劉航瑋，張強，耿亭，董昆，安興奎，王琪，張永軍，郭予元

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兩種方法測定綠盲蝽氣味結合蛋白AlucOBP21配體結合特性的結果比較

劉航瑋1，張強1，耿亭2，董昆1，安興奎1，王琪1，張永軍1，郭予元1

（1中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2中國農業(yè)科學院廊坊科研中試基地，河北廊坊 065000）

比較熒光競爭結合試驗（fluorescence competitive binding assay）和微量熱涌動（microscale thermophoresis，MST）技術在研究綠盲蝽（）氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs） AlucOBP21配體結合特性上的差異，探索一種新的測定昆蟲OBPs結合功能的方法。提取綠盲蝽雌、雄成蟲觸角總RNA并進行反轉錄，獲得綠盲蝽成蟲觸角cDNA。采用特異性克隆引物，以綠盲蝽成蟲觸角cDNA為模板進行PCR擴增，構建pET32a/AlucOBP21重組質粒。將重組質粒轉化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞進行原核表達，獲得含表達標簽的重組AlucOBP21蛋白。通過高親和Ni-NTA純化介質對重組粗蛋白進行純化，采用重組腸激酶切掉His-tag標簽，最終獲得無表達標簽的重組AlucOBP21蛋白。利用熒光競爭結合試驗,以1-N-phenylnaphthylamine（1-NPN）為熒光探針研究重組AlucOBP21蛋白與候選配體的結合特性，其中1-NPN和氣味標樣均溶解在質譜純級的甲醇中。同時，利用MST技術解析重組AlucOBP21蛋白與候選配體的結合特性，候選配體標樣溶解在二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液中。候選配體化合物包括8種潛在的盲蝽性信息素及性信息素類似物、12種植物綠葉揮發(fā)物和綠盲蝽驅避劑主要組分二甲基二硫醚等。重組AlucOBP21蛋白在上清液和包涵體均能夠表達，最終選擇上清組分進行目標蛋白純化，利用重組腸激酶在22℃切除His-tag標簽得到無標簽的重組AlucOBP21蛋白。熒光競爭結合試驗結果顯示，重組AlucOBP21與熒光探針1-NPN的解離常數為（6.88±0.31）μmol·L-1，AlucOBP21能夠與-紫羅蘭酮和-石竹烯結合，解離常數分別為（13.74±1.93）和（13.24±2.12）μmol·L-1，而其他候選配體均不能與重組AlucOBP21有效結合。MST測試結果顯示，AlucOBP21可以與-石竹烯、-紫羅蘭酮、-蒎烯和檸檬烯有效結合，解離常數分別為（0.20±0.02）、（0.05±0.01）、（0.70±0.04）和（0.40±0.06）μmol·L-1。其余候選配體化合物與AlucOBP21的熱涌動不能隨配體濃度變化而表現有規(guī)律的變化，故這些氣味化合物不能與AlucOBP21發(fā)生結合作用。MST檢測與熒光競爭結合試驗相比，MST所得配體結合譜更廣，不會遺漏一些結合力較弱的氣味配體。

