麥靜愔， 陳天陽(yáng)， 成 揚(yáng)

(1 上海浦東新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院， 上海 201299； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 上海 201203)

高脂飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝臟microRNA表達(dá)譜的變化分析

麥靜愔1， 陳天陽(yáng)2， 成 揚(yáng)2

(1 上海浦東新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院， 上海 201299； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 上海 201203)

目的研究microRNA(miRNA)-384的表達(dá)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠肝脂肪變性的影響。方法將30只雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后隨機(jī)分成2組，每組15只。對(duì)照組中的15只小鼠給予普通飲食，模型組15只小鼠給予HFD，喂養(yǎng)8周后獲取肝組織。進(jìn)行HE和尼羅紅染色觀察肝組織病理改變。采用微陣序列測(cè)序肝組織的全基因組miRNA表達(dá)譜，PCR法測(cè)定miRNA-384的相對(duì)表達(dá)水平。計(jì)量資料2組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果對(duì)照組小鼠肝臟呈紅色，邊緣銳利，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性；模型組小鼠肝臟呈黃色，邊緣變鈍，肝細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量脂肪空泡，脂滴相互融合導(dǎo)致細(xì)胞核偏位。與正常小鼠相比，在NAFLD小鼠的肝組織中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)上調(diào)和18個(gè)下調(diào)的miRNA。篩查了對(duì)照組和模型組間的一些差異表達(dá)的miRNA，獲得同樣的聚類分析圖。在這8個(gè)明顯改變的miRNA中，miRNA-384具有顯著的倍數(shù)變化。結(jié)論miRNA-384表達(dá)的上調(diào)與肝臟脂肪變性有著密切關(guān)系，但是其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

非酒精性脂肪性肝?。?微RNAs； 基因表達(dá)； 高脂飲食； 小鼠， 近交C57BL

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損傷因素所致的，以彌漫性大細(xì)胞性脂肪變和肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，NAFLD在世界范圍內(nèi)患病率為2%～4%，與人們的學(xué)習(xí)、工作壓力、不良的飲食及生活習(xí)慣有關(guān)，隨著肥胖及相關(guān)代謝紊亂發(fā)病逐漸低齡化，并且發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)[2-3]，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康。由于其發(fā)病原因及機(jī)制比較復(fù)雜，目前對(duì)于具體的發(fā)病機(jī)制仍然不太明確。

microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸序列的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，研究[4-5]表明其調(diào)控人類超過(guò)1/3的基因，參與細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、代謝、增殖、凋亡和病毒感染、腫瘤生成等方面。并且其表達(dá)譜分析研究已經(jīng)確定了組織表達(dá)的miRNA可以在人肝臟疾病和多種疾病中進(jìn)行差異調(diào)控，并影響肝臟的病理生理環(huán)境[6]。然而，miRNA在高脂肪飲食(high fat diet，HFD)誘導(dǎo)的NAFLD過(guò)程中脂肪變性的發(fā)生和機(jī)制尚不明確。本研究試圖觀察HFD喂養(yǎng)小鼠肝組織中miRNA譜的變化，初步探討其在脂肪肝發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量20～25 g)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器 Trizol試劑(購(gòu)自加拿大Invitrogen公司)、SYBR Green PCR Master Mix(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)、TruSeq polyA(購(gòu)自美國(guó)Illumina公司)、2100 Bioanalyzer(購(gòu)自加拿大Agilent技術(shù)公司)、HiSeq 2000系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)Illumina公司)、光學(xué)顯微鏡(購(gòu)自日本Olympus公司)、qPCR儀(購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司)。

1.3 造模與給藥 30只雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后隨機(jī)分成2組，每組15只。對(duì)照組小鼠給予普通飲食：面粉25%，玉米面30%，麩皮15%，魚粉8%，骨粉3%，奶粉2%，豆粕11%，食鹽0.5%，魚肝油0.5%，雞蛋4%，維生素及無(wú)機(jī)鹽1%[7]。模型組小鼠給予HFD：79.5%玉米粉、0.5%膽固醇和20%豬油。喂養(yǎng)8周后收集肝組織。

1.4 標(biāo)本的采集與檢測(cè)

