閻光宇，孫繼鵬，易瑞灶，蘇永全

( 1.國家海洋局 第三海洋研究所，福建 廈門 361005； 2.廈門大學(xué)，福建 廈門 361005；3.國家海洋局 海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361005 )

褶牡蠣金屬硫蛋白基因的克隆及組織表達(dá)分析

閻光宇1,2,3，孫繼鵬1,3，易瑞灶1,3，蘇永全2

( 1.國家海洋局 第三海洋研究所，福建 廈門 361005； 2.廈門大學(xué)，福建 廈門 361005；3.國家海洋局 海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361005 )

金屬硫蛋白是一類廣泛存在于生物體中的低分子質(zhì)量、富含半胱氨酸、高度誘導(dǎo)性的內(nèi)源金屬結(jié)合蛋白。采用RACE技術(shù)，首次獲得了褶牡蠣金屬硫蛋白基因的全長cDNA序列。該序列全長500 bp，由長54 bp的5′非翻譯區(qū)，122 bp的3′非翻譯區(qū)和324 bp的開放閱讀框組成，共編碼107個氨基酸。該蛋白序列中半胱氨酸含量豐富(28%)，不含芳香族氨基酸，富含金屬硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys結(jié)構(gòu)，存在軟體動物等無脊椎動物金屬硫蛋白特征序列，是金屬硫蛋白家族成員。熒光定量PCR法，測定褶牡蠣體內(nèi)3種組織(內(nèi)臟團(tuán)、鰓、外套膜)中金屬硫蛋白mRNA組織特異性表達(dá)以及重金屬(Cd2+、Zn2+)慢毒脅迫效應(yīng)。結(jié)果表明，金屬硫蛋白mRNA在褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中相對表達(dá)量最高；褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)金屬硫蛋白mRNA表達(dá)量與重金屬脅迫時間呈現(xiàn)出一定時間效應(yīng)關(guān)系，從脅迫開始至7 d表現(xiàn)為正調(diào)，而7～10 d開始為負(fù)調(diào)，Cd2+脅迫和Zn2+聯(lián)合Cd2+脅迫下金屬硫蛋白 mRNA表達(dá)量顯著增加，最大表達(dá)量為對照組的42.5倍(Cd)，Zn2+聯(lián)合Cd2+脅迫表現(xiàn)為拮抗作用。本試驗(yàn)結(jié)果為生產(chǎn)實(shí)踐上在多種重金屬污染下應(yīng)用金屬硫蛋白作為生物標(biāo)志物監(jiān)測水域污染狀況，保護(hù)水生生態(tài)環(huán)境提供了依據(jù)。

褶牡蠣；金屬硫蛋白；基因；組織表達(dá)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展和人類活動的加劇，海洋環(huán)境日趨惡化，海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重破壞[1]。尤其重金屬Cd污染，具有持久性、高危害性和難治理性，并能沿著食物鏈傳遞，最終進(jìn)入人體，直接危害人類健康和安全[2]。而在水環(huán)境中，由于 Cd 與 Zn 原子結(jié)構(gòu)、離子、電負(fù)性均比較相近，二者往往共同存在。因此，在同一生物體內(nèi)它們之間可能發(fā)生相互作用和干擾。相對于單一污染物的毒性試驗(yàn)，混合污染物的毒性試驗(yàn)則能更好地反映環(huán)境的實(shí)際污染狀況。

金屬硫蛋白是一類廣泛存在于生物體中的低分子質(zhì)量、富含半胱氨酸、高度誘導(dǎo)性的內(nèi)源金屬結(jié)合蛋白[3-5]，主要參與體內(nèi)微量元素的儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，拮抗電離輻射，清除自由基以及對重金屬具有解毒作用。大量研究證明，在重金屬(Cd、Zn、Pb、Hg、Cu、Bi等)誘導(dǎo)下，生物體內(nèi)金屬硫蛋白含量會顯著增加，而且這種誘導(dǎo)水平與環(huán)境中金屬含量有直接相關(guān)性，可間接反映出環(huán)境中的金屬水平。因此，20世紀(jì)70年代末就有人提出水生生物金屬硫蛋白含量可作為指示環(huán)境污染物暴露和毒性效應(yīng)早期報(bào)警的主要生物指示物[6-7]。但目前國內(nèi)外的研究主要集中在單一重金屬脅迫對組織中金屬硫蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的情況等方面[10,12,17]，混合重金屬脅迫下不同組織中金屬硫蛋白的誘導(dǎo)動態(tài)變化研究不多。因此需進(jìn)一步的研究來說明兩種或更多種金屬同時作用對組織中金屬硫蛋白含量的影響。且目前對于混合物聯(lián)合作用的研究大多進(jìn)行的是急性試驗(yàn)(96 h)，對于慢性和亞急性試驗(yàn)開展較少，這勢必會導(dǎo)致評價(jià)結(jié)果的偏差。