綠盲蝽；氣味結合蛋白；AlucOBP21；競爭結合試驗；微量熱涌動測定

0 引言

【研究意義】綠盲蝽（）嗅覺系統(tǒng)在其尋找寄主、交配及趨向行為中發(fā)揮重要作用，深入研究其嗅覺系統(tǒng)對設計綠盲蝽選擇行為調控劑具有重要指導意義。昆蟲氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）是一類小分子水溶性蛋白（120—150個氨基酸，大小約為14 kD），在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。通常，昆蟲觸角中的OBPs與特異性氣味物質結合形成復合物后穿過淋巴液將氣味物質運輸到氣味受體（odorant receptors，ORs），最終激活嗅覺受體神經元，將化學信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒁l(fā)后續(xù)的嗅覺行為反應[1-3]。研究綠盲蝽OBPs的氣味配體結合特性對深入解析綠盲蝽嗅覺系統(tǒng)具有重要意義，可以為設計綠盲蝽嗅覺行為調控劑提供新思路?！厩叭搜芯窟M展】當前體外研究昆蟲重組OBPs配體結合特征的主要方法是熒光競爭結合試驗（fluorescence competitive binding assay）[4]，最近微量熱涌動（microscale thermophoresis，MST）檢測技術被成功應用于分析小分子與蛋白質的結合[5-7]，該技術在DNA與蛋白質互作以及昆蟲嗅覺受體功能研究等方面被廣泛應用[7-8]。筆者團隊前期研究發(fā)現，氣味結合蛋白AlucOBP21主要在綠盲蝽觸角中高表達，推測其在綠盲蝽嗅覺行為中發(fā)揮重要作用[9]。熒光競爭結合試驗是當前普遍采用的研究OBPs配體結合特性的方法，其原理是利用熒光探針具有發(fā)射熒光的特性，熒光探針與OBPs混合后熒光值會顯著增強，加入氣味分子后氣味分子將和熒光探針競爭結合OBPs，氣味分子和OBPs的結合能力越強，則OBPs/熒光探針復合物的熒光強度值下降的越大，以此計算氣味分子和OBPs的解離常數Ki。這種方法簡單高效，安全系數高，在研究OBPs功能方面得到了廣泛的應用[4,10-12]。但熒光競爭結合試驗屬于間接測定OBPs與氣味分子的結合能力，要求蛋白質必須與熒光探針結合且狀態(tài)穩(wěn)定，二者結合后不會影響蛋白質的理化性質、空間構象及動力學等特性。蛋白質與配體分子的結合作用會引起蛋白質理化性質的改變，如分子大小、電荷及溶劑化層，相應地結合前后它在微小溫度梯度下的運動也會有發(fā)生變化，而MST檢測可以量化蛋白質分子在微小溫度梯度下的熱運動差異，進而分析體系內的蛋白質與小分子的結合現象。MST檢測只需在很小的體系內完成，體系可設置為類似于細胞提取物或淋巴液，使之更接近生物體內的原始條件，且不受分子量大小和分子理化性質的影響，理論上其結果可信度更高[5-7,13]。MST技術可用于分析蛋白質與小分子的結合特性，OBPs與配體的結合研究正好也符合該技術應用范圍?！颈狙芯壳腥朦c】比較熒光競爭結合試驗與MST檢測兩種方法研究綠盲蝽氣味結合蛋白AlucOBP21結合特性的差異?！緮M解決的關鍵問題】重組表達綠盲蝽氣味結合蛋白AlucOBP21，開展熒光競爭結合試驗與MST檢測兩種方法測定AlucOBP21結合特性的結果比較，探索一種新的高效篩選昆蟲OBPs配體化合物的技術方法。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

綠盲蝽成蟲于2016年采自中國農業(yè)科學院廊坊科研中試基地紫花苜蓿地，將綠盲蝽置于塑料保鮮盒（25 cm×12 cm×8 cm）并用新鮮的四季豆飼養(yǎng)，保鮮盒內要放一些彎曲的紙條。養(yǎng)蟲室溫度26℃，相對濕度65%，光周期16L﹕8D。

