王鵬麗，任建宏，王曉璐，王育選，趙娟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

納米碳對平陸百合脫毒苗鱗片分化的影響

王鵬麗，任建宏，王曉璐，王育選，趙娟*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]研究不同濃度納米碳對平陸百合鱗片分化的影響，旨在優(yōu)化篩選分化培養(yǎng)基的同時，為納米碳應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)提供參考依據(jù)。[方法]以平陸百合脫毒苗鱗片為外植體，采用正交試驗設(shè)計法研究了植物激素與不同濃度納米碳配比對誘導(dǎo)平陸百鱗片分化的影響。[結(jié)果]6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和不同濃度納米碳配比時，鱗片分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+納米碳800 mg·L-1，分化率達(dá)98.09%；玉米素(ZT)、吲哚丁酸(IBA)和不同濃度納米碳配比時，鱗片分化的最佳培養(yǎng)基為MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+納米碳600 mg·L-1，分化率達(dá)91.43%。[結(jié)論]培養(yǎng)基中添加不同濃度的納米碳均可促進(jìn)百合鱗片的分化，不同濃度納米碳對鱗片分化的影響程度不同，其最適宜添加濃度為600～800 mg·L-1。

納米碳； 平陸百合； 鱗片分化

山西平陸百合(Liliumbrowniivar.viridulum)為百合科百合屬多年生草本球根植物，其鱗莖富含多種人體所需的蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素等[1,2]，具有較高營養(yǎng)和食用價值[3,4]，不僅是很好的保健產(chǎn)品,且在臨床上也具有醫(yī)用價值的功效?？焖俜敝嘲俸厦摱久鐬榘俸洗罅可a(chǎn)和應(yīng)用提供了有效途徑，鱗莖是最常用的快繁外植體，而以鱗片作為快繁的外植體，比鱗莖繁殖數(shù)量更大，繁殖系數(shù)更高，同時可避免病毒積累和種性退化，更有利于規(guī)?；?、工廠化快速繁殖[5]。目前已有一些誘導(dǎo)百合鱗片分化的相關(guān)研究，但尚未見到納米碳對百合鱗片分化的相關(guān)報道。

納米技術(shù)是指研究結(jié)構(gòu)尺寸在1～100 nm范圍內(nèi)的材料性質(zhì)和應(yīng)用的一項嶄新技術(shù)[6]。當(dāng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)尺寸在此范圍內(nèi)時，理化性質(zhì)會改變，這些材料通常被稱為納米材料，因其結(jié)構(gòu)獨特、性能優(yōu)異而廣泛應(yīng)用于及醫(yī)藥、能源、環(huán)境、生物、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等眾多領(lǐng)域[7～9]。納米碳作是典型的納米材料之一，目前已有研究表明，納米碳在影響生物代謝、促進(jìn)作物生長發(fā)育等方面具有良好的作用[10]，對于納米碳的研究及應(yīng)用主要集中在其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性及改良土壤、促進(jìn)作物吸水吸肥、增產(chǎn)等，但其對植物的生理作用、分子機(jī)制及在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究較少。本實驗室已在金昌棗、大花蕙蘭、紅掌的組培快繁中開展了納米碳應(yīng)用的相關(guān)研究[11]。本試驗以平陸百合鱗片為外植體，采用L16(45)正交設(shè)計法，對不同激素與不同濃度納米碳配比誘導(dǎo)平陸百鱗片分化，旨在優(yōu)化篩選百合鱗莖分化培養(yǎng)基的同時，為納米碳應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用平陸百合(Liliumbrowniivar.viridulum)脫毒苗由本實驗室前期試驗獲得。

6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供，萘乙酸(NAA) 上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站經(jīng)銷提供，玉米素(ZT) 大連美侖生物技術(shù)有限公司提供，吲哚丁酸(IBA)由天津石英鐘長霸州市化工分廠，納米碳(C>90%，粒徑40～80 nm)由山西華農(nóng)納米科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