營固著型和附著型生活的底棲雙殼類海洋動物由于其分布廣、活動性低、對環(huán)境中重金屬有較強(qiáng)生物累積能力，能反映所在水域的污染狀況，被認(rèn)為是最好的檢測金屬硫蛋白指示的環(huán)境監(jiān)測生物[8-12]。褶牡蠣(Alectryonellaplicatula)俗名蠔、蠔等，是中國東南沿海重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一，營底棲生活，對環(huán)境中的重金屬等污染物有較強(qiáng)的累積能力，能夠較好地反映棲息地水體和底質(zhì)的污染狀況。目前，對牡蠣金屬硫蛋白的研究尚處于起步階段，對牡蠣金屬硫蛋白cDNA序列報(bào)道主要集中在美洲牡蠣(Crassostreavirginica)[13]、近江牡蠣(C.ariakensis)[14]葡萄牙牡蠣(C.angulata)[15]和長牡蠣(C.gigas)[16-17]，而對褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA的序列尚未知。

本研究以底棲雙殼類海洋動物——褶牡蠣為試驗(yàn)材料，通過RACE方法獲得褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA序列，進(jìn)行序列分析，與其他雙殼類進(jìn)行金屬硫蛋白氨基酸序列比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹；應(yīng)用Real-time PCR分析金屬硫蛋白mRNA在褶牡蠣3種組織中的表達(dá)量；選擇水體常見重金屬污染離子(Cd2+，Zn2+)共同長時間(慢性試驗(yàn))脅迫褶牡蠣，檢測其內(nèi)臟團(tuán)組織中金屬硫蛋白mRNA的較長時間的動態(tài)變化；以期為評價(jià)混合重金屬聯(lián)合對海洋貝類的安全性提出相應(yīng)的毒理資料，為海洋環(huán)境監(jiān)測指示體系的完善以及為金屬硫蛋白金屬誘導(dǎo)合成因素和機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用水為經(jīng)過沉淀、砂濾、凈化后的天然海水。

褶牡蠣取自福建省漳州市養(yǎng)殖場，將表面附著物清洗干凈，在水箱中(每箱約60只，海水30 L)暫養(yǎng)2 d。選取生長健康、規(guī)格一致[殼長(8.50±1.00) cm，殼高(3.50±0.70) cm，總體質(zhì)量(27.00±5.00) g ]的牡蠣作為試驗(yàn)對象。為避免殘餌對金屬吸附影響，暫養(yǎng)及試驗(yàn)期間不投喂，試驗(yàn)期間水溫(18±1) ℃，鹽度26～28，pH 8.0±0.2，溶解氧>8.5 mg/L，及時剔除死亡牡蠣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣不同組織取樣

取15只褶牡蠣分為3組，分別解剖取褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)(肝胰腺等)、鰓、外套膜3種組織，于RNA保存液中-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2.2 褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA克隆

根據(jù)NCBI基因庫中褶牡蠣相似物種的金屬硫蛋白保守片段序列設(shè)計(jì)5′ 和3′ 端特異性引物 (表1中F1、R1) ，經(jīng)PCR、產(chǎn)物回收、連接至克隆載體pMD19-T，pMD-19-MT委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行序列測定。

為得到褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA全序列，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA的5′ 和3′ 末端。根據(jù)已得到金屬硫蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1中F1、R1)。5′ 和3′ 末端擴(kuò)增分別使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.3.0和5′-Full RACE Kit (TaKaRa, Japan)。其中3′ RACE中PCR擴(kuò)增引物為3′RACE Outer Primer和F1，5′RACE中PCR擴(kuò)增引物為5′RACE Outer Primer和R1。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，30個循環(huán)，72 ℃ 1 min； 72 ℃延伸10 min。