1.2 AlucOBP21重組表達及純化

綠盲蝽氣味結合蛋白AlucOBP21基因全長序列（GenBank登錄號：KT281929）由筆者實驗室前期通過綠盲蝽觸角轉錄組測序獲得。收集4日齡綠盲蝽雌、雄成蟲觸角，并置于-80℃保存。觸角樣品經液氮研磨后采用Trizol（Invitrogen，USA）提取總RNA，按照操作說明書利用SuperScript Ⅲ反轉錄試劑盒（Invitrogen，USA）合成第一鏈cDNA。采用特異性克隆引物（表1），以綠盲蝽成蟲觸角cDNA為模板進行PCR擴增。反應條件：94℃預變性4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min?？寺∑谓涍B接、轉化及測序驗證，最終獲得正確的目標基因序列。設計含有Ⅰ和Ⅰ酶切位點的表達引物（表1）進行PCR擴增，反應條件為94℃預變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。按操作說明書對目的片段進行雙酶切，并通過T4連接酶將目的片段連接至pET-30a（+）表達載體，獲得pET32a/AlucOBP21重組質粒后，轉化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞（北京天根）中，并在含有0.1 mg·mL-1氨芐的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待OD600達到0.6—0.8時加入IPTG至終濃度為1.0 mmol·L-1，隨后20℃，150 r/min培養(yǎng)8 h。菌液經超聲破碎和和高速離心后，分別取上清和沉淀部分通過12% SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現目標蛋白主要表達在上清中。隨后，利用高親和Ni-NTA純化介質對蛋白進行純化。按照操作說明采用重組腸激酶Recombinant entherokinase切掉His-tag，獲得不含標簽的AlucOBP21蛋白并溶于pH 7.4的50 mmol·L-1Tris-HCl備用。

表1 試驗中所用引物

引物序列中小寫字母為添加的酶切位點，Ⅰ位點 “ccatgg” ，Ⅰ位點ctcgag，“-”代表ORF前，“+”代表ORF后

the lowercases in primer sequences were the restriction enzyme sites, “ccatgg” wasⅠsite , “ctcgag” wasⅠsite, ”-” represented the area before ORF, ”+” represented the area behind ORF

1.3 熒光競爭結合試驗

采用熒光分光光度計（中國天津港東科技發(fā)展股份有限公司，F-380）進行配體熒光競爭結合試驗，試驗地點為中國農業(yè)科學院植物保護研究所，測試時間為2016年8—12月。將熒光探針1-N- phenylnaphthylamine（1-NPN）溶于甲醇（質譜純級）至終濃度為1.0 mmol·L-1。設激發(fā)波長為337 nm，掃描的發(fā)射波長范圍為370—500 nm。向熒光比色皿中加入AlucOBP21和pH 7.4 Tris-HCl緩沖液使總體積為2.0 ml，蛋白終濃度為2 μmol·L-1。隨后依次向比色皿中加8 μl 1-NPN，使1-NPN終濃度由2 μmol·L-1遞增至30 μmol·L-1，穩(wěn)定后分別記錄熒光最大值，采用Scatchard方程計算AlucOBP21/1-NPN的解離常數。

檢測8種盲蝽科性信息素及其類似物、12種植物揮發(fā)物及1種綠盲蝽驅避劑組分與重組AlucOBP21的結合能力。4-氧代-反-2-己烯醛由中國農業(yè)科學院植物保護研究所新農藥創(chuàng)制研究組合成并提供，純度＞90%。其余氣味標樣購自Sigma公司或東京化成工業(yè)株式會社，純度均＞95%（表2）。氣味分子標樣以1.0 mmol·L-1濃度溶于甲醇。向濃度均為2 μmol·L-1的AlucOBP21和1-NPN的混合液中逐次加入氣味標樣，使標樣的濃度從2 μmol·L-1逐步升至30 μmol·L-1，并記錄每次加入氣味標樣后體系熒光強度的變化。若在此操作過程中混合液的熒光強度降為初始熒光強度的一半，則認為該氣味分子能夠與AlucOBP21結合。通過計算解離常數Ki值來明確AlucOBP21與氣味分子的結合力，計算公式：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，其中[IC50]表示熒光強度下降到最強熒光強度50%時體系中氣味分子的物質的量濃度，[1-NPN]為體系中未結合的1-NPN的物質的量濃度，K1-NPN為AlucOBP21/ 1-NPN復合物的解離常數[28-29]。