以前期試驗篩選出的誘導(dǎo)百合鱗片分化效果較好的激素種類和配比為基礎(chǔ)，采用L16(45)正交設(shè)計法進(jìn)行納米碳對百合鱗片分化的影響研究，試驗因素及水平見表1。選用平陸百合外層鱗片作為外植體，以平鋪方式接種，每組7瓶，每瓶接種5塊鱗片，重復(fù)3次。每周觀察并記錄鱗片分化及生長情況，接種40 d后統(tǒng)計鱗片分化率。

1.3 培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，pH為5.6～5.8。

培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx。

表1 鱗片分化正交試驗設(shè)計/mg·L-1Table 1 Scale differentiation orthogonal test design

1.4 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

鱗片分化率=(發(fā)生分化的鱗片數(shù)/接種鱗片總數(shù))×100%

使用DPS 7.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；使用SPSS 17.0設(shè)計正交試驗并對所得結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米碳與6-BA、NAA配比對平陸百合鱗片分化的影響

將百合鱗片以平鋪放置方式接種于以下培養(yǎng)基，14 d后鱗片邊緣切口處膨大，21 d后在膨大處有芽出現(xiàn)，28 d后芽形成小鱗莖，緊密排列于接種鱗片的切口處，40 d后統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2納米碳與6-BA、NAA配比對鱗片分化的影響

Table 2 Effects of nano-carbon and 6-BA and NAA ratio on scale differentiation

編號Code因素Factors6?BA/mg·L-1NAA/mg·L-1納米碳/mg·L-1分化率/%Differentiationrate1020120057142020140078093020160063814020180060955050220079056050240082867050260090488050280098099080320063811008034007333110803600885712080380071431310042005619141004400695215100460075241610048006286

由表2可見，不同濃度6-BA、NAA與不同濃度納米碳配比時對百合鱗片分化的影響均不同。在附加相同激素的培養(yǎng)基中，隨著納米碳濃度的升高，鱗片分化率基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢；而隨著激素濃度的升高，配比高濃度的納米碳則促鱗片分化效果更好。所設(shè)處理中以處理8促分化效果最好，分化率最高，為98.09% (圖1a)，且分化出的小鱗莖生長健壯；而處理13的促分化效果較差，分化率僅為56.19%(圖1b)，且分化出的小鱗莖徒長。對試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析(表3)，6-BA、NAA和納米碳的極值分別是22.62、5.72和15.48，說明6-BA對平陸百合鱗片分化的影響最大，納米碳次之，NAA的作用最小。

圖1 納米碳與6-BA、NAA配比對平陸百合鱗片分化的影響Fig.1 Nano-carbon and 6-BA、NAA ratio of flat lily scales differentiation culture 注：a培養(yǎng)基:MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+納米碳800 mg·L-1；b培養(yǎng)基:MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1+納米碳200 mg·L-1Note: a (medium: MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+carbon nano 800 mg·L-1);b (medium: MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1+carbon nano 200 mg·L-1)

運(yùn)用SPSS軟件對百合鱗片分化結(jié)果進(jìn)行方差分析。從主體間效應(yīng)檢驗表(表4)可以得出，在Sig=0.05水平上，6-BA對平陸百合鱗片的分化具有顯著性差異，NAA和納米碳對鱗片的分化沒有顯著性差異；F值：6-BA>納米碳>NAA，表明3因素對百合鱗片分化作用的主次關(guān)系為6-BA>納米碳>NAA，這與極差分析的結(jié)果一致。綜合考慮，6-BA與NAA配比時誘導(dǎo)鱗片分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+納米碳800 mg·L-1。

表3平陸百合鱗片分化率極差分析(直觀分析)/mg·L-1

Table 3 Analysis of scale differentiation rate of lily (visual analysis)

試驗因素Testfactor6?BANAA納米碳水平和K1K2K3K4水平均值K1K2K3K4極值R25999291432561935048295233038029714280953181026381303812933365007286640587627381759574297024795365957596733322625721548

注：K為各因素在各個水平誘導(dǎo)率總和，k為各因素在各個水平的平均值，R為極差(下同)

Note：K the sum of the various factors in each level，k the average of the factors at each level， R Indicate range (same below)

