, ,, ,,*

(1.中國動物疫病預防控制中心,北京 102609;2.中國標準化協(xié)會,北京 100048)

劉洪斌1,李穎1,姚喜梅2,于雷1,蔡英華1,*

(1.中國動物疫病預防控制中心,北京 102609;2.中國標準化協(xié)會,北京 100048)

采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜建立羊奶及奶粉中吡布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅、奧達特羅等27種β-受體激動劑類藥物殘留檢測方法。樣品經(jīng)過1%甲酸乙腈提取、Oasis PRiME HLB柱凈化后,經(jīng)Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)分離,以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫,多通道MRM信號采集模式,27種β-受體激動劑類藥物能在10.5 min內(nèi)出峰完好,在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi),27種β-受體激動劑類藥物線性良好,相關系數(shù)均在0.993以上;羊奶中最低定量限均低于0.5 μg/kg,通過0.5、2.5、5.0 μg/kg三個濃度的加標回收實驗表明,回收率為65.7%～119%,批內(nèi)變異系數(shù)為0.79%～10.4%,批間變異系數(shù)為2.13%～15.7%。奶粉中最低定量限均低于2.0 μg/kg,通過2.0、10.0、20.0 μg/kg三個濃度的加標回收實驗表明,回收率為60.5%～109%,批內(nèi)變異系數(shù)為1.91%～12.4%,批間變異系數(shù)為3.06%～17.2%。所建立方法為一種高通量檢測羊奶及奶粉中β-受體激動劑類藥物殘留確證分析方法。

羊奶,奶粉,β-受體激動劑類,殘留,UPLC-MS/MS

羊奶在國際營養(yǎng)學界被稱為“奶中之王”,相比牛奶,羊奶脂肪粒和蛋白微粒小,更容易被人體吸收,羊奶酪蛋白含量比牛奶低,乳清蛋白比例高,更接近于人奶,更適合嬰幼兒食用,同時異體蛋白含量也較少,對牛奶過敏和體質較弱的人群更適合選用羊奶[1]。隨著消費水平的提高,越來越多的消費者傾向于營養(yǎng)價值更高的羊奶及奶制品,但隨著近年來我國畜產(chǎn)品例行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)羊肉中β-受體激動劑類藥物的不斷檢出,羊奶及奶粉中β-受體激動劑類藥物殘留的風險越來越大,對嬰幼兒及體弱人群身體健康造成潛在威脅。

現(xiàn)行國標GB/T22965-2008未包含羊奶和奶粉中β-受體激動劑類藥物檢測方法,目前檢測β-受體激動劑類藥物方法文獻較多,近年來檢測方法有毛細管電泳法[2]、氣相色譜質譜聯(lián)用法[3]、飛行時間質譜法[4]和液相色譜質譜聯(lián)用法[5-6]等,尤其液質聯(lián)用方法較多;動物源性基質大多為動物組織,尿液和牛奶等[7-12],且檢測新型β-受體激動劑藥物種類少,而同時檢測羊奶及奶粉中包括吡布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅、奧達特羅等27種β-受體激動劑類藥物的檢測方法還未見報道,因此建立同時檢測羊奶及奶粉中多種β-受體激動劑類藥物殘留定量方法勢在必行。

本文采用超高效液相串聯(lián)質譜建立的羊奶及奶粉中27種β-受體激動劑類藥物檢測方法,具有藥物種類多、操作簡單、靈敏度高,穩(wěn)定性好的優(yōu)點,并通過已知陽性樣品驗證,方法滿足羊奶及奶粉中β-受體激動劑類藥物殘留檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奧西那林(CAS:586-06-1)、西馬特羅(CAS:54239-37-1)、特布他林(CAS:23031-25-6)、沙丁胺醇(CAS:242-424-0)、齊帕特羅(CAS:117827-79-9)、西布特羅(CAS:54239-39-3)、吡布特羅(CAS:38677-81-5)、羥芐羥麻黃堿(CAS:26652-09-5)、丙卡特羅(CAS:72332-33-3)、非諾特羅(CAS:13392-18-2)、瑞普特羅(CAS:54063-54-6)、羥甲基克倫特羅(CAS:38339-18-3)、克侖塞羅(CAS:157877-79-7)、克倫普羅(CAS:38339-11-6)、氯丙那林(CAS:3811-25-4)、克侖特羅(CAS:37148-27-9)、萊克多巴胺(CAS:97825-25-7)、妥布特羅(CAS:41570-61-0)、美托洛爾(CAS:37350-58-6)、馬布特羅(CAS:56341-08-3)、馬噴特羅(CAS:54238-51-6)、福莫特羅(CAS:73573-87-2)、溴布特羅(CAS:41937-02-4)、班布特羅(CAS:81732-65-2)、奧達特羅(CAS:868049-49-4)、噴布特羅(CAS:38363-32-5)、苯乙醇胺A(CAS:1346746-81-3) 購于德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度均在97%以上;乙腈、甲醇、甲酸等有機溶劑均為色譜純 美國Fisher公司;Waters Oasis PRiME HLB SPE柱(60 mg,3 cc) 美國waters公司。