1.4.1 體質(zhì)量與生活狀態(tài) 每日觀察小鼠體質(zhì)量及生活狀態(tài)的變化。

1.4.2 肝組織病理觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物后，將小鼠的肝臟切除。先觀察肝臟大體標(biāo)本的大小、色澤、質(zhì)地、切面等情況；再將肝組織用10%的甲醛溶液固定，固定組織常規(guī)處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行脫蠟和水化。所有的組織切片進(jìn)行HE和尼羅紅染色，光鏡下觀察肝脂肪變性情況。

1.4.3 miRNA表達(dá)譜的測(cè)定 使用Trizol試劑分離肝組織的總RNA，并根據(jù)說(shuō)明書用DNase處理以除去潛在的基因組DNA污染物。用2100 Bioanalyzer分析RNA的質(zhì)量。使用Illumina TruSeq polyA +樣品制備試劑盒制備RNA-seq的文庫(kù)。單次讀取測(cè)序(×100)在Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)上進(jìn)行。測(cè)序讀數(shù)的繪制由MapSplice2進(jìn)行，并通過(guò)RSEM定量基因表達(dá)。與對(duì)照組相比，NAFLD小鼠肝臟中的差異表達(dá)基因通過(guò)單尾、未配對(duì)的Student′s-t檢驗(yàn)進(jìn)行鑒定。當(dāng)P≤0.05時(shí)，如果它們的倍數(shù)變化≥2(或倍數(shù)變化≤0.5)，則基因被認(rèn)為顯著上調(diào)或下調(diào)。

1.4.4 定量RT-PCR 在PCR反應(yīng)管中加入如下反應(yīng)混合物：10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix，特異性引物2 μl(miRNA-384，上游引物：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′，下游引物：5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′; U6內(nèi)參，上游引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，下游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′)和cDNA模板1.45 μl，加入ddH2O補(bǔ)充體積至20 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，隨后40次循環(huán)，每次循環(huán)95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min和72 ℃延伸1 min。相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt法測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的生活狀態(tài) 經(jīng)過(guò)8周喂養(yǎng)，2組小鼠均無(wú)死亡記錄。整個(gè)過(guò)程中對(duì)照組小鼠生活狀態(tài)正常；而模型組小鼠在后期逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，體型增大，活動(dòng)減少。

2.2 肝臟組織病理結(jié)果 對(duì)照組小鼠肝臟呈紅色，邊緣銳利，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性；模型組小鼠肝臟呈黃色，邊緣變鈍，肝細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量脂肪空泡，脂滴相互融合導(dǎo)致細(xì)胞核偏位(圖1)。

2.3 在NAFLD小鼠肝組織中的miRNA表達(dá)譜和qPCR驗(yàn)證 在HFD喂養(yǎng)后8周分析對(duì)照組和模型組肝組織的全基因組miRNA表達(dá)譜。標(biāo)準(zhǔn)化后，與對(duì)照組小鼠相比，在模型組小鼠的肝組織中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)上調(diào)和18個(gè)下調(diào)的miRNA。篩查了對(duì)照組和模型組間的一些差異表達(dá)的miRNA，獲得同樣的聚類分析圖(圖2)。在這8個(gè)明顯改變的miRNA中，miRNA-384具有顯著的倍數(shù)變化(圖3)。

3 討論

NAFLD的發(fā)病原因與遺傳、環(huán)境、代謝等因素有著密切的關(guān)系，其病理類型主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化，后者可進(jìn)展為肝癌[8]。隨著發(fā)病率上升，并且發(fā)病逐漸低齡化，現(xiàn)成為最常見(jiàn)的慢性肝病，影響著人類的健康。其發(fā)病機(jī)制多數(shù)學(xué)者普遍認(rèn)同“二次打擊”學(xué)說(shuō)[9]，即脂類在肝臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的聚集引發(fā)了一系列細(xì)胞毒素的釋放，導(dǎo)致了肝臟的炎癥反應(yīng)。首次打擊主要是指脂肪在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度聚集。這一過(guò)程已經(jīng)被證實(shí)與胰島素抵抗有關(guān)，胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)功能紊亂。第二次打擊為氧化應(yīng)激反應(yīng)，是在首次打擊的基礎(chǔ)上，由活性氧誘導(dǎo)的發(fā)生在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)[10-11]。雖然該學(xué)說(shuō)被廣泛接受，但是其具體的發(fā)病機(jī)制仍然不明確，所以非常有必要繼續(xù)對(duì)NAFLD 的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究。

