, ,2,*,,梅萍,

(1.欽州學院食品工程學院,廣西欽州 535011;2.廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點實驗室,廣西欽州 535011)

周采燕1,黃海1,2,*,李娜梅1,黃梅萍1,莫小云1

(1.欽州學院食品工程學院,廣西欽州 535011;2.廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點實驗室,廣西欽州 535011)

探討牡蠣肽-鋅納米粒的形成條件及穩(wěn)定作用力。通過透光率檢測初步篩選牡蠣肽-鋅納米粒形成的條件,用粒徑分析和電鏡觀察方法確認納米粒的形成。通過次級鍵破壞實驗分析穩(wěn)定納米顆?？臻g結構的作用力。結果表明,在牡蠣肽中加入0.5%～0.9%的硫酸鋅后,將體系pH調(diào)至6.0～11.0,即可制得粒徑為28～102 nm的牡蠣肽-鋅納米粒。鋅是納米粒的必需組分,疏水作用和靜電相互作用是穩(wěn)定納米粒的關鍵作用力。牡蠣肽-鋅納米粒有望成為新型補鋅制劑。

牡蠣肽,納米粒,形成,穩(wěn)定作用力

納米型礦物元素補充劑具有顯著的促礦物元素吸收效果[1-2],因此開發(fā)納米型礦物元素補充劑越來越得到研究者們的關注。利用蛋白肽、多糖等生物分子調(diào)控礦物元素納米化的生物模板法具有反應條件溫和的優(yōu)勢[3-4],例如Zhang[5]和黃海等[6]分別利用大豆分離蛋白和魚卵磷酸肽制備肽-鈣納米粒,Wu[7]等利用鳀魚肽制備肽-鐵氧化物納米粒,高義霞[8]和楊夢濤[9]等分別利用刺槐豆多糖和牡蠣多糖制備多糖-硒納米粒。鋅是人體必需的礦質(zhì)元素之一,在人體生長發(fā)育、生殖遺傳等重要生理過程中起到至關重要的作用。然而由于鋅的吸收利用率較低,鋅缺乏癥常見[10-11]。牡蠣是著名的補鋅食材,因此利用牡蠣開發(fā)補鋅制品得到研究者們的關注。目前關于此方面的研究較少,而且全都集中在利用牡蠣肽或蛋白酶解物與硫酸鋅結合形成復合物上[12-14]。然而蛋白肽與鋅是否能形成納米粒及其形成條件的研究還未見報道。本論文將對牡蠣肽-鋅納米粒的形成條件及其穩(wěn)定作用力進行系統(tǒng)研究,為納米型肽-鋅復合物類補鋅制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

去殼鮮欽州大蠔(近江牡蠣) 平均18 g/個,購自欽州仟仟萬家超市;尿素、十二烷基苯磺酸鈉(SDS) 上海生工;胰蛋白酶 酶活190 kU/g,南寧龐博生物工程有限公司;實驗所用其它試劑 均為分析純及以上。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠;UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司;ZEN3600粒徑分析儀 英國Malvern 公司;JEM-1200EX透射電鏡 日本JEOL公司。

表1 牡蠣肽與硫酸鋅混合溶液的透光率(%)Table 1 The Transmittance of oyster peptide-zinc solvents(%)

注:同一列上標不同字母表示差異顯著(p<0.05),表3、表4同;-表示渾濁或沉淀。

表2 牡蠣肽與硫酸鋅混合形成納米粒的條件Table 2 The formation conditions of oyster peptide-zinc nanoparticles

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣肽的制備 牡蠣清洗去除雜質(zhì)后,瀝干,組織搗碎,用2倍體積的正己烷-無水乙醇(1∶3)在50 ℃浸泡攪拌脫脂8 h,六層紗布過濾,得到濾渣再重復脫脂2次,收集濾渣、晾干、研磨后過150目篩,即得脫脂牡蠣粉。脫脂牡蠣粉按照作者前期酶解優(yōu)化實驗得到的條件進行酶解,具體條件為:經(jīng)胰蛋白酶在49 ℃、加酶量3000 U/g、底物濃度2%、pH9.0條件下酶解2 h,用0.1 mol/L NaOH和HCl維持pH穩(wěn)定。酶解完成后在100 ℃滅酶10 min,冷卻,于10000 r/min、4 ℃條件下離心20 min,將上清液過0.45 μm微孔濾膜即得牡蠣肽,-18 ℃冷凍備用。