用甲醇將上述標準品配制單標母液,并配制10 μg/mL混合儲備液于-20 ℃保存(保存期限3個月),使用時現(xiàn)配成系列標準工作液;

樣本原料:10份羊奶及5份奶粉購于超市和電商,部分樣本經(jīng)LC-MS/MS分析確認為不含待測物的陰性樣本作空白添加實驗使用;實驗室原有含β-受體激動劑類藥物羊奶樣為陽性測試樣本。

超高效液相色譜儀(Acquity UPLC)配三重四級桿質譜儀(quattro premier XE)、3K15型離心機、millipore純水儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理過程 羊奶樣品提取:準確稱取2 g(精確到0.01 g)羊奶于50 mL離心管中,加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃酶解12 h,然后加入8 mL 1%甲酸乙腈,9500 r/min離心5 min取上清液于15 mL離心管中,待過凈化柱。

奶粉樣品提取:準確稱取5 g(精確到0.01 g)奶粉樣品,加入適量水溶解,并最終定容于20 mL,充分混勻后,準確稱取2 mL羊奶于50 mL離心管中,加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃酶解12 h,后加入8 mL 1%甲酸乙腈,9500 r/min離心5 min取上清液于15 mL離心管中,待過凈化柱。

凈化:將提取液全部轉移至80%乙腈水活化的Oasis PRiME HLB柱中,流速1～2 d/s,收集全部濾過液,50 ℃氮氣吹至近干,用初始流動相定容至1 mL,12000 r/min離心5 min,0.22 μm濾膜過濾待上機測定。

1.2.2 液相條件 色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流速:0.3 mL/min;流動相A:甲醇,B:0.1%甲酸水溶液,0～0.5 min,3% A保持不變,0.5～2.0 min,3% A線性變化至25%;2.0～3.5 min,25% A保持不變,3.5～3.6 min,25% A線性變化至40%;3.6～4.0 min,40% A保持不變;4.0～5.5 min,40% A線性變化至90%;5.5～8.0 min,90% A保持不變;8.0～8.1 min,90% A線性變化至3%,8.1～10.5 min,3% A保持不變。

1.2.3 質譜條件 電離模式:ESI+;毛細管電壓:3.5 kV;萃取錐孔電壓:3 V;RF透鏡電壓:0.5 V;源溫:110 ℃;脫溶劑溫度:350 ℃;錐孔氣流速:50 L/h;脫溶劑氣流速:550 L/h;碰撞氣流速:0.17 mL/min;采集模式:多通道MRM。

1.2.4 方法學驗證

1.2.4.1 線性方程及靈敏度 實驗采用空白羊奶及奶粉樣品經(jīng)1.2.1方法處理,在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)分別添加β-受體激動劑類藥物混標溶液,配制1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L基質加標溶液,依次進樣,以色譜峰面積為縱坐標,化合物濃度為橫坐標做標準曲線;將處理好的空白羊奶及奶粉樣品逐級稀釋標準溶液,按10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)。

1.2.4.2 回收率實驗及變異系數(shù) 取空白羊奶樣品,添加濃度為0.5、2.5、5.0 μg/kg(奶粉中添加2.0、10.0、20.0 μg/kg)三個水平混標溶液,批內(nèi)6次平行,按1.2.1方法進行添加回收實驗;在不同日期重復測定3個批次,計算日內(nèi)變異系數(shù)與日間變異系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化

通過文獻[13]對比實驗發(fā)現(xiàn),β-受體激動劑類化合物碎片離子和丟失離子存在一定共性,其中羥甲基克倫特羅、克侖塞羅、克倫普羅和克侖特羅具有相同的碎片離子m/z 202.9,推測是各自準分子離子峰[M+H]+,脫去H2O分子后,經(jīng)結構重排失去(2-甲基丙烯)得到的特征碎片;而沙丁胺醇、西布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅等丟失離子普遍為m/z 60.2、m/z 18.0、m/z 74.3分別為脫H2O+丙烯峰、脫H2O峰和脫H2O+2-甲基丙烯峰;依據(jù)歐盟2002/957/EC決議中關于質譜分析法定性定量不少于4分的規(guī)定,選擇強度較高的兩對子離子,并優(yōu)化碰撞電壓使其相應強度最佳,各種藥物優(yōu)化母離子和子離子及對應聚焦電壓和碰撞電壓值見表1。