受到水電站施工地理位置、地質(zhì)條件以及經(jīng)濟(jì)技術(shù)的影響，那么這些因素也會對水輪發(fā)電機(jī)組運(yùn)行狀態(tài)造成影響。由于每個水電站都是專門設(shè)計(jì)的，使得不同水電站的水輪發(fā)電機(jī)組振動情況不盡相同，可比性較差，可見其振動故障具有不規(guī)則性。

經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離檢測擴(kuò)增產(chǎn)物后，用TaKaRa Purification Kit (TaKaRa, Japan) 回收PCR產(chǎn)物目的片段，連入克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，所獲陽性克隆由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行序列測定。利用Contig軟件對3′和5′測序結(jié)果進(jìn)行拼接和重疊序列的去除，最終獲得褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA全基因序列，并設(shè)計(jì)引物(F2/R2) 進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.3 褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA序列分析

所得褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA序列與NCBI Blast程序的BlastN(核酸數(shù)據(jù)庫)、BlastX(蛋白數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行比對分析，尋求與褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA高度同源序列。利用ORF Finder程序確定開放閱讀框及相應(yīng)的氨基酸序列；利用Conserved Domains網(wǎng)站預(yù)測蛋白保守區(qū)；利用Expasy中ProtParam和ProtScale進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析；運(yùn)用Motif Scan網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)基序預(yù)測分析；運(yùn)用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具進(jìn)行氨基酸對比分析；運(yùn)用DNA-MAN軟件對其他物種的同源氨基酸進(jìn)行多重比對；運(yùn)用Clustal X 1.83和Mega 5.2軟件中基于距離的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)驗(yàn)證1000次。

表1 褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA克隆測序及Real-time PCR中所用引物

1.2.4 褶牡蠣3種組織金屬硫蛋白mRNA表達(dá)

分別提取褶牡蠣3種組織(內(nèi)臟團(tuán)、鰓和外套膜)總RNA(TRIzol試劑盒)，采用Real-time PCR分析褶牡蠣3種組織金屬硫蛋白表達(dá)量，根據(jù)已得褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA基因序列設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物(F3/R3)，所用內(nèi)參基因?yàn)?8S(引物為18S-F/18S-R)，按TaKaRa Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒方法(TaKaRa, Japan) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，選擇SYBR? Premix Ex TaqTMKit(TaKaRa,Japan)進(jìn)行Real-time PCR，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等，再分別對各組織金屬硫蛋白的表達(dá)量進(jìn)行相對定量。

1.2.5 不同重金屬脅迫對褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)金屬硫蛋白 mRNA影響

用CdCl2·2.5H2O和ZnSO4·7H2O分別配置成質(zhì)量濃度為3.00 g/L和66.00 g/L母液，備用。共設(shè)置4個試驗(yàn)組，第1組為空白對照組，其余3組為重金屬脅迫組：分別暴露于500 μg/L Cd2+、1200 μg/L Zn2+以及500 μg/L Cd2+和1200 μg/L Zn2+混合海水中(根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，待發(fā)表)，每組試驗(yàn)組設(shè)置3個平行。采用半靜態(tài)毒性試驗(yàn)法，每箱放置40個褶牡蠣，試驗(yàn)水體為30 L，不投餌，試驗(yàn)期間連續(xù)充氧，每日更新金屬試驗(yàn)水體1次。

分別在試驗(yàn)開始后的0、2、4、7 d和10 d進(jìn)行取樣，每箱取5只褶牡蠣，取內(nèi)臟團(tuán)裝入RNA保存液中，-80 ℃保存，采用Real-time PCR(方法同1.2.4) 對不同重金屬誘導(dǎo)下內(nèi)臟團(tuán)中金屬硫蛋白表達(dá)量進(jìn)行相對定量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCt法對熒光定量 PCR中金屬硫蛋白 mRNA 表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析。采用 SPSS 13.0軟件對褶牡蠣中金屬硫蛋白 mRNA的組織分布和不同重金屬誘導(dǎo)后的表達(dá)特征，用Tukey或者LSD(P<0.05)法進(jìn)行單因子方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA序列和褶牡蠣金屬硫蛋白的理化性質(zhì)

褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA(GeneBank登錄號:KP875559) 序列全長500 bp，包含324 bp的開放閱讀框，長54 bp的5′非翻譯區(qū)及122 bp的3′ 非翻譯區(qū)，可編碼107個氨基酸(圖1) ，其中半胱氨酸含量28%，無芳香族氨基酸。圖1中AATAAA為多聚腺苷酸加尾信號位點(diǎn)。用ProtParam和ProtScale工具對褶牡蠣金屬硫蛋白的理化性質(zhì)和親水性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示褶牡蠣金屬硫蛋白的相對分子量為10.462 ku，分子式為C391H650N126O147S31，理論等電點(diǎn)為8.17，不穩(wěn)定指數(shù)為30.13，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為16.36，親水性總平均值-0.239，為親水性蛋白。 Motif Scan工具對褶牡蠣金屬硫蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，褶牡蠣金屬硫蛋白具有典型的金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)，其中包含了2個磷酸化位點(diǎn)(58～61，90～93)，5個肉豆蔻酰基化位點(diǎn)(11～16，29～34，35～40，49～54，81～86)，4個糖基化位點(diǎn)(6～9，67～70，78～81，99～102)。通過Conserved Domains分析，該基因編碼的蛋白中含有保守的金屬硫蛋白基序(圖2) 。

圖1 褶牡蠣金屬硫蛋白基因cDNA全長及氨基酸序列前后方框內(nèi)分別為起始密碼子和終止密碼子；*表示終止密碼子；下劃線標(biāo)出的是多聚腺苷酸加尾信號位點(diǎn).

圖2 褶牡蠣金屬硫蛋白基因保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.2 褶牡蠣金屬硫蛋白氨基酸序列特征及進(jìn)化樹分析

使用Clustal X軟件，將褶牡蠣金屬硫蛋白氨基酸序列同其他7 種海洋雙殼貝類金屬硫蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，分析結(jié)果顯示，褶牡蠣金屬硫蛋白同其他7種海洋貝類金屬硫蛋白一致，在Cys的排列上顯示出較高的保守性和同源性(圖3) 。褶牡蠣金屬硫蛋白富含金屬硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys結(jié)構(gòu)，其中Cys-X-Cys 13個，Cys-X-X-Cys 1個，Cys-X-X-X-Cys 8個，并具有軟體動物相同的特征序列CKCXXXCXCX(X為除半胱氨酸以外的其他氨基酸) 。

由金屬硫蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示(圖4)，褶牡蠣與GenBank中公布的軟體動物匯集，其中與長牡蠣、近江牡蠣、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)以及葡萄牙牡蠣等海洋貝類的親緣關(guān)系最近，與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、鋸緣青蟹(Scyllaserrata) 等甲殼類動物，以及小家鼠 (Musmusculus)和人類 (Homosapiens)等高等脊椎動物相距較遠(yuǎn)，充分體現(xiàn)了物種之間的進(jìn)化地位，與褶牡蠣的實(shí)際生物學(xué)分類地位基本一致。

圖3 褶牡蠣與其他幾種雙殼貝類金屬硫蛋白氨基酸的多序列比對結(jié)果

圖4 基于金屬硫蛋白蛋白序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 褶牡蠣金屬硫蛋白mRNA組織表達(dá)

褶牡蠣金屬硫蛋白基因表達(dá)廣泛存在于褶牡蠣各組織中，但表達(dá)量存在差異。以褶牡蠣18S為內(nèi)參基因，通過熒光定量檢測金屬硫蛋白mRNA在各組織中的表達(dá)量(圖5)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自然條件下鰓和外套膜組織中金屬硫蛋白mRNA的表達(dá)量均顯著低于內(nèi)臟團(tuán)(P<0.001)。由此可見，在自然水體條件下，褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)是金屬硫蛋白的主要合成和代謝部位。

2.4 不同重金屬脅迫下褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)金屬硫蛋白 mRNA的差異性表達(dá)

