高月花，于可響，宋玲玲，宋敏訓

（山東省農業(yè)科學院家禽研究所，山東 濟南 250023）

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一株鴨源H9亞型禽流感病毒的分離鑒定及H A基因序列分析*

高月花，于可響，宋玲玲，宋敏訓**

（山東省農業(yè)科學院家禽研究所，山東 濟南 250023）

本研究從發(fā)生產蛋下降疫情的山東某種鴨場采集病料,分離得到一株病毒。經血凝(HA)試驗、血凝抑制(HI)試驗、測序分析，鑒定該毒株為H9亞型禽流感病毒。對分離株HA基因進行測序及序列分析，結果顯示該分離株HA基因的裂解位點為333PARSSR↓GLF339，符合低致病性AIV的特征；與參考毒株的HA基因組序列進行比較發(fā)現(xiàn)，核苷酸的同源性為93.7%～99.3%，推導的氨基酸的同源性為96.4%～98.6%，與Shandong/YT5/2010(H9N2)株同源性最高。

H9亞型禽流感病毒；HA基因；序列分析

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒（AIV）所引起的一種禽類傳染病。根據(jù)禽流感病毒（AIV）致病力的不同可分為高致病性禽流感病毒（AIV)和低致病性禽流感病毒(AIV)[1]。H9亞型AIV屬于低致病性AIV，雖然致病力低，不引起禽類死亡或死亡率低，但會引起禽類免疫抑制生長障礙、產蛋下降，或者不表現(xiàn)臨床癥狀而成為AIV的隱性帶毒者[2]，成為AI的重要傳染源，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失。H9亞型AIV感染譜很廣，雞感染后表現(xiàn)為呼吸道癥狀或不表現(xiàn)癥狀，而鴨等水禽表現(xiàn)為產蛋下降或隱性感染不表現(xiàn)任何癥狀。雞與鴨感染H9亞型AIV后表現(xiàn)的癥狀不同已經引起越來越多的學者關注。

本研究從發(fā)生產蛋下降疫情的山東某種鴨場采集的病料，通過雞胚接種分離到一株病毒，并通過血清中和試驗、RT-PCR檢測等方法對病毒進行了鑒定，最終確認該分離病毒為H9亞型禽流感病毒，并對其HA基因進行克隆、測序和進化分析及比較。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF雞胚由山東省農業(yè)科學院家禽研究所昊泰試驗動物中心提供；禽流感病毒（AIV）H9亞型、H7亞型、H5亞型陽性血清購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司。TRIzol購自invitrogen公司；RNasin、dNTP 購自 Promega 公司；Ex-Taq、pMD18-T載體試劑盒購自TaKaRa（大連）公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和質粒小量抽提試劑盒購自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離及鑒定 采集發(fā)病鴨泄殖腔棉拭子，無菌處理后接種5枚10日齡SPF雞胚，0.2ml/枚。棄去24h內死亡的雞胚，收集24～96h的死、活雞胚尿囊液，測定其血凝價。將該病毒盲傳3代后，收集24～96h的死、活雞胚尿囊液。

1.2.2 血清學鑒定 血凝(HA)試驗：按常規(guī)方法，將收獲的雞胚尿囊液進行微量平板法HA試驗，測定病毒的血凝效價。

血凝抑制(HI)試驗：按常規(guī)方法，將HA試驗中有血凝活性的尿囊液分別與NDV、EDSV陽性血清及 H5、H7、H9亞型 AIV標準陽性血清進行微量平板法凝集抑制試驗，判定HI結果。

1.2.3 雞胚半數(shù)感染量測定 將盲傳3代收獲的有血凝活性的尿囊液稀釋成為10-6～10-9四個稀釋度，每個稀釋度接種5枚10日齡雞胚，每胚0.2ml。37℃孵育至120h。收集接種后24～120h死亡雞胚的尿囊液，未死的雞胚于120h凍死并收集尿囊液，分別測定血凝效價。按照Reed-Muench法測定其EID50。