1.2.2 納米粒形成初判 預先配制0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%系列濃度硫酸鋅溶液,與7 g/L的牡蠣肽溶液等體積混合,每種混合溶液均調(diào)節(jié)pH至3.5、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0,在600 nm處測定其透光率。同時測定對應pH下的牡蠣肽溶液和同濃度硫酸鋅溶液的透光率,以二者中透光率低者為基準透光率。當樣液不產(chǎn)生渾濁或沉淀且透光率比基準透光率下降20%時,即初判納米粒形成[5]。

1.2.3 粒徑分析 測定參數(shù)設置為:光源He-Ne激光燈,波長633 nm,入射角173°,粘度1.0031,RI 1.330,25±0.1 ℃,平衡時間60 s,每個樣品掃描3次,取平均值,并得到粒徑分布系數(shù)(particle dispersion index,PDI),PDI越小說明粒徑分布越均勻。

1.2.4 電鏡分析 將待測樣液吸附在銅網(wǎng)上,自然風干5～10 min后用磷鎢酸負染,自然風干后置于80 kV透射電鏡上觀察。

1.2.5 穩(wěn)定納米顆粒作用力分析 在通過四種條件(0.5%硫酸鋅,pH6.0;0.6%硫酸鋅,pH6.5;0.8%硫酸鋅,pH7.0;0.9%硫酸鋅,pH8.0)制備的納米粒溶液中,加入2.5 mol/L EDTA溶液,搖勻后靜置1 h,測定透光率并進行電鏡觀察,研究去除鋅離子對納米粒的影響。同理往上述四種納米粒溶液中加入0.01% SDS,考察疏水作用對納米粒的影響；加入2 mol/L尿素,考察氫鍵對納米粒的影響；調(diào)節(jié)四種納米粒溶液的pH至2～11,研究靜電相互作用對納米粒的影響[5]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均做三個平行,運用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析和LSD檢驗。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 牡蠣肽-鋅納米粒形成初判

從表1可以看出,混合體系的透光率隨著pH的上升而增加,卻隨著硫酸鋅濃度的上升而下降。根據(jù)納米粒形成的判定條件,將能夠形成納米粒的條件歸納在表2中。由表2可知,牡蠣肽不能與低濃度的硫酸鋅(0.4%及以下)形成納米粒。當硫酸鋅濃度達到0.5%以上時,牡蠣肽才能與硫酸鋅形成納米粒,而且要求pH最低為6.0,且隨著硫酸鋅濃度的上升,納米粒形成所需的最低pH增大,且pH范圍也增大。當硫酸鋅濃度達到0.9%時,納米粒形成的pH最高可達11,pH范圍增大到3個單位。

實驗中發(fā)現(xiàn)牡蠣肽在pH大于5時均呈澄清狀,透光率維持在81%左右,而pH降至3.5時發(fā)生渾濁,表明牡蠣肽的等電點pI為3.5左右,牡蠣肽中含有帶負電的酸性基團,這些基團是與鋅離子結合的化學基礎。而所有硫酸鋅溶液均在pH大于6.5時產(chǎn)生沉淀,在pH6.0以下保持澄清,透光率穩(wěn)定在90%左右(數(shù)據(jù)未列出)。雖然牡蠣肽不能與低濃度的硫酸鋅(0.4%及以下)形成納米粒,卻能夠抑制硫酸鋅在pH6.5～11范圍內(nèi)產(chǎn)生沉淀,這可能是由于牡蠣肽中的酸性基團與鋅離子結合從而抑制其形成氫氧化鋅沉淀。Huang等[15]在研究鯉魚卵肽時發(fā)現(xiàn),鯉魚卵肽含有大量帶負電的磷酸絲氨酸基團,能夠抑制鈣在pH7.8的磷酸鹽體系下沉淀,這與本結果相一致。

由表1還可看出,牡蠣肽發(fā)生聚集沉淀的pH隨著硫酸鋅濃度的升高而升高,從硫酸鋅濃度為0.3%以下時的pH3.5發(fā)生沉淀到硫酸鋅濃度為0.9%時的pH7.0發(fā)生沉淀。這與納米粒形成的pH變化趨勢是一致的,說明納米粒的形成與牡蠣肽分子的聚集是相關的。黃海等[16]揭示魚卵磷酸肽-鈣納米粒的形成是由于鈣離子與磷酸肽分子的負電基團結合產(chǎn)生電荷屏蔽效應,并且鈣離子在磷酸肽分子中充當鹽橋,導致魚卵磷酸肽聚集形成納米粒。由于牡蠣肽也含有負電基團且鋅離子也是多價金屬離子,因此牡蠣肽-鋅納米粒的形成也可能是這種“鹽橋效應”機制。