經(jīng)過 10 d的重金屬脅迫(Zn2+、Cd2+和Zn2++Cd2+聯(lián)合)試驗(yàn)，以18S為內(nèi)參標(biāo)基因，通過熒光定量檢測重金屬脅迫下褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中金屬硫蛋白mRNA在各時間點(diǎn)(0、2、4、7、10 d)的表達(dá)量(圖6)。

圖5 褶牡蠣各組織中金屬硫蛋白mRNA的差異性表達(dá)

由圖 6可知，在整個試驗(yàn)期間(2～10 d) ，空白對照組褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中金屬硫蛋白 mRNA的表達(dá)量保持穩(wěn)定；Cd2+和Zn2+聯(lián)合Cd2+脅迫下，褶牡蠣金屬硫蛋白 mRNA表達(dá)的動態(tài)變化趨勢一致，均隨脅迫時間延長呈現(xiàn)出時間—效應(yīng)關(guān)系(倒“U”型)，從脅迫開始至7 d，褶牡蠣金屬硫蛋白 mRNA的表達(dá)水平為正調(diào)，而自7～10 d開始為負(fù)調(diào)。單獨(dú)Zn2+脅迫對褶牡蠣金屬硫蛋白 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響相對于對照組均無顯著差異，Cd2+脅迫則顯著提高了褶牡蠣金屬硫蛋白 mRNA的表達(dá)量(P<0.001)，Cd2+脅迫使內(nèi)臟團(tuán)中金屬硫蛋白 mRNA 的表達(dá)量在第7 d達(dá)到高峰，為對照組的42.5倍。Zn2+聯(lián)合Cd2+脅迫下褶牡蠣金屬硫蛋白 mRNA的表達(dá)量也顯著增加(P<0.001) ，但整個試驗(yàn)期間其表達(dá)量均低于單獨(dú)Cd2+脅迫試驗(yàn)組，第7 d達(dá)到高峰，為對照組的28.1倍。

圖6 不同金屬脅迫下內(nèi)臟團(tuán)組織中金屬硫蛋白 mRNA表達(dá)量的變化

3 討 論

3.1 褶牡蠣金屬硫蛋白 cDNA序列和結(jié)構(gòu)

金屬硫蛋白是一個超家族，同一家族的金屬硫蛋白共同擁有特有的序列特征并在進(jìn)化上相關(guān)[18]。由系統(tǒng)進(jìn)化樹和海洋軟體動物金屬硫蛋白氨基酸序列比對可知，本研究所得褶牡蠣金屬硫蛋白含有雙殼軟體動物金屬硫蛋白共有的特征序列，與海洋雙殼軟體動物金屬硫蛋白同源性最高。

軟體動物金屬硫蛋白氨基酸序列中一般有一段為CKCXXXCXCX的保守特征序列[19-22]，褶牡蠣中也有1段序列符合此模式，有些軟體動物中存在2～3段此模式的序列[21]。一般情況下，軟體動物金屬硫蛋白 C-末端有一個保守的特征序列C-X-C-X(3)-C-T-G-X(3)-C-X-C-X(3)-C-X-C-K[19-22]，褶牡蠣C段的CkCsgCkvkCyCsgsCgCgkgCTGpenCk CandsgCvCK序列與該模式在后半段有所不同，但褶牡蠣卻與美洲牡蠣、長牡蠣、葡萄牙牡蠣的金屬硫蛋白在C段的序列模式完全相同，這與進(jìn)化樹中顯示的結(jié)果一致，說明物種越接近，序列模式越相似。

3.2 褶牡蠣金屬硫蛋白不同組織表達(dá)的差異性

褶牡蠣金屬硫蛋白基因表達(dá)廣泛存在于生物體各組織中，如心臟、血液、大腦、肝臟、鰓等[2,23-26]。本研究結(jié)果顯示，金屬硫蛋白 mRNA存在于褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)、鰓和外套膜組織中，且表達(dá)量存在組織差異，金屬硫蛋白 mRNA基底表達(dá)水平在內(nèi)臟團(tuán)最高，其次為鰓、外套膜，說明在自然水體中，褶牡蠣體內(nèi)非必需金屬元素的解毒以及金屬硫蛋白合成的重要場所都是內(nèi)臟團(tuán)，許多雙殼貝類體內(nèi)重金屬分布的檢測結(jié)果也間接證明了這一結(jié)論[27-28]。