1.2.4 病毒HA基因序列測定

1.2.4.1 引物設計 根據(jù)GenBank中發(fā)表的H9亞型AIV的HA基因序列設計一對引物，用于擴增HA基因全長片段，片段預期大小為1703bp。引物由上海生工生物工程公司合成，上游引物P1序列為：5'TTCACAACCACTCAAGATGGA3' ，下游引物P2序列為：5'GCCAATTATATACAAATGTTGC3'。

1.2.4.2 RT-PCR 按照TRIzol試劑說明提取病毒 RNA，上、下游引物(20μM)各 1μl、2×one Step Mix 25μl、one Step Enzyme Mix 2μl、DEPC 水11μl和提取的病毒 RNA 10μl，體系共 50μl。反應程序為 50℃ 30min，95℃ 2min， 然后 95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2min，30 個循環(huán)，72℃延伸 10min。取5μl反應產物在1%瓊脂糖中電泳進行檢驗。

1.2.4.3 擴增產物克隆 PCR產物電泳后，切下目的片段，用回收試劑盒回收PCR產物，回收產物與pMD18-T載體進行連接，16℃連接 2～3h。將連接產物轉化感受態(tài)DH5ɑ，均勻涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的 LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 18h后，挑取大小適中的白色菌落進行培養(yǎng)，用質粒小量抽提試劑盒提取質粒，并用PCR擴增進行鑒定。將陽性菌送上海生工生物工程公司測序。

1.2.5 HA基因序列分析 自GenBank下載國內H9亞型禽流感病毒參考株HA基因組序列，利用Lasergene和Meg6.0軟件，比較分離株與參考毒株的HA基因核苷酸及推導的氨基酸同源性，繪制HA基因的分子遺傳進化樹，對HA蛋白氨基酸序列分析。

2 結果

2.1 血清學鑒定 ①HA試驗：分離的病毒能凝集雞的紅細胞，病毒HA效價為8～10log2；②HI試驗：分離的病毒凝集雞紅細胞的特性不能被NDV、EDSV陽性血清及H5、H7亞型AIV標準陽性血清所抑制，而能被H9亞型AIV標準陽性血清所抑制，初步確定分離毒株為H9亞型AIV。

2.2 病毒雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定 盲傳3代后，病毒的雞胚半數(shù)感染量（EID50）為10-7.18/0.1ml。

2.3 病毒HA基因擴增與序列分析

2.3.1 病毒HA基因擴增 以病毒RNA作為模板，擴增的HA基因片段大小約為1.7kb，與預期片段大小相符（圖1）；將擴增產物連接pMDl8-T克隆載體后進行測序鑒定，測序所得HA基因的開放閱讀框由1703個核苷酸組成，與Genbank中公布的H9AIV核酸序列進行Blast比對，確定所得HA基因序列片段為H9亞型AIV HA基因序列。

圖1 H9亞型AIV HA基因擴增電泳圖

2.3.2 病毒HA基因分析

2.3.2.1 病毒HA基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列同源性分析 從表1可以看出，分離株SDDJ同國內其他15株H9亞型AIV參考株的核苷酸的同源性為88.8%～99.3%，推導的氨基酸的同源性為 92.9%～98.6%，與 YT5株(A/chicken/Shandong/YT5/2010)同源性最高。

表1 HA基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列同源性比較

2.3.2.2 病毒HA基因氨基酸位點分析 通過對HA基因氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，該分離株HA蛋白裂解位點為333PARSSR↓GLF339，不含堿性氨基酸，符合低致病力毒株特征。

2.3.2.3 系統(tǒng)進化關系分析 將該分離株與28株國內H9N2參考毒株的HA基因氨基酸序列進行比對分析，并運用MEGA6.0軟件繪制其HA基因的系統(tǒng)進化樹（圖2）。結果顯示，該分離株與YT5株遺傳距離最近。

