惠人杰，馮靜，藺默含，馮柏年，2#（.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫2422；2.江蘇艾凡生物醫(yī)藥有限公司，江蘇無(wú)錫2422）

多指標(biāo)-正交試驗(yàn)優(yōu)化沙棘葉和沙棘籽中黃酮的提取工藝Δ

惠人杰1＊，馮靜1，藺默含1，馮柏年1，2#（1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.江蘇艾凡生物醫(yī)藥有限公司，江蘇無(wú)錫214122）

目的：優(yōu)化沙棘葉和沙棘籽中黃酮的提取工藝。方法：以6種黃酮苷元即兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的提取率總和為指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為考察因素，采用L9（34）表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，分別優(yōu)化沙棘葉和沙棘籽中黃酮的提取工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：沙棘葉中黃酮的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取3次、每次提取2.0 h、料液比1∶16；沙棘籽中黃酮的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取3次、每次提取1.5 h、料液比1∶24；驗(yàn)證試驗(yàn)中，沙棘葉和沙棘籽中6種黃酮苷元的提取率總和分別為56.4、15.4 mg/g（RSD分別為1.4%、3.4%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化后的提取工藝方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行，可用于沙棘葉和沙棘籽中黃酮成分的提取。

沙棘葉；沙棘籽；正交試驗(yàn)；提取工藝；黃酮苷元

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）為胡頹子科酸刺屬的灌木或小喬木，別名醋柳[1]，具有多種營(yíng)養(yǎng)保健作用，可作為營(yíng)養(yǎng)食品、藥物和護(hù)膚品[2]。沙棘黃酮是沙棘中的重要活性物質(zhì)，具有抗心肌缺血[3]、降糖[4]、抗腫瘤[5]、抗菌[6]、消炎[7]等作用。自1977年起，沙棘便被列入了《中國(guó)藥典》，此后在歷版藥典中均有記載[8]。除了被廣泛關(guān)注的沙棘果之外，沙棘葉、沙棘籽等沙棘的其他部位也富含多種黃酮成分，具有相當(dāng)高的藥用價(jià)值[9]。深入開發(fā)沙棘葉和沙棘籽的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，尤其是其藥用價(jià)值，需要對(duì)沙棘的藥用成分進(jìn)行更為精準(zhǔn)有效的提取分析。在現(xiàn)有的沙棘黃酮提取工藝研究中，多以總黃酮為單一考察指標(biāo)對(duì)提取方法的效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，不僅缺乏針對(duì)單一黃酮成分的分析及提取工藝研究，也缺乏針對(duì)不同提取部位的工藝優(yōu)化。本研究以沙棘葉和沙棘籽為樣本，以沙棘中6種主要黃酮苷元的提取率總和為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化其活性成分的提取工藝。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；ACM-L超細(xì)粉碎機(jī)（青島微納粉體機(jī)械有限公司）；DZF-08真空干燥箱（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DT-200B電子天平（常熟市佳衡天平儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；BSA124S精密電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；LyoQuest-85真空凍干機(jī)（西班牙泰事達(dá)科技有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；PURIST UV超純水系統(tǒng)（上海樂楓生物科技有限公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

沙棘葉、沙棘籽（新疆金之源生物科技有限責(zé)任公司，采摘日期為2016年4月，鑒定人為無(wú)錫市藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心副主任中藥師金卓）；兒茶素（批號(hào)：H1603040，純度：＞98%）、楊梅素（批號(hào)：L1623059，純度：＞98%）、山柰酚（批號(hào)：B1704013，純度：＞98%）、異鼠李素（批號(hào)：K1624002，純度：＞98%）對(duì)照品均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；槲皮素（批號(hào)：LI40Q05，純度：＞98%）、蘆?。ㄅ?hào)：LTC0Q20，純度：＞98%）對(duì)照品均購(gòu)自百靈威科技有限公司；乙醇、石油醚、磷酸、鹽酸均為分析純，甲酸、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 沙棘黃酮醇提物制備

沙棘葉、沙棘籽去雜后，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后烘干，以料液比1∶8（g/mL）加入石油醚，70℃加熱回流2 h，過(guò)濾后棄濾液，剩余濾渣揮干石油醚，得脫脂脫水沙棘葉、沙棘籽樣品。精密稱定10 g樣品，以50%乙醇回流提取1 h，回收乙醇，干燥至無(wú)醇味，殘留物凍干至呈粉末狀。

