劉鳳巧，劉 博，徐冬雪，馬 斌，劉桂龍，陳 銀，王春德

( 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109 )

紫扇貝與海灣扇貝雜交后代的母本親權(quán)鑒定方法

劉鳳巧，劉 博，徐冬雪，馬 斌，劉桂龍，陳 銀，王春德

( 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109 )

紫扇貝與海灣扇貝的成功雜交為改善海灣扇貝的種質(zhì)提供了新的途徑。但紫扇貝和海灣扇貝均為雌雄同體的動物，在育種實踐中存在著精子或卵子污染的問題，為確保育種進程的順利進行并確證后代的譜系，經(jīng)常需要確定某一后代是否為真正的雜交后代及其父母本來源，因此需要建立一種方法來快速鑒定其親本來源尤其是母本來源。本文通過比對海灣扇貝和紫扇貝mtDNA序列差異性，設(shè)計并篩選出一對特異性引物(mtDNA-Z)，可在紫扇貝中擴增出約460 bp的PCR產(chǎn)物，而在海灣扇貝中無擴增，因此可由此建立一種鑒定雜交后代母本親權(quán)的方法。用該方法在雜交一代紫海、海紫扇貝和回交一代紫海海、紫海紫、海紫海、海紫紫扇貝的驗證結(jié)果表明，該方法簡單、快速、可靠。

海灣扇貝；紫扇貝；雜交；線粒體DNA；母本親權(quán)鑒定

海灣扇貝(Argopectenirradiansirradians)自1982年從美國引進以來, 產(chǎn)量逐年增加，已成為我國最重要的養(yǎng)殖貝類之一，但是近年來出現(xiàn)的種質(zhì)退化問題成為制約我國海灣扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的嚴重障礙[1]。紫扇貝(A.purpuratus) 是原產(chǎn)于南太平洋的一種速生型中型扇貝，大小中等，廣泛養(yǎng)殖于智利和秘魯[2]。紫扇貝和海灣扇貝同屬于海灣扇貝屬的優(yōu)良品種，存在互補的性狀，通過種間雜交有望培育出生長速度快、個體大且溫度適應(yīng)范圍廣的扇貝，為了改善海灣扇貝的種質(zhì)，提高扇貝養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟產(chǎn)量，Wang等[3]于2008年從秘魯引進紫扇貝并與海灣扇貝成功雜交，培育出了生長優(yōu)勢極其顯著的雜交后代。雜交F1代中存在著少量雌性可育個體，可通過回交的方法培育生長優(yōu)勢極其顯著的雜交扇貝后代，因而具有巨大的育種潛力。但紫扇貝和海灣扇貝均為雌雄同體的動物，在繁育時兩種扇貝均同時排放精子和卵子，在育種實踐中存在著精子或卵子污染的問題，為確保育種進程的順利進行并確證后代的譜系，經(jīng)常需要確定某一后代是否為真正的雜交后代及其父母本來源，因此需要建立一種方法來快速鑒定其親本來源。在雜交試驗中發(fā)現(xiàn)，用作雜交的母體不同，其雜交F1代性狀的表現(xiàn)也不同，有的甚至完全表現(xiàn)為母體的性狀，因此研究雜交后代的母本來源變得尤為重要。