3.3 褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)金屬硫蛋白在不同重金屬脅迫下的差異性表達(dá)

大量研究表明在重金屬的脅迫條件下，生物體內(nèi)金屬硫蛋白的表達(dá)量與水環(huán)境和體內(nèi)組織中的重金屬脅迫呈現(xiàn)出一定的時間/劑量效應(yīng)關(guān)系[26,28-32]。本研究結(jié)果顯示，隨著脅迫時間延長，Cd2+脅迫下褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中金屬硫蛋白mRNA的表達(dá)量顯著增高，而Zn2+脅迫對其影響并不顯著，說明褶牡蠣金屬硫蛋白主要參與Cd2+平衡，并使牡蠣免受Cd2+的毒性作用。此外，褶牡蠣金屬硫蛋白基因表達(dá)量隨Cd2+脅迫時間變化呈現(xiàn)出時間—效應(yīng)關(guān)系，褶牡蠣金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平在Cd2+脅迫僅第2 d迅速顯著增加，并且在脅迫第7 d達(dá)到最大值，最終在脅迫第10 d回歸到較低水平。Cd2+脅迫下褶牡蠣金屬硫蛋白mRNA表達(dá)量的動態(tài)變化趨勢暗示牡蠣組織一旦接觸Cd2+，除了顯示出壓力信號，立即通過增加金屬硫蛋白基因表達(dá)和蛋白合成啟動解毒過程[33]。通常，在金屬脅迫前期 (2～7 d)金屬硫蛋白 mRNA表達(dá)水平為正調(diào)，隨著脅迫延長 (至10 d) 開始為負(fù)調(diào)，這可能因?yàn)橛捎诟L時間的金屬脅迫，牡蠣體內(nèi)重金屬積累達(dá)到毒性閾值，從而損害金屬硫蛋白的生物合成[34]。

Zn2+為生物體必需元素，參與金屬硫蛋白的合成，但本試驗(yàn)中Zn2+脅迫對褶牡蠣各組織中金屬硫蛋白表達(dá)量mRNA影響并不顯著，表明除重金屬脅迫時間和含量外，金屬硫蛋白表達(dá)水平還與金屬類型有關(guān)，相對于Zn2+，Cd2+對牡蠣金屬硫蛋白具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，這與許多文獻(xiàn)中報(bào)道結(jié)果一致[29,35-36]，此外，這也可能與牡蠣體內(nèi)具有較高的Zn2+本底值有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，Zn2+聯(lián)合Cd2+脅迫時，褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中金屬硫蛋白mRNA的表達(dá)量相對于對照組顯著增加(P<0.001)，且褶牡蠣金屬硫蛋白mRNA表達(dá)量的動態(tài)變化趨勢與單獨(dú)Cd2+脅迫下褶牡蠣金屬硫蛋白mRNA表達(dá)量的動態(tài)變化趨勢一致，表明水中Cd2+聯(lián)合Zn2+可誘導(dǎo)褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)內(nèi)金屬硫蛋白mRNA的合成和表達(dá)，但整個試驗(yàn)期間Cd2+聯(lián)合Zn2+試驗(yàn)組中金屬硫蛋白mRNA表達(dá)量均低于單獨(dú)Cd2+脅迫試驗(yàn)組，聯(lián)合金屬表現(xiàn)明顯的拮抗作用，拮抗作用機(jī)理認(rèn)為重金屬離子在進(jìn)入細(xì)胞前先與細(xì)胞表面的接收點(diǎn)結(jié)合[37]，在水環(huán)境中，Cd2+與Zn2+往往共存，由于原子結(jié)構(gòu)相似，離子半徑、電負(fù)性都比較相近[38]，Zn2+和Cd2+在與細(xì)胞表面活性位點(diǎn)結(jié)合時存在競爭，結(jié)果降低了重金屬離子在體內(nèi)的積累，導(dǎo)致混合重金屬離子的毒性下降[39]，金屬硫蛋白mRNA表達(dá)量降低可以靈敏地反映這一現(xiàn)象。對河蚌(Anodontacygnea)[40]、濱螺(Littorinasaxatilis)[37]、搖尾幼蟲[41]的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。然而，侯麗萍等[42]研究發(fā)現(xiàn)Cd2+與Zn2+對草魚(Ctenopharyngodonidella)魚種的聯(lián)合毒性24、48 h均為拮抗作用，在96 h表現(xiàn)為協(xié)同作用。周彥鋒等[43]試驗(yàn)結(jié)果也表明Zn2+的存在可以增強(qiáng)Cd2+誘導(dǎo)鯽魚(Carassiusauratus)組織中金屬硫蛋白合成的能力。影響重金屬聯(lián)合毒性作用的因素很多，如環(huán)境介質(zhì)、指示生物的類別和水體中理化指標(biāo)等[41]，這就增加了金屬硫蛋白作為檢測指標(biāo)應(yīng)用的難度，因此進(jìn)一步深入研究，也是下一步研究的重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究從褶牡蠣中獲得了金屬硫蛋白cDNA全序列，褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA的組織分布情況，以及褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)mRNA在不同重金屬脅迫下的差異性表達(dá)。金屬硫蛋白基因表達(dá)受金屬含量、暴露時間調(diào)控，表明金屬硫蛋白表達(dá)與褶牡蠣抵抗外界環(huán)境中重金屬脅迫有關(guān)，這一結(jié)果為闡明金屬硫蛋白作用機(jī)理和激活途徑，探討其在褶牡蠣?wèi)?yīng)激反應(yīng)過程中的作用提供了客觀證據(jù)。此外，該研究結(jié)果顯示金屬硫蛋白基因是一個潛在的鎘污染生物標(biāo)志物，為生產(chǎn)實(shí)踐上應(yīng)用金屬硫蛋白作為生物標(biāo)志物監(jiān)測水域污染狀況，保護(hù)水生生態(tài)環(huán)境提供了依據(jù)。