表1 27種β-受體激動劑類藥物的檢測離子、對應質譜參數(shù)及保留時間Table 1 Qualitative ions,quantitative Ions* and relevant parameters of β-agonists

續(xù)表

注:*為表示定量離子。

由于同時分析藥物較多,單一MRM通道無法滿足靈敏度和準確度要求,因此采用分時段多通道MRM模式,并對駐留時間進行優(yōu)化,使各通道駐留時間在0.005～0.05 ms之間,保證各色譜峰上都能達到10～12個數(shù)據(jù)采集點,確保每種化合物都能得到較高的靈敏度和準確定量。

2.2 液相條件優(yōu)化

本文采用甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相,選擇Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Shield RP18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)進行實驗,結果表明,多種β-受體激動劑類化合物在50 mm色譜柱上,出峰時間集中在2～4 min。由于相對保留時間過于集中造成色譜峰上采集點數(shù)過少,嚴重影響目標化合物的靈敏度,而后兩種100 mm色譜柱中,BEH C18類型色譜柱下,各物質更為分離完全,峰形更好,且能避免萊克多巴胺出峰分叉的問題。

2.3 提取條件優(yōu)化

國標方法及文獻[14-16]中,樣本中某些β-受體激動劑類藥物易和動物體內(nèi)葡萄糖醛酸結合,造成提取回收率低的現(xiàn)象,因此將通過空白羊奶樣品添加20 μg/kgβ-受體激動劑類混合標準溶液,經(jīng)過37 ℃酶解12 h。然后分別選取0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈和2%甲酸乙腈為提取溶劑處理豬肉樣品,經(jīng)UPLC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn):酸性有機試劑提取條件下,β-受體激動劑類藥物大多能達到50%以上的回收率,并且不同的甲酸量對提取效果的影響不同,綜合全部β-受體激動劑類藥物回收率發(fā)現(xiàn)(圖1)1%甲酸乙腈提取效果最好,27種β-受體激動劑類藥物回收率均能達到60%以上。

圖1 不同提取溶劑下提取回收率Fig.1 Recoveries were obtained by different extraction conditions

2.4 基質效應

羊奶因含有更多的營養(yǎng)物質和生物活性因子,增加了基質的復雜性,采用質譜進行定量分析時會存在不同程度和來源的基質效應[17-18],為評估基質效應的影響,本實驗采取提取后添加法[19],為此按照1.2.1方法處理空白羊奶樣本,然后添加20 μg/kg混合標準溶液制成基質加標溶液,設計基質效應對照實驗,基質效應(ME)=標液在空白羊奶基質中峰面積/標液在純?nèi)軇┲蟹迕娣e,若比值小于1.0,說明基質對待測物的響應產(chǎn)生抑制作用;若大于1.0,說明基質的存在增強效果;若等于1.0,說明待測物的響應未受影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)27種β-受體激動劑類藥物在羊奶基質中均存在不同程度的基質抑制作用,ME分別為0.56～1.00之間,原因可能為前處理過程后,羊奶中脂類、糖類、可溶性蛋白等內(nèi)源性雜質隨目標化合物共流出,在電離過程中共流出物抑制目標化合物的離子化過程。因此在檢測過程中應采用基質匹配標準溶液,消除基質效應的影響,不同藥物基質抑制程度見圖2。

圖2 羊奶中基質效應圖Fig.2 The figure of matrix effect in goat milk

2.5 線性方程及靈敏度實驗

實驗采用空白羊奶及奶粉樣品經(jīng)1.2.1方法處理,分別添加β-受體激動劑類藥物混標溶液,配制1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L基質匹配標準溶液,實驗結果表明1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好,相關系數(shù)均大于0.993,結果見表2～表3。

將處理好的空白羊奶及奶粉樣品逐級稀釋標準溶液,按10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ),羊奶中定量限在0.1～0.5 μg/kg,奶粉中該類藥物定量限為0.5～2.0 μg/kg,結果見表2～表3。

2.6 回收率實驗及變異系數(shù)

取空白羊奶樣品,添加濃度為0.5、2.5、5.0 μg/kg(奶粉中添加2.0、10.0、20.0 μg/kg)三個水平混標溶液,批內(nèi)6次平行,不同時間重復測定3個批次,進行添加回收實驗,添加5.0 μg/kgβ-受體激動劑類藥物的羊奶樣品定量離子圖見圖3,回收率在65.7%～119%,批內(nèi)變異系數(shù)為0.79%～10.4%,批間變異系數(shù)為2.13%～15.7%(奶粉中回收率在60.5%～109%,RSD%值為1.91%～12.4%,批間變異系數(shù)為3.06%～17.2%)之間,方法的準確度及精密度滿足 GB/T 27404-2008 技術要求,結果見表2。