2.26 種黃酮苷元含量測(cè)定及方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 供試品溶液制備精密稱取“2.1”項(xiàng)沙棘黃酮粉末50 mg，加入20 mL甲醇，混合均勻后加入20 mL 25%鹽酸溶液，以氮?dú)獗Ｗo(hù)，90℃下加熱回流1 h，待溶液冷卻至室溫后，過(guò)濾。將續(xù)濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，搖勻，用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備分別精密稱取兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對(duì)照品各5.0 mg，混合均勻后，用甲醇逐級(jí)稀釋，以鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，得質(zhì)量濃度分別為0.23、0.47、0.94、1.88、3.75、7.50、15.00、30.00 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件色譜柱：Shimadzu C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（含0.4%磷酸）（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm；進(jìn)樣量：20 μL。取對(duì)照品及樣品（正交試驗(yàn)號(hào)1）溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果理論板數(shù)以6種成分計(jì)均大于1 500，峰1～4的分離度均大于2，峰5～6分離度約為1.5，系統(tǒng)適用性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.2.4 線性關(guān)系及定量限考察取系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，建立各黃酮苷元的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以溶液中各黃酮苷元的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、以相應(yīng)的黃酮苷元的峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為兒茶素：y＝128 086x+101 987（R2＝0.999 6）；蘆?。簓＝13 553x+27 405（R2＝0.999 6）；楊梅素：y＝32 713x－2 733.8（R2＝0.999 9）；槲皮素：y＝37 503x－9 514.1（R2＝0.999 4）；山柰酚：y＝38 039x－5 124.4（R2＝0.999 7）；異鼠李素：y＝38 376x－3 240.2（R2＝0.999 8）。結(jié)果表明，6種黃酮苷元檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍均為0.234～30.0 μg/mL，定量限均為0.234 μg/mL。

2.2.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度試驗(yàn)按照相關(guān)試驗(yàn)要求，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，精密度試驗(yàn)中，6種黃酮苷元峰面積RSD值均小于1.77%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中（12 h內(nèi)），6種黃酮苷元峰面積RSD值均小于1.51%（n＝6）；重復(fù)性試驗(yàn)中，6種黃酮苷元峰面積RSD值均小于1.83%（n＝6）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中，6種黃酮苷元的加樣回收率均為99.69%～106.81%（RSD＝3.59%，n＝6）。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化黃酮提取工藝

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)參考前期沙棘葉黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果[10]，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、料液比（D）為考察因素，以6種黃酮苷元的提取率總和為綜合考察指標(biāo)，采用L9（34）表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)[11]，對(duì)提取工藝進(jìn)行考察。各黃酮苷元的提取率＝各黃酮苷元量/沙棘原料質(zhì)量×100%。6種黃酮苷元的提取率總和即為各黃酮苷元提取率之和。

因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1Factors and levels

2.3.2 沙棘葉正交試驗(yàn)結(jié)果與分析按照L9（34）提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，沙棘葉提取試驗(yàn)安排及方差分析結(jié)果見表2、表3。

表2 沙棘葉正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2Orthogonal test design and results of leaves of H.rhamnoides

表3 沙棘葉正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab 3Variance analysis in orthogonal test results of leaves of H.rhamnoides

由表2直觀分析可知，A因素中各水平影響大小順序?yàn)锳3＞A1＞A2，B因素中各水平影響大小順序?yàn)锽3＞B1＞B2，C因素中各水平影響大小順序?yàn)镃3＞C2＞C1，D因素中各水平影響大小順序?yàn)镈2＞D3＞D1，各因素對(duì)提取工藝影響大小順序?yàn)锳＞B＞C＞D，最優(yōu)工藝條件為A3B3C3D2。方差分析結(jié)果顯示，各因素均有極顯著影響（P＜0.01），其中A因素影響最大，D因素的影響最小。綜合考慮，最終確定沙棘葉中黃酮最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取3次、每次提取2.0 h、料液比1∶16。

2.3.3 沙棘籽正交試驗(yàn)結(jié)果與分析依據(jù)“2.3.2”項(xiàng)下相同方法，對(duì)沙棘籽中的黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析結(jié)果見表4、表5。