表2 試驗中所用氣味化合物

1.4 MST測定

MST測定地點為中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，測試時間為2016年8—12月。將重組AlucOBP21蛋白濃度稀釋到約10 μmol·L-1，用脫鹽柱將蛋白質溶液體系置換成MST測定要求的標記緩沖液。取6 μL溶解在DMSO中Monolith NT.115TMProtein Labeling Kit染料、94 μL標記緩沖液與100 μL蛋白質混勻，混合液常溫下避光保存30 min，再用分離柱將熒光標記好的蛋白和剩余的熒光染料分離，得到純凈的帶有熒光標記的蛋白后置于-20℃避光保存。候選配體標樣（表2）溶解在DMSO中制成濃度為100 mmol·L-1的母液，再用50 mmol·L-1Tris-HCl蛋白緩沖液將母液配制成濃度為500 μmol·L-1的標樣于4℃保存待用。MST檢測儀器為Monolith NT. Label Free型（Nano temper，德國），參數設定：Led power 60，MST power 40，Fluo before 5，MST on (s) 30 s，Flou after (s) 5，Delay 25。測試前將熒光標記的蛋白質冰上解凍，12 000 r/min，4℃離心后取上清。將配制好的候選配體標樣用50 mmol·L-1的Tris-HCl蛋白緩沖液按1﹕2比例稀釋成16個梯度，每個梯度體積為10 μL。取10 μL帶有熒光標記的蛋白和各梯度標樣在PCR管中混勻，冰上靜置5 min使配體分子和蛋白充分混合，用MST-NT-Label-FreeTM毛細吸管吸取混合液在MST（Monolith NT.115，NanoTemper）設備上進行檢測。MST測試中若配體與目標蛋白發(fā)生有效結合，其熱涌動會隨配體濃度升高發(fā)生有規(guī)律的變化；若熱涌動不隨配體濃度升高發(fā)生有規(guī)律的變化，說明該配體與目標蛋白不結合。MST測試數據用NT-analysis軟件進行分析，按照分析軟件說明，依據質量作用定律進行Kd擬合。

2 結果

2.1 重組表達AlucOBP21蛋白

重組AlucOBP21蛋白在上清和包涵體都能夠表達。最終選擇上清組分來純化目標蛋白，利用重組腸激酶在22℃切除His-tag得到無標簽的重組AlucOBP21蛋白。在線軟件（http://www.bio-soft.net/ sms/prot_mw.html）預測重組AlucOBP21分子量為14.5 kD，通過12% SDS-PAGE電泳結果可看出，目的蛋白條帶大小與預測分子量大小一致（圖1）。

2.2 熒光競爭結合檢測重組AlucOBP21與配體的結合特征

AlucOBP21重組蛋白與熒光探針1-NPN解離常數為（6.88±0.31）μmol·L-1（圖2）。熒光競爭結合試驗結果顯示，重組AlucOBP21能夠與-紫羅蘭酮和-石竹烯結合，解離常數分別為（13.74±1.93）和（13.24±2.12）μmol·L-1（圖3）。重組AlucOBP21不能與盲蝽類性信息素類似物或驅避劑組分有效結合（解離常數均＞50 μmol·L-1，未列出）。

M：蛋白標準分子量 Protein molecular weight marker；A：pET32/ AlucOBP21質粒轉化BL21（DE3）菌株未加IPTG誘導pET/AlucOBP21 without IPTG induction；B：pET32/AlucOBP21質粒轉化BL21（DE3）菌株加入IPTG誘導pET/AlucOBP21 with IPTG induction；C：菌液經IPTG誘導超聲破碎后上清 The supernatant of pET32/AlucOBP21 after ultrasonication；D：菌液經IPTG誘導超聲破碎后包涵體 The inclusion bodies of pET32/AlucOBP21 after ultrasonication；E：腸激酶切除His-tag后純化后AlucOBP21蛋白 The AlucOBP21 protein without his-tag purified by HisTrap column