近年來，分子標記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、品種改良、遺傳關(guān)系分析、系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域。利用來自核基因組的分子標記(如微衛(wèi)星標記、AFLP分子標記等)鑒定方法雖然可以用來鑒定雜交后代是否為真正的雜交種，但無法辨別其父母本來源。線粒體作為獨立于核基因組之外的遺傳物質(zhì)，具有與核基因組相似的特征，是作為遺傳及發(fā)育研究的良好材料，同時又由于其特殊的遺傳方式，只需對少量個體進行研究便能反應(yīng)群體遺傳結(jié)構(gòu)，因而更便于進行群體分析[4-5]。線粒體基因被廣泛應(yīng)用于生物個體的遺傳變異分析和系統(tǒng)進化等領(lǐng)域，其中應(yīng)用線粒體相關(guān)基因進行遺傳背景研究的文獻報道已有很多。在大部分的真核生物中，線粒體DNA遵循母系遺傳，即后代的線粒體DNA只來自于母本[6]。本研究根據(jù)線粒體基因組的母系遺傳特點，設(shè)計了一對紫扇貝特異性引物，由其擴增出條帶的個體為紫扇貝母本來源，能夠通過PCR方法鑒定雜交后代線粒體基因的類型，從而快速鑒定雜交扇貝的母本來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用海灣扇貝來自萊州國震水產(chǎn)有限公司，紫扇貝引自秘魯，參照紫扇貝和海灣扇貝種間雜交的方法[7]，用控溫促熟的方法培育海灣扇貝, 使其與紫扇貝親貝同時成熟, 用溫度刺激的方法使紫扇貝和海灣扇貝同時排放精卵, 分別獲得紫扇貝的精卵和海灣扇貝的精卵，建立以下家系組合:(1)紫海雜交扇貝(紫扇貝♀×海灣扇貝♂)；(2)海紫雜交扇貝(海灣扇貝♀×紫扇貝♂)。在回交試驗中，同樣用控溫促熟的方法分別獲得海紫雜交扇貝和紫海雜交扇貝的卵子及紫扇貝和海灣扇貝的精子，建立以下家系組合：(1)海紫×紫雜交扇貝(海紫雜交扇貝♀×紫扇貝♂)；(2)紫?！梁ｋs交扇貝(紫海雜交扇貝♀×海灣扇貝♂)；(3)紫?！磷想s交扇貝(紫海雜交扇貝♀×紫扇貝♂)；(4)海紫×海雜交扇貝(海紫雜交扇貝♀×海灣扇貝♂)。用傳統(tǒng)的海灣扇貝育苗方法對這幾個家系組合進行幼蟲培育，中間保苗和養(yǎng)成，4個月后對各組隨機取貝進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 扇貝全基因組DNA的提取

取待鑒定扇貝閉殼肌，保存在75%的乙醇中于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｓ锰旄鵇NA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)分別提取全基因組DNA，用TE緩沖液稀釋至終質(zhì)量濃度100 ng/μL保存于-20 ℃?zhèn)溆?，提取的全基因組DNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.2.2 特異性引物的設(shè)計

在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找紫扇貝和海灣扇貝的線粒體DNA全基因組序列(序列號KT161260.1，KT161262.1)，用DNAMAN軟件對兩序列進行比對分析，找到差異顯著的線粒體DNA序列，根據(jù)紫扇貝序列用Primer 5.0軟件設(shè)計8對特異性引物mtDNA-1至mtDNA-8(表1)。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成，引物設(shè)計的原理參照等位基因特異PCR[8]。

1.2.3 特異性引物的篩選

用設(shè)計的8對引物分別對海灣扇貝和紫扇貝進行PCR擴增，對兩種扇貝進行比較，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小是否與設(shè)計的相符，初步判斷所設(shè)計的引物是否具有特異性。以提取的扇貝DNA為模板，用上述引物對進行PCR擴增，反應(yīng)體系為10 μL，包括0.25 U Taq DNA 酶(日本Takara公司), 1×PCR buffer(含1.5 mmol/L MgCl2), 0.2 mmol/L dNTP mix, 上下游引物各1 μmol/L, 50 ng DNA模板。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃ 1 min, 56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇PCR產(chǎn)物差異最明顯的引物對用于構(gòu)建親權(quán)鑒定的方法。

表1 初步設(shè)計的8對特異性引物

1.2.4 特異引物擴增片段測序驗證

將篩選的特異性引物在紫扇貝全基因組DNA中進行PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測，用Biospin Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收目的條帶。將回收的DNA片段連接到pMD18-T質(zhì)粒載體(日本Takara公司)上，挑選陽性克隆檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果同紫扇貝和海灣扇貝線粒體基因組全序列進行比較，驗證PCR擴增獲得的DNA片段是否由線粒體DNA作為模板合成。

1.2.5 特異引物在雜交一代扇貝家系組合中的驗證

獲得初步篩選的引物，進一步在紫海扇貝及海紫扇貝家系組合中進行驗證，每個組合隨機選取20個DNA樣本進行PCR擴增、1%瓊脂糖電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察，以此驗證篩選的特異性引物是否能鑒定雜交后代的母本來源，并且確保引物的準確性。

1.2.6 特異引物在其他雜交扇貝家系組合中的驗證

隨機選取海紫×紫雜交扇貝、紫?！梁ｋs交扇貝、紫?！磷想s交扇貝和海紫×海雜交扇貝樣本各20個，用特異性引物mtDNA-Z對其進行PCR擴增，1%瓊脂糖電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 扇貝全基因組DNA提取結(jié)果

將提取的海灣扇貝、紫扇貝及其雜交后代紫海、海紫扇貝的全基因組DNA進行瓊脂糖檢測，得到一條非常明亮的條帶，結(jié)果見圖1，說明提取的全基因組DNA質(zhì)量較好，可以進行下一步試驗操作。

圖1 部分紫扇貝、海灣扇貝及雜交一代，回交一代扇貝全基因組DNA提取結(jié)果

1～2：海灣扇貝，3～4:紫扇貝，5～6：海紫扇貝，7～8：紫海扇貝，9: DL 2000，10～11：紫海紫扇貝，12～13：紫海海扇貝，14～15：海紫紫扇貝，16～17：海紫海扇貝.