表5 沙棘籽正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab 5Variance analysis in orthogonal test results of seeds of H.rhamnoides

由表4直觀分析可知，A因素中各水平影響大小順序?yàn)锳1＞A3＞A2，B因素中各水平影響大小順序?yàn)锽2＞B3＞B1，C因素中各水平影響大小順序?yàn)镃3＞C2＞C1，D因素中各水平影響大小順序?yàn)镈3＞D1＞D2，各因素對(duì)提取工藝影響大小為C＞D＞A＞B，最優(yōu)工藝條件為A1B2C3D3。方差分析表結(jié)果顯示，C因素對(duì)結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01），A、D因素對(duì)結(jié)果也有顯著影響（P＜0.05），B因素對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響。綜合考慮，最終確定沙棘籽中黃酮最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取3次、每次提取1.5 h、料液比1∶24。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取同批沙棘葉和沙棘籽粉末各3份，每份100 g，以正交試驗(yàn)所得優(yōu)化條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 沙棘葉和沙棘籽中黃酮提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)（n＝3）Tab6Verificationtestoftheextraction technology for flavonoids in leaves and seeds of H.rhamnoides（n＝3）

表6結(jié)果顯示，沙棘葉中兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的提取率分別約為19.1、14.2、15.3、2.9、2.3、2.6 mg/g，提取率總和約為56.4 mg/g；沙棘籽中6種黃酮苷元的提取率分別約為9.1、5.0、0.2、0.5、0.3、0.3 mg/g，提取率總和約為15.4 mg/g。驗(yàn)證結(jié)果提示，優(yōu)化后的提取工藝結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

3 討論

現(xiàn)有的黃酮提取技術(shù)中，多以紫外分光光度法測(cè)定所得總黃酮的含量結(jié)果為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法鑒別具體的黃酮種類及其含量，因此無(wú)法對(duì)提取工藝和過(guò)程進(jìn)行精確質(zhì)控。而筆者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，采用高效液相色譜法，可對(duì)沙棘葉和沙棘籽中的6種黃酮苷元進(jìn)行快速分離和精確分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)提取物中黃酮種類和含量的全面分析。另外再結(jié)合正交試驗(yàn)，利用建立的6種黃酮苷元的含量測(cè)定方法得到的含量結(jié)果，可篩選合適的提取條件，使得6種黃酮成分均能同時(shí)并最大化被提取出來(lái)，兼顧了不同指標(biāo)的綜合效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了提取工藝的整體優(yōu)化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的提取工藝，沙棘葉和沙棘籽中的黃酮成分提取效果明顯：沙棘葉6種黃酮苷元的提取率總和高達(dá)56.4 mg/g，沙棘籽達(dá)到15.4 mg/g，均高于文獻(xiàn)[10，12-14]報(bào)道的水平。因此，本試驗(yàn)結(jié)果為沙棘黃酮的工業(yè)化提取提供了新的方法參考。

從本試驗(yàn)結(jié)果也可以看出，沙棘葉及沙棘籽中的黃酮含量差異明顯。沙棘葉中的黃酮苷元以兒茶素、楊梅素、蘆丁為主，同時(shí)槲皮素、山柰酚、異鼠李素也有一定的含量，因此適當(dāng)提高醇提液中乙醇的比例、延長(zhǎng)提取時(shí)間，可兼顧6種黃酮類成分，獲得最優(yōu)提取效果。而沙棘籽中黃酮含量較低，且以水溶性好的兒茶素和蘆丁為主，水溶性較差的其他黃酮總占比不足1%，因此適當(dāng)調(diào)高醇提液中的水分比例，可提高水溶性黃酮的提取率，獲得最優(yōu)提取效果。綜上，采用各黃酮成分組成的多指標(biāo)對(duì)藥材中的黃酮進(jìn)行提取，可依據(jù)藥材中所含黃酮的種類和特性及時(shí)調(diào)整提取條件，與只以總黃酮為考察指標(biāo)的工藝相比，可獲得更優(yōu)的提取效果。

[1]高月萍.沙棘的開發(fā)利用價(jià)值研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2016（3）：82-83.

[2]彭游，湯明，胡小銘，等.沙棘黃酮提取進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（4）：562-567.