圖2 1-NPN和AlucOBP21的結合曲線

2.3 MST檢測AlucOBP21與配體的結合特征

MST檢測顯示（圖4），熱涌動隨配體-石竹烯、-紫羅蘭酮、-蒎烯和檸檬烯濃度變化而發(fā)生有規(guī)律的變化，說明重組AlucOBP21能夠與這4種氣味化合物有效結合，解離常數分別為（0.20±0.02）、（0.05± 0.01）、（0.70±0.04）和（0.40±0.06）μmol·L-1。包括芳樟醇等其余配體化合物與AlucOBP21的熱涌動隨配體濃度變化而表現無規(guī)律的變化，所以這些氣味化合物不能與AlucOBP21發(fā)生結合作用。MST檢測中有效結合的4個配體化合物包括熒光競爭結合試驗證實的-石竹烯和-紫羅蘭酮，雖然解離常數差異很大，但主要趨勢一致。

圖3 兩種氣味化合物與AlucOBP21競爭結合曲線

3 討論

本文采用兩種技術手段檢測綠盲蝽重組AlucOBP21與候選配體化合物的結合特征。熒光競爭結合試驗結果顯示，重組AlucOBP21能夠與植物揮發(fā)物-石竹烯和-紫羅蘭酮有效結合。MST檢測顯示，AlucOBP21除了能與-石竹烯和-紫羅蘭酮有效結合外，還可與-蒎烯及檸檬烯結合。兩種檢測方法都發(fā)現AlucOBP21的氣味結合范圍相對較窄，只能夠與一些寄主植物萜烯類揮發(fā)物結合，推測該蛋白在綠盲蝽尋找、定位寄主植物的行為過程中發(fā)揮功能。

MST測定的AlucOBP21配體結合范圍比采用熒光競爭結合試驗所得結果略大，但基本趨勢是一致的。熒光競爭結合試驗應用的原理為蛋白質和熒光探針結合前后發(fā)射光譜波長和熒光強度不同，試驗要求熒光探針能與蛋白質穩(wěn)定結合且不會影響蛋白質的理化性質[4,10-12]，這種方法是間接檢測OBPs的結合能力，氣味分子與OBPs結合需要把熒光探針競爭下來，若存在探針與蛋白質結合能力很強而氣味分子與OBPs結合能力較弱時就可能出現假陰性。MST檢測在一定程度上提高了配體結合的檢測靈敏度，能夠直接測定OBPs與氣味分子的結合作用，試驗體系更接近蛋白質與氣味分子結合的原始環(huán)境，結果可能更符合預期[5-8]。熒光競爭結合試驗發(fā)現，AlucOBP21能與兩種氣味配體-石竹烯和-紫羅蘭酮結合，而MST檢測中AlucOBP21同樣能結合-石竹烯和-紫羅蘭酮，表明兩種方法存在一定的一致性。在MST檢測中，-蒎烯和檸檬烯的解離常數遠遠大于-石竹烯和-紫羅蘭酮，表明AlucOBP21與-蒎烯和檸檬烯的結合力顯著小于-石竹烯和-紫羅蘭酮。由于熒光競爭結合試驗檢測靈敏度低于MST，導致這種結合力比較低的氣味配體沒有在熒光競爭結合試驗中被檢測出來。本文中MST檢測計算得到的解離常數遠小于熒光競爭結合試驗對應數值，這可能是由于MST直接檢測體系內的分子結合，其結合能力可能更接近真實值。另外，兩種檢測技術測定原理不同，不同的儀器參數設置也會引起差異，所以計算出的Ki并不適合直接進行數值比較。

圖4 5種氣味配體與AlucOBP21結合的MST檢測

Fig. 4 MST analysis of five odor ligands with recombinant AlucOBP21

綜上所述，熒光競爭結合試驗和MST在研究昆蟲OBPs與配體分子的結合特征方面具有一定的統(tǒng)一性，但MST測得的結合譜更廣，可以篩選出結合力較弱的配體化合物。