2.2 特異性引物的篩選及擴增

將設(shè)計的mtDNA-1至mtDNA-8等8對引物分別在海灣扇貝和紫扇貝中進行PCR擴增，在篩選階段mtDNA-2至mtDNA-8在兩種扇貝中均能擴增出大小相同的產(chǎn)物或均無擴增產(chǎn)物，無法起到特異性鑒定的作用。而引物mtDNA-1可以在紫扇貝中擴增出約460 bp的條帶，在海灣扇貝中無擴增產(chǎn)物(圖2)，擴增的結(jié)果和預(yù)期大小相符，初步判斷引物mtDNA-1可以待選為特異性引物，將其命名為mtDNA-Z,則篩選出的特異性引物為，左端序列mtDNA-Z-F：5′-TATGAGGTGTCCCCCAAGTC-3′,右端序列mtDNA-Z-R：5′-ACTGGCAGACAAACAAATCGT-3′。

2.3 特異引物擴增片段測序驗證結(jié)果

擴增產(chǎn)物回收后的測序大小為463 bp,將其與紫扇貝線粒體DNA全序列用軟件DNAMAN進行序列比對，測得序列與紫扇貝線粒體DNA的片段相似度為97.81%(圖3)。從而排除了mtDNA-Z引物受核基因組影響的可能，確定為以紫扇貝線粒體DNA作為模板進行的擴增反應(yīng)。

圖2 部分紫扇貝、海灣扇貝PCR擴增的電泳結(jié)果

圖3 測序比對結(jié)果

2.4 特異引物在雜交一代扇貝家系組合中的驗證

將引物mtDNA-Z對雜交一代紫海扇貝、海紫扇貝進行PCR擴增，結(jié)果和預(yù)測結(jié)果相同(圖4)，在紫海扇貝中擴增出約460 bp的條帶，而在海紫扇貝中無擴增條帶出現(xiàn)，表明引物mtDNA-Z具有特異性。

圖4 部分紫扇貝、海灣扇貝及雜交一代海紫扇貝、紫海扇貝的電泳結(jié)果

2.5 特異引物在其他雜交扇貝家系組合中的驗證

將引物mtDNA-Z對其他雜交后代海紫×紫雜交扇貝、紫?！梁ｋs交扇貝、紫海×紫雜交扇貝和海紫×海雜交扇貝進行PCR擴增，結(jié)果表明(圖5)，在紫?！磷想s交扇貝、紫?！梁ｋs交扇貝中擴增出約460 bp的條帶，而在海紫×紫雜交扇貝和海紫×海雜交扇貝中無擴增條帶出現(xiàn)。上述結(jié)果進一步表明，引物mtDNA-Z具有紫扇貝特異性，從而驗證了由其擴增出條帶的個體為紫扇貝母本來源。

圖5 部分海灣扇貝、紫扇貝及回交一代扇貝的電泳結(jié)果

1～2：海灣扇貝，3～4：紫扇貝，5～6：紫海紫扇貝，7～8：紫海海扇貝，9～10：海紫紫扇貝，11～12：海紫海扇貝，M：DL 2000.

3 討 論

目前對扇貝種類的鑒別，主要通過形態(tài)學(xué)方面的性狀(大小、殼色、放射肋、棘等)來進行[9]，但是對雜交后代的鑒別，只通過扇貝的外形很難判斷。為了使鑒定更加準確，目前往往采用分子生物學(xué)手段，從分子水平上研究物種的遺傳結(jié)構(gòu)特征,不僅可以了解群體遺傳分化水平、物種起源與系統(tǒng)發(fā)生，同時也有利于遺傳育種和瀕危物種的保護。

