療AD關(guān)注的焦點(diǎn)[7-8]。因此，如能在AD早期對嗅覺功能障礙進(jìn)行干預(yù)，將有可能延緩AD發(fā)病進(jìn)程。多年來，本研究團(tuán)隊(duì)一直致力于針刺治療AD的臨床及基礎(chǔ)研究，在臨床取得良好療效。同時，在針刺干預(yù)神經(jīng)退行性疾病引起的嗅覺功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究(國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目NO.30973792、NO.81674086)中也證實(shí)，“嗅三針”療法(雙側(cè)迎香和印堂三穴，其主治均與嗅覺系統(tǒng)密切相關(guān))可以通過嗅覺通路對神經(jīng)退行性病變有良好的干預(yù)效應(yīng)。鑒于此，為了進(jìn)一步明確嗅三針對AD的調(diào)控機(jī)制，本研究擬通過切斷和保留嗅覺通路，觀察嗅三針對AD小鼠海馬磷酸化P38MAPK和TNF-α表達(dá)的影響。

研究表明，MAPK途徑與AD中Aβ的沉積密切相關(guān)，Aβ的沉積后MAPK激活，直接誘導(dǎo)MG活化[9-10]。此外，活化的MAPK還高效誘導(dǎo)多種炎癥因子(IL-1β、TNF-α等)表達(dá)，這些因子又是MAPK的刺激劑，以正反饋機(jī)制進(jìn)一步活化MAPK，使炎癥反應(yīng)被持續(xù)放大[11-12]。同時，這些炎癥因子能顯著促進(jìn)MG活化，而MAPK是它們誘導(dǎo)MG活化的主要效應(yīng)通道[13-14]。P38MAPK是MAPK家族三條經(jīng)典的亞族通路之一，可由多種因素所激活并產(chǎn)生炎性介質(zhì)，級聯(lián)式的促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[15]。Aβ刺激MG產(chǎn)生TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，而TNF-α能夠通過非依賴方式分別激活p38MAPK通路，從而誘導(dǎo)MG活化，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的泛化和持續(xù)，故抑制p38MAPK通路的激活，降低MG激活引發(fā)的炎性反應(yīng)，是治療AD的至關(guān)重要的途徑之一。本研究發(fā)現(xiàn)，嗅三針干預(yù)AD小鼠的可能機(jī)制之一是通過降低p-p38MAPK表達(dá)抑制TNF-α的釋放，減輕炎癥反應(yīng)的泛化和持續(xù)，而在嗅神經(jīng)切斷后，干預(yù)效應(yīng)不顯現(xiàn)。

綜上所述，“嗅三針”的取穴定位完全基于中醫(yī)藥理論，鼻為嗅覺器官，嗅三針均臨近鼻部，符合局部取穴原則，從現(xiàn)代解剖學(xué)角度來看，“嗅三針”通過血管、神經(jīng)途徑與嗅覺系統(tǒng)有密切關(guān)系。我們認(rèn)為“嗅三針”基于嗅覺通路的完整性，能夠降低AD小鼠海馬磷酸化P38MAPK表達(dá)并發(fā)揮對炎癥因子TNF-α抑制效應(yīng)，這可能是嗅三針干預(yù)AD小鼠的機(jī)制之一，進(jìn)一步證明嗅神經(jīng)是 “嗅三針”發(fā)揮作用的神經(jīng)通路。

[1] Zhu M,Wang X,Schultzberg M,etal.Differential regulation of resolution in inflammation induced by amyloid-β42 and lipopolysaccharides in humanmicroglia[J].J Alzheimers Dis,2015,43(4):2137-1250.

[2] 蔡亞梅,沈躍玲.小膠質(zhì)細(xì)胞在阿爾茨海默病中的免疫損傷和神經(jīng)保護(hù)作用[J],醫(yī)學(xué)綜述,2010,16(14):2013-2015.

[3] 李慧源,董玉霞，姜 源.小膠質(zhì)細(xì)胞與阿爾茨海默病炎性反應(yīng)的相關(guān)研究[J].中國臨床研究,2015,28(1):129-133.

[4] 方劍喬,朱書秀,張 英,等. 電針對阿爾茨海默病模型大鼠額葉與海馬區(qū)磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶和白介素-1βmRNA的影響[J].針刺研究,2013,38(1):35-38.