4 結論

熒光競爭結合試驗結果顯示，綠盲蝽AlucOBP21能夠與-紫羅蘭酮和-石竹烯結合，解離常數分別為（13.74±1.93）和（13.24±2.12）μmol·L-1。微量熱涌動（MST）檢測表明，AlucOBP21可與-石竹烯、-紫羅蘭酮、-蒎烯、檸檬烯等結合，解離常數分別為（0.20±0.02）、（0.05±0.01）、（0.70±0.04）和（0.40±0.06）μmol·L-1。熒光競爭結合試驗和MST在研究昆蟲OBPs與配體分子的結合特征方面具有一定的統(tǒng)一性，但MST測得的結合譜更廣，可以篩選出結合力較弱的配體化合物。

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（責任編輯 岳梅）

Comparison of Two Methods in Analysis of Binding Characteristics of Odorant Binding Proteins AlucOBP21 of

LIU HangWei1, ZHANG Qiang1, Geng Ting2, DONG Kun1, AN XingKui1, WANG Qi1, ZHANG YongJun1, GUO YuYuan1

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy ofAgricultural Sciences, Beijing100193;2Langfang Scientific Research Trial Station, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Langfang 065000, Hebei)

The objective of this study is to compare two methods of fluorescence competitive binding assay and microscale thermophoresis (MST) in analysis of binding characteristics of odorant binding proteins Alucobp21 of, and to explore a new method for determination of binding function of insect obps.Total RNA was extracted from antennae of both female and maleadults by using Trizol reagent. The cDNAs were synthesized using the Superscript III Reverse Transcriptase system.AlucOBP21 was PCR-amplified using gene-specific primers. The sample cDNA of the antennae was used as the template. The PCR product was cloned into an expression vector PET-32a (+) for expression in prokaryotic BL21 (DE3) cells. The transformation of the strain with pET32a/AlucOBP21 was incubated in cultures and the crude protein with His-tag was obtained. The supernatant was obtained by sonication, purified by Ni ion affinity chromatography. Soon after the His-tag was removed with recombinant enterokinase, then the purified AlucOBP21 without His-tag was harvested. To investigate the binding abilities of AlucOBP21 to candidate ligand chemicals, fluorescence binding test was performed using 1-N-phenylnaphthylamine (1-NPN) as a fluorescence probe. 1-NPN and odor standard samples were dissolved in methanol (mass spectrometry grade). And also, the binding characteristics of recombinant AlucOBP21 to candidate ligands were explored by MST technique. In this assay, the candidate ligand samples were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) solution. Candidate ligands included 8 potential sex pheromones and sex pheromone analogues of mirids, 12 green leaf volatiles and a repellent (dimethyl disulfide) of.Recombinant AlucOBP21 was expressed in both supernatant and inclusion bodies. Finally, the supernatant fraction was selected to purify the target protein. Recombinant AlucOBP21 without His-tag was obtained by using recombinant entherokinase at 22℃. In fluorescence competitive binding assays, recombinant AlucOBP21 could bind with 1-NPN probe, dissociation constant was (6.88±0.31) μmol·L-1. AlucOBP21 could bind with-ionone and-caryophyllene, and the dissociation constants were (13.74±1.93) and (13.24±2.12) μmol·L-1, respectively. However, remaining candidate ligands could not effectively bind to recombinant AlucOBP21. Analysis of MST demonstrated that AlucOBP21 could bind with-ionone,-caryophyllene,-pinene and limonene, and the dissociation constants were (0.20±0.02), (0.05±0.01), (0.70±0.04) and (0.40±0.06) μmol·L-1, respectively. The thermophoresis of remaining candidate ligands with AlucOBP21 could not display regular change along with the change of ligand concentration.Therefore, these odorant chemicals could not bind with recombinant AlucOBP21.In comparison with fluorescence competitive binding assay, MST detection demonstrated a broader ligand spectrum which could not miss odorant ligands with weak binding affinities.

; odorant binding protein; AlucOBP21; competitive binding assay; microscale thermophoresis (MST)

2017-05-10；

2017-06-23

國家自然科學基金（31471778，31672038，31621064，31772176）

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