[3]田茜，何晨，賀敬霞，等.沙棘總黃酮-聚乙烯吡咯烷酮K30固體分散體的制備、表征及體外溶出研究[J].中國(guó)藥房，2017，28（1）：115-118.

[4]Muselin F，Brezovan D，Savici J，et al.The use of sea bu-ckthorn（Hippophae rhamnoides L.）and milk thistle（Silybum marianum L.）in alloxaninduceddiabetesmellitusinrats[J].Scientific Papers Animal Science＆Biotechnologies，2016，49（1）：280-283.

[5]張穎，張立木，秦樹存，等.泰山沙棘果提取物調(diào)血脂作用研究[J].中國(guó)藥房，2011，22（7）：586-588.

[6]Yogendra Kumar MS，Tirpude RJ，Maheshwari DT，etal.Antioxidantandantimicrobialproperties of phenolic rich fraction of Seabuckthorn（Hippophae rhamnoides，L.）leaves in vitro[J].Food Chemistry，2013，141（4）：3443-3450.

[7]Pallavi B，Chandresh V，Kanika K，et al.In vitro evaluation of antidiabetic and antioxidant activity of Seabuckthorn（Hippophae rhamnoides L.）leaves[J].J Med Plant Res，2015，9（35）：929-932.

[8]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：184-185.

[9]嚴(yán)婭.沙棘葉茶加工工藝研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[10]陳燕玲，馮靜，吳小培，等.沙棘葉黃酮提取工藝的單因素研究及其品類變化[J].廣州化工，2017，45（11）：91-93.

[11]趙之麗，趙平，鄧光銳，等.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方江南卷柏散提取工藝[J].中國(guó)藥房，2016，27（28）：3996-3998.

[12]王樹林.沙棘葉黃酮提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（8）：110-113.

[13]尚軍，楊子駒，陳婧媛.肋果沙棘籽總黃酮的兩種不同提取方法比較[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，30（1）：38-40.

[14]孫斌，瞿偉菁，張曉玲，等.高效液相色譜法測(cè)定沙棘籽渣中黃酮苷元含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（2）：139-141.

Optimization of Extraction Technology for Flavonoids in Leaves and Seeds of Hippophae rhamnoides by Multiindex-Orthogonal Test

HUI Renjie1，F(xiàn)ENG Jing1，LIN Mohan1，F(xiàn)ENG Bainian1，2（1.School of Pharmacy，Jiangnan University，Jiangsu Wuxi 214122，China；2.Jiangsu Alpha Biopharmaceuticals Co.Ltd.，Jiangsu Wuxi 214122，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology for flavonoids in leaves and seeds of Hippophae rhamnoides.METHODS：Using the total extraction rate of 6 flavonoid aglycones（catechins，rutin，myricetin，quercetin，kaempferol，isorhamnetin）as index，ethanol volume fraction，extraction time，extraction times，material-lipid ratio as investigation indexes，L9（34）orthogonal test was designed to optimize the extraction technology of flavonoids in leaves and seeds of H.rhamnoides，and verification test was carried out.RESULTS：The optimum extraction technology for flavonoids in leaves of H.rhamnoides was ethanol volume fraction of 70%，extracting for 3 times with material-lipid ratio of 1∶16，and 2.0 h each time；and that of seeds was ethanol volume fraction of 50%，extracting for 3 times with material-lipid ratio of 1∶24，and 1.5 h each time.In verification test，the total extraction rate of 6 flavonoid aglycones was 56.4 mg/g in the leaves（RSD＝1.4%，n＝3）and 15.4 mg/g in the seeds（RSD＝3.4%，n＝3）.CONCLUSIONS：Optimized extraction technology is simple，stable，feasible，and can be used for extracting the flavonoids in leaves and seeds of H.rhamnoides.

Leaves of Hippophae rhamnoides；Seeds of Hippophae rhamnoides；Orthogonal test；Extraction technology；Flavonoid aglycone

R284.2

A

1001-0408（2017）34-4856-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.27

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（No.BK20140136）；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目（No.PPZY2015B146）

＊副教授，博士。研究方向：藥物分析。E-mail：huirenjie@jiangnan.edu.cn

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：藥物化學(xué)、藥物分析。E-mail：fengbainian@jiangnan.edu.cn

2017-06-21

2017-09-08）

（編輯：劉萍）