表2 羊奶中27種β-受體激動劑類藥物添加回收率、CV值、線性系數(shù)及定量限值(n=6)Table 2 Spiked recoveries,CVs,linear coefficients and the limits of quantitation of 27 β-agonists in goat milk(n=6)

表3 奶粉中27種β-受體激動劑類藥物添加回收率、CV值、線性系數(shù)及定量限值(n=6)Table 3 Spiked recoveries,CVs,linear coefficients and the limits of quantitation of 27 β-agonists in powder(n=6)

2.7 實際樣品檢測

應用該方法對超市購買的10份羊奶樣品、5份羊奶粉和實驗室原有陽性羊奶樣本進行測定,實驗結果顯示,購買的羊奶及奶粉樣本中未檢測到β-受體激動劑類藥物殘留,陽性樣本檢出沙丁胺醇含量為5.56 μg/kg,與原有結果5.82 μg/kg相比較,在結果偏差允許范圍內(nèi)。表明該方法適用于羊奶及奶粉中β-受體激動劑類藥物檢測。

3 結論

本實驗通過對液相和質譜條件和前處理過程進行優(yōu)化,建立了同時檢測羊奶及奶粉樣本中吡布特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、克倫普羅、奧達特羅等27種β-受體激動劑類藥物的超高效色譜串聯(lián)質譜方法,并對所建方法進行了方法學驗證和實際樣本檢測,驗證該方法滿足羊奶及奶粉中β-受體激動劑類藥物檢測要求。該方法彌補了現(xiàn)有國標方法檢測基質單一,檢測藥物種類少的缺點,對奶及奶粉中多種β-受體激動劑類藥物同時確證檢測、篩查和確證羊奶及奶粉中β-受體激動劑類藥物殘留以及相關標準制修訂提供了參考,對監(jiān)管羊奶及奶粉質量安全具有一定技術支撐作用。

圖3 空白羊奶基質中添加5.0 μg/kg β-受體激動劑類藥物色譜圖Fig.3 The chromatograms obtained from blank goat milk spiked with 5.0 μg/kg of β-agonists

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Simultaneousdeterminationoftwenty-sevenβ-agonistsresiduesingoatmilkandpowderusingultraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry

LIUHong-bin1,LIYing1,YAOXi-mei2,YULei1,CAIYing-hua1,*

(1.China Animal Disease Control Center,Beijing 102609,China;2.China Association for Standardization,Beijing 100048,China)

A multiresidue method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the determination of twenty-sevenβ-agonists(pyrbuterol,procaterol,reproterol,clenproperol,olodaterol. et al)residues in goat milk and powder. In this method,analytes were extracted by acidified acetonitrile,and purified by Oasis PRiME HLB SPE column. twenty-sevenβ-agonists were analyzed by Acquity UPLC BEH C18column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)using methanol and 0.1% formic acid as the mobile phases. The signals are acquired through the multi-channel MRM mode. All analytes could be well-separated by a gradient program during 10.5 minutes. The calibration curves of twenty-sevenβ-agonists were linear in a concentration range of 1.0～100.0 μg/L(r>0.993),and the limits of quantitation were all less than 0.5 μg/kg in goat milk. The recoveries of 0.5,2.5,5.0 μg/kg fortified samples ranged from 65.7%～119%,with the intra-assay coefficient of variation was 0.79%～10.4% and the inter-assay coefficient of variation was 2.13%～15.7%. The limits of quantitation were all less than 2.0 μg/kg in milk powder. The recoveries of 2.0,10.0,20.0 μg/kg fortified samples ranged from 60.5%～109%,with the intra-assay coefficient of variation was 1.91%～12.4% and the inter-assay coefficient of variation was 3.06%～17.2%. The method was established as a high-throughput method for confirmation ofβ-agonists residues in goat milk and powder.

goat milk;milk powder;β-agonists;residues;UPLC-MS/MS

2017-03-29

劉洪斌(1985-)，男，碩士，工程師，從事動物產(chǎn)品質量安全檢測及風險評估方面的研究，E-mail:liuhongbin111@163.com。

*通訊作者:蔡英華(1977-)，男，本科，工程師，從事動物產(chǎn)品質量安全檢測及風險評估方面的研究，E-mail:caiyh@163.com。

十二五國家科技支撐計劃項目(2014BAD13B05)；獸藥殘留檢測標準物質研制(2013FY113300-1)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)23-0214-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.040