2.2 牡蠣肽與鋅離子形成納米粒的確認

表3 牡蠣肽-鋅納米粒的粒徑分布Table 3 The size distribution of oyster peptide-zinc nanoparticles

2.2.1 牡蠣肽-鋅納米粒的粒徑分布 由表3可知,在表2中列出的納米粒形成條件下均能形成粒徑為28～102 nm的納米顆粒,且分散性良好(PDI<0.4)。通過分析可知,隨著pH的下降和硫酸鋅濃度的上升,顆粒粒徑增大。當硫酸鋅濃度為0.9%時,納米粒的粒徑由pH11.0的28 nm上升到pH8.0的101 nm;當pH為8.0時,納米粒的粒徑由0.8%硫酸鋅濃度的59 nm上升到0.9%硫酸鋅濃度的101 nm。如前所述,體系pH的變化會引起牡蠣肽的帶電情況,pH下降就接近牡蠣肽的等電點(pI 3.5),牡蠣肽帶電變少,分子發(fā)生聚集的趨勢變大;而鋅離子的濃度升高,則對牡蠣肽的電荷屏蔽作用加強,也加大牡蠣肽聚集的程度,這與粒徑分析的結果是相吻合的。

2.2.2 牡蠣肽-鋅納米粒的電鏡圖 由圖1可以清楚地觀察到納米粒的形成,且納米粒的尺寸與粒徑分析儀的結果基本一致。粒徑分析儀和電鏡分析的結果均證實納米粒的形成。

圖1 牡蠣肽-鋅納米粒電鏡圖Fig.1 TEM images of oyster peptide-zinc nanoparticles 注:A:0.9%硫酸鋅,pH11.0;B:0.7%硫酸鋅,pH7.0。

2.3 穩(wěn)定納米顆粒結構的空間作用力

2.3.1 EDTA對納米粒穩(wěn)定的影響 加入EDTA后體系的透光率變化如圖2所示。由圖2知道,在四種牡蠣肽-鋅納米粒中加入EDTA之后,混合液的透光率均顯著升高到81%左右,恢復到各自條件下的牡蠣肽溶液的透光率水平,透射電鏡圖(圖3)呈現(xiàn)無顆粒的彌散狀態(tài),說明納米粒被完全破壞。由此可見鋅離子不但參與了牡蠣肽和硫酸鋅混合體系形成納米粒的過程,而且是納米粒中不可缺少的組分。這與Zhang等[5]研究大豆分離蛋白與鈣離子形成納米粒的結果相一致。

圖2 EDTA對納米粒分散液透光率的影響Fig.2 The influence of EDTA on transmittance of nanopaticle dispertions注:1:0.5%硫酸鋅,pH6.0;2:0.6%硫酸鋅,pH6.5;3∶0.8%硫酸鋅,pH7.0;4:0.9%硫酸鋅,pH8.0。圖4、圖6同。

圖3 納米粒分散液經(jīng)EDTA處理后的透射電鏡圖Fig.3 TEM image of nanopaticle dispertion after EDTA treatment

2.3.2 SDS對納米粒穩(wěn)定的影響 由圖4可知,在四種牡蠣肽-鋅納米粒中加入SDS之后,透光率也顯著升高到各自條件下的牡蠣肽溶液的透光率水平,說明納米顆粒也被完全破壞,透射電鏡圖也證實納米粒的消失(圖5),這和EDTA實驗結果一致。SDS能強烈破壞蛋白質(zhì)分子間的疏水作用,由此可知疏水作用是牡蠣肽-鋅納米粒形成和穩(wěn)定的關鍵空間作用力[17]。

圖4 SDS對納米粒分散液透光率的影響Fig.4 The influence of SDS on transmittance of nanopaticle dispertions

圖5 納米粒分散液經(jīng)SDS處理后的透射電鏡圖Fig.5 TEM image of nanopaticle dispertion after SDS treatment