3 討論

本研究從發(fā)生產蛋下降的種鴨中分離到一株H9亞型AIV，其HA效價為8～10log2，雞胚半數(shù)感染量為10-7.18/0.1ml。

HA蛋白在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用，裂解為HAl和HA2是病毒感染細胞的先決條件[3]。AIV毒株毒力的強弱主要體現(xiàn)在HA基因裂解位點的變化上。通過對該分離毒株HA蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，其HA蛋白裂解位點(333～339位)的氨基酸序列為PARSSR↓GLF，不含堿性氨基酸，這從分子水平上證實分離株為低致病力毒株[4-5]。

該分離株同國內不同地區(qū)的其他15株H9亞型AIV參考株的核苷酸的同源性及推導的氨基酸的同源性都很高，分別為88.8%～99.3%、92.6%～98.6%， 與 YT5株（A/chicken/Shandong/YT5/2010）同源性最高。

H9亞型AIV的感染譜很廣，大多數(shù)的禽類都可感染，以雞、火雞和某些野禽最易感，雞感染后通常表現(xiàn)為呼吸道癥狀，而鴨等水禽感染后表現(xiàn)為產蛋下降，或隱性感染不表現(xiàn)任何癥狀。本實驗將從產蛋下降的種鴨分離到的H9亞型AIV與國內不同宿主來源H9亞型AIV進行HA基因系統(tǒng)進化分析，結果發(fā)現(xiàn)，該鴨源分離株與國內其他鴨源分離株并沒有更近的親緣關系。

圖2 H9亞型 AIV HA基因進化樹

H9亞型禽流感是近幾年影響中國養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一,但由于H9亞型AIV屬于低致病性AIV，它的低致死率和低發(fā)病率又往往引起人們的忽視，從1997年香港人感染禽流感事件被證明病毒H5N1的重組基因來自于H9N2亞型[6]，到2013年H7N9亞型流感病毒的內部基因與H9N2亞型AIV的內部基因高度同源[7-8]， 無一不證明了的H9亞型AIV的嚴重潛在危害。所以我們更應該加強對H9亞型禽流感的關注和防控，防止由病毒變異或基因重組造成的人畜共患疫病的發(fā)生。

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[2] 孟侯．禽流感[M]．第 2版．北京：中國農業(yè)出版社，2002．

[3] 塞弗 Y M．禽病學[M]．第十一版．蘇敬良，高福，索勛，譯．北京：中國農業(yè)出版社，2005：75-117．

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The isolation and identification of a H9subtype AIV from duck and sequence analysis of HA gene*

GAO Yue-hua，YU Ke-xiang，SONG Ling-ling，SONG Min-xun**
(Poultry institute,shandong academy of agricultural sciences，jinan shandong 250023,China)

Samples were collected from a breeding duck farm with egg-laying epidemic in shandong province，and one virus strain as isolated．The virus was identified as H9subtype AIV by HA，HI test and sequencing analysis of HA gene．The sequencing analysis showed that the isolate had a HA cleavage site of 333PARSSR↓GLF339，which was a characteristic structure of low pathogenic AIV. The nueleotide homology and amino acid homology between isolated strain and the reference strains were 93.7%～99.3%and 96.4%～98.6%respectively．The isolated strain was highest homology with Shandong/YT5/2010 H9N2subtype.

H9N2subtype AIV；HA gene；sequencing analysis

S858.314.4+3

B

1673-1085（2017）12-0003-05

2017-11-11

山東省農業(yè)科學院科技創(chuàng)新重點項目資助（項目編號：2014CXZ08）。

高月花（1974-），女，山東日照人，碩士，主要從事畜禽疾病防控研究，E-mail:cwh143@sina.com。

**通訊作者：宋敏訓（1963-），男，山東招遠人，博士，研究員，碩士生導師，主要從事禽病防控與生物制品研究。