表4平陸百合鱗片分化率方差分析

Table4 Analysis of scale differentiation rate of lily

變異來源Sourceofvariation平方和Squaresumdf均方AverageF值F?valueSig6?BA131568134385606598??0025NAA6735332245103380799納米碳525413317513826350144誤差398788666465總計8807128516

注：**表示在0.01水平上差異極顯著(下同)

Note：**indicate the obviously significant differences(P<0.01) (same below)

2.2 納米碳與ZT、IBA配比對平陸百合鱗片分化的影響

將百合鱗片以平鋪放置方式接種于以下培養(yǎng)基，分化小鱗莖的數(shù)量數(shù)及其長勢均弱于6-BA、NAA和納米碳處理組，40 d后統(tǒng)計結(jié)果見表5。

由表5可知，不同濃度ZT、IBA與不同濃度納米碳配比時對百合鱗片分化的影響也不同。在附加相同激素的培養(yǎng)基中，隨著納米碳濃度的升高，鱗片分化率也基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢；但隨著

表5納米碳與ZT、IBA配比對鱗片分化的影響

Table 5 Effects of nano-carbon and ZT and IBA ratio on scale differentiation

編號Code因素FactorsZT/mg·L-1IBA/mg·L-1納米碳/mg·L-1分化率/%Differentiationrate1020120048572020140069523020160062864020180052385050220060006050240067617050260074388050280082869080320083811008034008381110803600914312080380076191310042005048141004400609515100460071431610048005714

激素濃度的升高，以配比中濃度的納米碳促鱗片分化效果更好。所設(shè)處理中以處理11分化率最高，為91.43% (圖2 c)，但分化出的小鱗莖也出現(xiàn)部分徒長現(xiàn)象，不太健壯；而處理1的促分化效果較差，分化率僅為48.57% (圖2d)，但分化出的小鱗莖生長較健壯。極差分析可知(見表6)，ZT、IBA和納米碳的極值分別是25.48、7.36和14.31，說明ZT對平陸百合鱗片分化的影響最大，納米碳次之，IBA的作用最小。

圖2 納米碳與ZT、IBA配比對平陸百合鱗片分化的影響Fig.2 Nano-carbon and ZT、IBA ratio of flat lily scales differentiation culture 注：c 培養(yǎng)基：MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+納米碳600 mg·L-1)；d 培養(yǎng)基:MS+ZT 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+納米碳200 mg·L-1)Note:c(medium: MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+carbon 600 mg·L-1); d (medium: MS+ZT 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+nano carbon 200 mg·L-1)

運(yùn)用SPSS軟件對百合鱗片分化結(jié)果進(jìn)行方差分析。從主體間效應(yīng)檢驗表(表7)可以得出，在Sig=0.05水平上，ZT對平陸百合鱗片的分化具有顯著性差異，IBA和納米碳對鱗片的分化沒有顯著性差異；F值：ZT>納米碳>IBA，表明3因素對百合鱗片分化作用的主次關(guān)系為ZT>納米碳>IBA，這與極差分析的結(jié)果一致。綜合考慮，ZT與IBA配比時誘導(dǎo)鱗片分化的最佳培養(yǎng)基為MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1+納米碳600 mg·L-1。

表6平陸百合鱗片分化率極差分析(直觀分析)/mg·L-1

Table6 Analysis of scale differentiation rate of lily (visual analysis)

試驗因素TestfactorZTIBA納米碳水平和K1K2K3K4水平均值K1K2K3K4極值R23333264752428628485290482818933524261053001024000277142685758336619607271217262704783816526750360006929671425487361431

表7平陸百合鱗片分化率方差分析

Table7 Analysis of scale differentiation rate of lily

變異來源Sourceofvariation平方和Squaresumdf均方AverageF值F?valueSigZT/mg·L-1166911135563709854??0010IBA/mg·L-113326334442107870544納米碳/mg·L-1435246314508225700150誤差338770656462總計7729934616