[5] 羨 慕,魏永祥,韓德民,等. 嗅神經(jīng)切斷對小鼠嗅感覺神經(jīng)元的影響[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科,2005,40(9):671-674.

[6] 李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M] .北京:中國中醫(yī)藥出版社, 2003 :327 -329 .

[7] 董立麗,劉百巍,解 影.阿爾茨海默病(AD)患者嗅覺障礙的研究分析[J].中國醫(yī)藥指南,2017,15(22):130-131.

[8] 段 娟,曹文宇,王雪琴，等.大鼠同性別社會交往引起主嗅覺系統(tǒng)相關(guān)腦區(qū)pERK1/2表達(dá)變化[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2014,30(1):88-90.

[9] Feld M1,Krawczyk MC,Sol Fusti ana M et al.Decrease of ERK/MAPK overactivation in prefrontal cortex reverses early memory deficit in a mouse model ofAlzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis，2014,40(1):69-82.

[10] 王 青,羅彥彰,林修賢，等.支原體污染經(jīng) p38 MAPK 途徑降低人類細(xì)胞株28S 和18SRNC-rRNA[J].中國病理生理雜志,2015,30(5):697-700.

[11] Ando K,Uemura K,Kuzuya A,et al.N-cadherin regulates p38 MAPK signaling via association with JNK-associated leucine zipper protein: implications for neurodegeneration in Alzheimer disease[J].J Biol Chem,2011,286(6):7619-7628.

[12] 竇忠霞,張曉梅.MAPK途徑在病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2015,15(12):2471-2475.

[13] 吳海歌,高 征，羅福文.小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)與神經(jīng)炎癥相關(guān)的信號通路[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2014,34(6):501-505.

[14] Ishii N.Progress of research and development of MAPK pathway inhibitors[J].Nihon Yakurigaku Zasshi，2013,141(1):15-21.

[15] 黃德弘,劉孟淵,閆小峰. 加味當(dāng)歸芍藥散對纖絲狀A(yù)β42誘導(dǎo)腦內(nèi)炎癥因子及磷酸化MAPK 信號分子表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(2):143-148.

InfluenceofXiusanzhenonexpressionofphosphorylatedP38MARKandTNF-αinhippocamusofmicewithalzheimer’sdisease

Wang Yuan, Liu Zhibin,Niu Wenmin,et al.

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Objecticve：To observe the intervening effect of Xiusanzhen Electroacupuncture(EA) on phosphorylation of P38MAPK and TNF-α expression in hippocampus of mice with Alzheimer’s disease(AD), in order to clarify its therapeutic mechanism based on the olfactory nerve pathway in alleviating AD. Methods: 40 AD mice were randomly devided into 4 groups: AD model group, Xiusanzhen EA with olfactory nerve transected group (ONT+EA), Xiusanzhen EA group, Donepezil HCl group, with 10 mice respectively in each group, then took 10 negative mice as normal control group. Electroacupuncture intervention of Xiusanzhen was applied to stimulate bilateral LI 20 and EX-HN3 for 10min per time, intragastric administration of donepezil HCI in AD mice was performed at the dose of 3mg(kg·d),once daily intervention (except weekends) for 4 weeks in all. Western blot technique was applied to detect p-p38MAPK protein expression in hippocampus, immunohistochemical method was used to detect the expression level of TNF-α in hippocampus . Results Compared with AD model group, Xiusanzhen EA group Donepezil HCl group could reduce p-p38MAPK protein and TNF-α expression in hippocampus of AD mice, there were significant differences between the two groups (P<0.05).There were no significant differences were found between AD model and ONT+EA groups in influencing p-p38MAPK protein and TNF-α expression in hippocampus of AD mice (P>0.05). There were no significant difference between Xiusanzhen EA group and donepezil HCL group (P>0.05). Conclusion:Xiusanzhen EA can regulate expression of TNF-α through p38MAPK signaling pathway,the integrity of the olfactory pathway is the core mechanism of the intervention effect.

Alzheimer disease/acupuncture-moxibustion @Xiusanzhen Animal experimentation Mice

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81503667) 陜西中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)培育科研基金(2015PY07)

△通訊作者

阿爾茨海默病/針灸療法 @嗅三針 動物實(shí)驗(yàn) 小鼠

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.12.063

(收稿：2017-08-22)