線粒體DNA序列是目前應(yīng)用于系統(tǒng)進化[10]、物種鑒定[11]、親緣關(guān)系分析[12]等研究領(lǐng)域最廣泛的分子標記之一[13]，已經(jīng)逐漸應(yīng)用于海洋生物屬間[14-15]、種間的分子系統(tǒng)學(xué)方面[16-19]，在海洋雙殼貝類的分子系統(tǒng)學(xué)及種群關(guān)系分析方面的研究也有所報道，但僅有少數(shù)研究將mtDNA應(yīng)用在雜交種的鑒定方面[20-21]。線粒體是動物體內(nèi)已知的唯一存在的核外遺傳物質(zhì)，利用其嚴格的母性遺傳特點，可以進行雜交子代鑒定，通過鑒定分析可以準確得到其母本來源，為確保育種進程的順利進行打下了堅實的基礎(chǔ)?；诰€粒體DNA的差異性而設(shè)計的引物可以排除核基因組DNA的影響，能夠非常方便的解決微衛(wèi)星等分子標記無法避開的雜交種都含有父母本核基因組的問題[22]。

本文在試驗設(shè)計中參考篩選SNP位點的原理[23]，并在 allele specific PCR方法[9]的基礎(chǔ)上進行改進，即利用海灣扇貝和紫扇貝線粒體DNA上單個或多個堿基的差異性設(shè)計引物，既要保證PCR的正常擴增，又要使左右端引物的3′端都位于差異位點，這樣可以使得以紫扇貝為母本的雜交后代可以擴增出目的條帶，而在以海灣扇貝為母本的雜交后代中無法得到擴增產(chǎn)物，以此直接表現(xiàn)出特異性。本試驗設(shè)計了可以鑒定海灣扇貝和紫扇貝雜交后代母本來源的特異性引物mtDNA-Z，確保mtDNA-Z引物不受核基因組的影響，并可保證準確快速的起到鑒定母本來源的作用,避免了高變異可能對引物廣泛應(yīng)用的影響。盡管該試驗方法利用mtDNA標記，但不需要單獨提取mtDNA進行鑒定，用常規(guī)提取的全基因組中的少量mtDNA，即可利用引物通過PCR擴增，電泳后就能夠得到結(jié)果。本方法周期時間短，方法簡便，可大批量進行，快速高效。

本方法也為以后設(shè)計鑒定引物提供了新思路，通過這種改進的特異性引物，可以在mtDNA上篩選位點用于分子標記，起到鑒定的作用。雖然mtDNA 變異率高，但有些保守序列可以承擔標記基因的作用，為以后通過分子方法鑒別雜交扇貝提供了一種方法，在mtDNA上設(shè)計的特異性引物能夠簡單的分辨出母本的來源。運用本研究建立起來的方法，結(jié)合已有的SSR和ITS鑒定方法[3]，可以準確鑒定出雜交扇貝的父母本來源，為進一步的海灣扇貝和紫扇貝雜交后代遺傳背景的分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為扇貝雜交育種篩選新品種提供理論依據(jù)。

[1] Zhang F S, He Y, Yang H S, et al. Bay scallop culture in China: status and challenges[G]//Status of Aquaculture in China, Hawaii: The Oceanic Institute, 2003:13-28.

[2] Gonzalez M L, Perez M C, Lopez D A. Breeding cycle of the northern scallop,Argopectenpurpuratus(Lamarck, 1819) in southern Chile[J]. Aquaculture Research,2002,33(11):847-852.

[3] Wang C D, Liu B Z, Li J Q, et al. Introduction of the Peruvian scallop and its hybridization with the bay scallop in China[J].Aquaculture,2011,310(3/4):380-387.

[4] Rollinson D,Kaukas A,Johnston D A, et al. Some molecular insights into schistosome evolution[J]. International Journal for Parasitology， 1997,27(1):11-28.

[5] Avise J C, Wollenberg K. Phylogenetics and the origin of species[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1997,94(15):7748-7755.

[6] Passamonti M, Ghiselli F, Milani L. Mitochondrial inheritance[J]. Brenners Encyclopedia of Genetics, 2013, 46(2):443-445.

[7] 王春德，劉保忠，李繼強，等. 紫扇貝與海灣扇貝種間雜交的研究[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(10):83-91.

[8] Liu J, Huang S M, Sun M Y, et al. An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application[J]. Plant Methods,2012, 8(1):34.

[9] 王師，包振民，張玲玲，等.應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)鑒定區(qū)分中國沿海四種主要養(yǎng)殖貝類[J].食品科學(xué)，2006,27(7):210-214.

[10] Kumar R J, Tanya C H.Molecular markers and their applications in fisheries and aquaculture[J]. Advances in Bioscience and Biotechnology, 2010,1(4):281-291.

[11] Mugue N S, Barmintseva A E, Rastorguev S M, et al.Polymorphism of the mitochondrial DNA control region in eight sturgeon species and development of a system for DNA-based species identification[J]. Russian Journal of Genetics,2008,44(7):793-798.