3 討論

目前最常用的試驗設(shè)計和分析方法一般為正交試驗設(shè)計分析方法，它選取具有代表性的試驗點來進(jìn)行試驗，進(jìn)而達(dá)到以典型試驗代替全面試驗而實現(xiàn)優(yōu)化[12]。正交設(shè)計可減少試驗次數(shù)和試驗分析方法的繁雜，克服培養(yǎng)基設(shè)計的盲目性，使各組合均勻搭配，最終迅速找到最優(yōu)方案，確定影響實驗的主次因素[13,14]。本試驗分別對兩種組合直觀分析、方差分析、多重比較，篩選出誘導(dǎo)平陸百合鱗片分化的最適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+納米碳800 mg·L-1，確定了影響鱗片分化的主次因素即6-BA>納米碳>NAA，為優(yōu)化平陸百合鱗片分化體系提供了依據(jù)。

百合鱗片分化能力的大小受多種因素的影響，如百合品種、激素組合、接種鱗片部位(外層、中層、內(nèi)層)、接種方式(平鋪放置、豎直插入)等[15]。植物激素種類和配比調(diào)節(jié)著鱗片分化率的高低及鱗莖的大小，相同植物的不同外植體或不同植物相同器官對外源植物激素的需求不同[16]。徐麗萍等[17]選用青海細(xì)葉百合鱗片作為外植體，獲得最適分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1分化率為73.3%。 王剛[18]等報道的百合鱗片誘導(dǎo)分化的最適培養(yǎng)基MS+ 6-BA 0.5～1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。殷麗娜[19]等選用平陸百合外層鱗片最為外植體，得最適分化培養(yǎng)基為MS+ZT 1.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1分化率90.0%。本研究在6-BA、NAA、納米碳組合下，經(jīng)極差分析得到3種因子影響百合鱗片分化的主次關(guān)系為6-BA﹥納米碳>NAA；而ZT、IBA、納米碳組合下, 經(jīng)極差分析得到3種因子影響百合鱗片分化的主次關(guān)ZT﹥納米碳>IBA，說明外源植物激素對誘導(dǎo)百合鱗片分化中起決定作用，而納米碳可以促進(jìn)激素對鱗片分化的誘導(dǎo)作用。

納米碳是一種小尺寸納米材料，具有較強(qiáng)的吸附能力，能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多種酶的活性，改善植物光合性能，提高作物產(chǎn)量，在提高肥料利用率方面也有很好的效果[20,21]，王佳奇等[22]研究發(fā)現(xiàn)納米碳可促進(jìn)玉米的種子和幼苗萌發(fā)及根系生長，促進(jìn)其對水分及礦質(zhì)元素的吸收。本試驗在最佳培養(yǎng)配方的條件下，附加不同濃度的納米碳均可促進(jìn)鱗片的分化，這可能是納米碳的吸附性有關(guān)，促進(jìn)了百合鱗片對培養(yǎng)基中各種成分的吸收和利用，同時調(diào)控激素之間的平衡，其具體的作用機(jī)制如何，對植物組織培養(yǎng)的其它途徑和過程還有何作用，還需進(jìn)一步研究。

[1]李衛(wèi)民,孟憲紓,俞騰飛，等.百合的藥理作用研究[J].中藥材,1990,13(6):31-35.

[2]郭鴻飛，張延龍，牛立新，等.8種中國野生百合花花色系成分分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015，43(3)：98-104.

[3]Kim K H,Moon E,Choi S U,et al.Polyphenols from the bark of Rhus verniciflua and their biological evaluation on anti-tumor and anti-inflammatory activities[J].Phytochemistry,2013，92(4):113-121.

[4]HouR,Chen J,Yue C,et al.Modification of lily polysaccha-ride by selenylation and the immune-enhancing activity[J].Carbohy Poly,2016,142(1):73-81.

[5]譚文澄,戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京:中國林業(yè)出版社,1991:290-297.

[6]GLEITER H.Nanost ructured materials[J].Acta Metallurgica Sinica,1997,33(2):30-38.

[7]袁恒光.納米碳管對擬南芥的效應(yīng)[D].綿陽:西南科技大學(xué),2010.