2.3.3 尿素對納米粒穩(wěn)定的影響 由圖6可知,在四種牡蠣肽鋅納米顆粒中加入尿素之后,透光率顯著升高。但是后兩種條件下形成的納米粒加入尿素后其透光率并未升高到牡蠣肽溶液的透光率水平,進一步通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)(圖7),納米粒依然可辨認,但納米粒的粒徑顯著降到10 nm以下?？梢娔蛩啬芤欢ǔ潭鹊钠茐募{米粒,但卻不能使納米粒完全解體,這與前人的研究結果一致[5-6]。由于尿素能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氫鍵而導致蛋白質(zhì)分子結構松弛[18]而變性,因此氫鍵可能參與了納米粒的形成,但并不是納米粒穩(wěn)定的關鍵作用力。本實驗中尿素的氨基也可能與鋅離子配位絡合,導致納米粒部分破壞。因此尿素是否是因為破壞氫鍵而導致納米粒的破壞還無法確定,還需進一步研究。

圖6 尿素對納米粒分散液透光率的影響Fig.6 The influence of urea on transmittance of nanopaticle dispertions

圖7 納米粒分散液經(jīng)尿素處理后的透射電鏡圖Fig.7 TEM image of nanopaticle dispertion after urea treatment

2.3.4 pH對納米粒穩(wěn)定的影響 由表4中可以看出在0.7%硫酸鋅、pH7.0條件下制得牡蠣肽-鋅納米粒在pH6～8的范圍內(nèi)均是穩(wěn)定的,透光率穩(wěn)定在54.6%～64.5%之間。當pH降至5.0以下,出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,說明納米粒聚集。當pH達到9.0以上,納米粒被破壞而呈現(xiàn)均勻分散狀態(tài),表現(xiàn)為透光率上升。這表明靜電相互作用是形成和穩(wěn)定納米粒的關鍵因素。通過與表1比較發(fā)現(xiàn),牡蠣肽-鋅納米粒具有一定的抗pH穩(wěn)定性。表1中牡蠣肽與0.7%硫酸鋅只能在pH6.5～7.0范圍內(nèi)形成納米粒,但是當形成納米粒后卻能在pH6.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定存在,這說明牡蠣肽鋅納米粒具有一定的穩(wěn)定結構,其破壞需要克服一定的活化能[19]。

表4 pH對納米粒分散液透光率的影響Table 4 The influence of pH on transmittance of nanopaticle dispertions

注:√表示納米粒,×表示沒有納米粒。

3 結論

以往的研究均指出金屬離子在腸道中是以離子形式通過小腸粘膜上特定的離子通道而吸收。但近期研究揭示鐵離子可以氧化鐵納米粒的形式通過胞吞的方式吸收[2,20],這為納米型礦物元素補充劑的研究開發(fā)提供了理論基礎。本論文通過控制硫酸鋅的濃度和pH,在牡蠣肽中加入0.5%～0.9%的硫酸鋅后,將體系pH調(diào)至6.0～11.0,制得了粒徑為28～102 nm的牡蠣肽-鋅納米粒,并確定了鋅離子是肽-鋅納米粒形成的物質(zhì)基礎,疏水作用和靜電相互作用是其穩(wěn)定的關鍵作用力,這為納米型肽-鋅補充劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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Formationandstabilizedforceofoysterpeptide-zincnanoparticles

ZHOUCai-yan1,HUANGHai1,2,*,LINa-mei1,HUANGMei-ping1,MOXiao-yun1

(1.College of Food Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535011,China;2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Development and High-value Utilization ofBeibu Gulf Seafood Resource,Qinzhou 535011,China)

To investigate the formation and stabilized force of oyster peptide-zinc nanoparticles,the formation conditions could be preliminary screened by turbidity test and the formation of nanoparticles could be confirmed by particle size analysis and electron microscope observation. The stabilized force could be determined through secondary bond destruction experiments. The results showed that nanoparticles whose diameters ranging from 28～102 nm were formed when 0.5%～0.9% zinc sulfate was added in oyster peptide solvent with pH6.0～11.0. Zinc was an essential component of nanoparticles,hydrophobic force and electrostatic interaction were the key forces for stabling the nanoparticles. Oyster peptide-zinc nanoparticles were expected to become the new zinc supplements.

oyster peptides;nanoparticles;formation;stabilized force

2017-05-22

周采燕(1983-),女,本科,研究方向:水產(chǎn)品加工及資源利用,E-mail:847051579@qq.com。

*通訊作者:黃海(1977-),男,博士,副教授,研究方向:水產(chǎn)品加工及資源利用,E-mail:jxfifagoal@163.com。

廣西自然科學基金面上項目(2016GXNSFAA380067);廣西高校中青年教師基礎能力提升項目(KY2016YB493);國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201611607006)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)23-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.016