[12] Ayyappan S, Jena J K, Gopalakrishnan A. Molecular tools for sustainable management of aquatic germplasm resources of India[J]. Agricultural Research, 2014,3(1):1-21.

[13] 李建華,王繼文.動物線粒體DNA在進化遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生物學(xué)通報, 2005, 40(2):5-7.

[14] 任崗. 12種石鱸科魚類線粒體16S rRNA基因的部分序列分析[J].熱帶海洋學(xué)報, 2007, 26(3):48-52.

[15] 郭天慧.三疣梭子蟹線粒體DNA 16S rRNA和COⅠ基因片段序列的比較研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2004, 34(1):22-28.

[16] Miller A D, Murphy N P, Burridge C P, et al. Complete mitochondrial DNA sequences of the decapod crustaceansPseudocarcinusgigas, (Menippidae) andMacrobrachiumrosenbergii, (Palaemonidae)[J]. Marine Biotechnology, 2005, 7(4):339-349.

[17] 孟學(xué)平，申欣，趙娜娜，等.雙殼類線粒體基因組結(jié)構(gòu)分析[J].水產(chǎn)科學(xué),2013,32(12):721-729.

[18] 李青，王波，鄭風榮，等.星斑川鰈、黃蓋鰈和石鰈線粒體基因Cytb和COⅠ片段序列的比較研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2016,35(6):625-632.

[19] 鮑相渤.皮氏蛾螺和水泡蛾螺線粒體基因組及核糖體ITS2的比較研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2016,35(6):686-692.

[20] 董迎輝，姚定余，林志華，等.浙江和廣西兩種文蛤的分子鑒定及形態(tài)特征分析[J].水產(chǎn)學(xué)報, 2011, 35(10):1505-1508.

[21] 陳海港，李偉，張新鋮，等.基于線粒體COⅠ基因鑒別云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧的分子標記[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016,35(6):1388-1392.

[22] Kline M C, Hill C R, Decker A E, et al. STR sequence analysis for characterizing normal, variant, and null alleles[J]. Forensic Sci Int Genet, 2010,5(4):329-332.

[23] Wang H, Kim M K, Kwon W S, et al. Molecular authentication ofPanaxginsengand ginseng products using robust SNP markers in ribosomal external transcribed spacer region [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011,55(5):972-976.

MethodsforMaternalParentageAnalysesinHybridsbetweenBayScallopandPeruvianScallop

LIU Fengqiao, LIU Bo, XU Dongxue, MA Bin, LIU Guilong, CHEN Yin, WANG Chunde

( College of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109，China )

The successful hybridization between bay scallop(Argopectenirradians) and Peruvian scallop(A.purpuratus) provides a new way in stock improvement of the bay scallop. Due to the hermaphroditic nature of the two scallops, contamination by unwanted sperm or eggs occurs frequently and thus a reliable and rapid parentage test method is necessary for the success of the hybrid scallop breeding. In this study, primers were designed based on the sequences of mitochondria DNA of the bay scallop and the Peruvian scallop. Screening of these primers indicated that the specific primers (mtDNA-Z) were used to amplify a PCR product of 460 bp in the Peruvian scallop, but not in the bay scallop, and thus used in parentage test of the hybrids between the two scallops. Application of this method in the parentage tests in the hybrid F1 (A.irradians♀×A.purpuratus♂ andA.purpuratus♀ ×A.irradians♂) and the backcross lines [(A.irradians♀ ×A.purpuratus♂) ×A.purpuratus♂, (A.irradians♀ ×A.purpuratus♂) ×A.irradians♂, (A.purpuratus♀ ×A.irradians♂) ×A.purpuratus♂ and (A.purpuratus♀ ×A.irradians♂) ×A.irradians♂] proved to be reliable, simple and rapid.

Argopectenirradians；A.purpuratus； hybrid； mitochondria DNA； maternal parentage analyse

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.004

2016-09-22；

2016-12-29.

國家自然科學(xué)基金面上項目(31572618)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貝類創(chuàng)新團隊建設(shè)項目(SDAIT-14-02)；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目(2215011).

劉鳳巧(1989-)，女，碩士研究生；研究方向：貝類遺傳育種. E-mail：liufengqiao2014@163.com.通訊作者：王春德(1967-)，男，教授；研究方向：海洋生物遺傳育種.E-mail：chundewang2007@163.com.

S968.313

A

1003-1111(2017)05-0563-06