[8]張中太,林元華,唐子龍,等.納米材料及其技術(shù)的應(yīng)用前景[J].材料工程,2000(3):42-48.

[9]Sastry R K,Rao N H,Richard C,et al.Can nanotechnology provide the innovations for a second green revolution in Indian agriculture[C].NSF:Nanoscale Science and Engineering Grantees Conference,2007:3-6.

[10]曹玉江,劉安勛,廖宗文,等.納米材料對玉米磷營養(yǎng)的影響初探[J].生態(tài)環(huán)境,2006,15(5):1072-1074．

[11]劉安勛,廖宗文.納米材料對水團(tuán)簇的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(36):15780-15781.

[12]劉瑞江，張業(yè)旺，聞崇煒，等.正交試驗設(shè)計與分析方法的研究[J].實驗技術(shù)與管理，2010,27(9):52-55.

[13]黃平,王荔,楊艷瓊,等.正交設(shè)計在燈盞花組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,21(2):160-163.

[14]劉建軍,龔一富,王世安,等.銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的多因子正交試驗研究[J]．廣西植物,2014,34(1):116-119，45.

[15]邊小榮，師桂英，梁巧蘭，等.蘭州百合枯萎病病原菌的分離鑒定與致病性測定[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，51(4)：58-64.

[16]Wang D M,Huang X L,Huang SH Z H. The action mechanism of cytokinins in plant tissue culture[J]. Plant Physiology Communications,1996,32(5):373-377.

[17]徐麗萍，唐道城，馬晶晶.青海細(xì)葉百合鱗片誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選[J].青海大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009,27(1)：64-66，70.

[18]王剛,杜捷,李桂英,等.蘭州百合和野百合組織培養(yǎng)及快速繁殖研究[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002,38(1):69-71.

[19]殷麗娜，任建宏，席叢林，等.平陸百合脫毒試管苗鱗片的分化研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015,35(6):619-624.

[20]劉鍵,張陽德,張志明.納米生物技術(shù)在水稻·玉米·大豆增產(chǎn)效益上的應(yīng)用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(36):15814-15816．

[21]Borm P J,Robbins D,Haubold S,et al. The potential risks of nanomaterials:A review carried out for ECETOC[J].Particle and Fibre Toxicology,2006,14(3):11-35.

[22]王佳奇,李麗鶴,孟令波,等.納米碳對玉米種子萌發(fā)及根系形態(tài)的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013,29(18):62-66.

Effectsofnano-carbononscaledifferentiationofLiliumbrowniivar.virus-freeplants

WangPengli,RenJianhong,WangXiaolu,WangYuxuan,ZhaoJuan*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]The effects of different concentrations of nano-carbon on the differentiation of Lilium davidii were studied, the aim of this study was to optimize the screening medium and to provide reference for the application of nano-carbon in plant tissue culture.[Methods]The effects of plant hormones and different concentrations of nano-carbon on the differentiation of cultivated flora were studied by orthogonal design.[Result]When 6-BA, NAA and different concentrations of nano-carbon were used, the best medium for scale differentiation was MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+nano-carbon 800 mg·L-1, the differentiation rate of 98.09%; When ZT, IBA and different concentrations of nano-carbon were used, the best medium for scale differentiation was MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+carbon 600 mg·L-1, the differentiation rate of 91.43%.[Conclusion]The addition of different concentrations of nano-carbon in the culture medium could promote the differentiation of lily scales. The effects of different concentrations of nano-carbon on the differentiation of scales were different, and the optimum concentration was 600-800 mg·L-1.

Nano carbon, PingLu lily, Scale differentiation

S682.29

A

1671-8151(2017)12-0879-05

2017-07-21

2017-09-18

王鵬麗(1990-)，女(漢)，山西左權(quán)人，碩士研究生，研究方向：植物組織培養(yǎng)

*通信作者：趙娟，博士，副教授，Tel:0354-6286958; E-mail:sxndzhaojuan@163.com

自然基金青年項目(31601369)；山西省面上青年基金(201601D202054)；山西省科技攻關(guān)項目(20130311014-1)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動項目(2012YJ13)

(編輯：韓志強(qiáng))