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CloningandExpressionofMetallothioneinGeneinOysterOstreaplicatula

YAN Guangyu1,2,3, SUN Jipeng1, 3, YI Ruizao1, 3, SU Yongquan2

( 1.Third Institute of Oceangraphy, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China; 2.Xiamen University, Xiamen 361005, China; 3.Engineering Research Center for Marine Biological Resource Comprehensive Utilization, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China )

A 500 bp full-length cDNA sequence of metallothionein (named as Op-MT) gene as a kind of low molecular weight, rich cysteine, and highly induced endogenous metal binding protein was obtained from oysterOstreaplicatulausing rapid amplification of cDNA end (RACE) technique, which consists of a 54 bp 5′untranslated region (UTR), a 122 bp 3′UTR and a324 bp open reading frame (ORF). The Op-MT-clone encodes 107 amino acids, and in the encoded protein, no any aromatic amino acid, was found and the cysteines accounted for 28% of the total amino acid, demonstrating the typical structure with Cys-X(1-3)-Cys type. The predicted protein sequence analysis showed that Op-MT as a member of the metallothionein family is characterized by the conserved features of invertebrate′s MTs. Moreover, real-time PCR showed the differential expression of MT mRNA in the oyster, with the maximum in hepatopancreas under the natural state. Additionally, MT mRNA levels demonstrated an up-regulation in a time-dependent manner due to Cd2+and Zn2++ Cd2+exposure during 2—7 day and down-regulated during 7—10 day. MT mRNA had no obvious difference to the control when exposed to zinc and the effect of cadmium and the zinc combining cadmium were significant (P<0.001), and the maximum expression level of MT mRNA appeared when exposed to cadmium (42.5 times for reference). Zinc exerted antagonistic effects on uptake of cadmium. The findings show MT gene is a potential pollution of cadmium in biological markers and provide a basis for the application of MT in the production practice to monitor the water pollution status and protection of the aquatic environment.

Ostreaplicatula; metallothionein; gene; tissue expression

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.016

2016-08-02；

2016-10-08.

廈門海洋研究開發(fā)院共建項(xiàng)目(K150104)；國家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(海三科2013014).

閻光宇(1983—)，女，助理研究員；研究方向：海洋功能產(chǎn)物.E-mail:guangyu0502@163.com.通訊作者：孫繼鵬(1980—)，男，助理研究員；研究方向：海洋藥物化學(xué).E-mail:jpsun@tio.org.cn.

S917

A

1003-1111(2017)05-0634-08