圖1 小鼠肝臟病理學(xué)變化 a、b分別為正常組、模型組，HE

圖2 miRNA芯片篩選小鼠肝臟miRNA差異表達(dá)的熱圖

圖3 miRNA-384在具有倍數(shù)變化的miRNA熱圖中的表達(dá)量

近幾年來(lái)，miRNA作為科學(xué)研究的重要工具，為疾病的診治提供了全新的手段[12]。同時(shí)miRNA在許多肝臟疾病中可以出現(xiàn)特異性改變，反映肝臟組織的病理改變，也可作為肝癌診斷的生物標(biāo)志物[13-15]。在脂類代謝中，miRNA作用于脂類合成、分解及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的靶基因，調(diào)控體內(nèi)脂類代謝[16]。不僅如此，miRNA數(shù)量或功能異常還通過(guò)干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，從而影響機(jī)體正常脂質(zhì)代謝, 促進(jìn)脂肪性肝病的形成[17]。

肝臟是動(dòng)物體內(nèi)重要的代謝器官，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，肝細(xì)胞中的miRNA表達(dá)變化能夠在一定程度上影響肝臟的代謝功能[18]。為了研究miRNA-384與NAFLD肝脂肪變性的關(guān)系，本課題組通過(guò)HFD構(gòu)建小鼠的NAFLD疾病模型，在造模成功后，觀察小鼠肝組織學(xué)變化。并且由微陣序列測(cè)序分析30種miRNA在NAFLD小鼠肝組織中的顯著變化。在這8個(gè)改變的miRNA中，miRNA-384具有顯著的倍數(shù)變化。同時(shí)，在小鼠給予HFD過(guò)程中，通過(guò)qPCR測(cè)量小鼠肝臟miRNA-384的表達(dá)水平，觀察到miRNA-384表達(dá)隨著時(shí)間推移而顯著上調(diào)。說(shuō)明miRNA-384在NAFLD中表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致肝脂肪變性。同時(shí)有相關(guān)研究[19-20]表明，miRNA的異常表達(dá)可能是通過(guò)參與調(diào)控脂質(zhì)的合成、脂質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)以及改變肝星狀細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)脂肪肝、肝纖維化的形成，但是具體的調(diào)控機(jī)制仍然不明確。

綜上所述，本研究表明miRNA-384表達(dá)的上調(diào)與肝脂肪變性有著密切關(guān)系，但是其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

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ChangesinmicroRNAexpressionprofileintheliverofmicewithnonalcoholicfattyliverdiseaseinducedbyhigh-fatdiet

MAIJingyin,CHENTianyang,CHENGYang.

(PudongNewAreaHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201299,China)

ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-384 (miR-384) expression on hepatic steatosis in mice with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced by high-fat diet (HFD).MethodsA total of 30 male C57BL/6J mice were fed for 7 days to adapt to the environment and then randomly divided into 2 groups, with 15 mice in each group. The mice in the control group were given normal diet, and those in the model group were given HFD for 8 weeks and then the liver tissue was harvested. HE and Nile red staining were used to observe the pathological changes of the liver. Microarray sequencing was performed to determine the whole-genome miRNA expression profile of liver tissue, and PCR was used to measure the relative expression of miR-384. Thet-test was used for the comparison of continuous data between groups.ResultsIn the control group, the liver was red with sharp edges, the lobular structure was clear, and there was no hepatic steatosis; in the model group, the liver was yellow with blunt edges, and the hepatocytes were swollen with a large number of fat vacuoles in the cytoplasm and nuclear deviation caused by the fusion of lipid droplets. Compared with the normal mice, the NAFLD mice had 12 upregulated miRNAs and 18 downregulated miRNAs in liver tissue. Some of the differentially expressed miRNAs between the control group and the model group were screened to obtain the same cluster diagram. Among the 8 miRNAs with significant changes, miR-384 showed a significant fold change.ConclusionThe upregulation of miR-384 is closely associated with hepatic steatosis, but its mechanism still needs further study.

nonalcoholic fatty liver disease; microRNAs; gene expression; high fat diet; mice, inbred C578BL

R575.5

A

1001-5256(2017)12-2372-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.023

2017-08-18；修回日期：2017-09-26。 基金項(xiàng)目：上海浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃(PWRd2016-01)；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(201540181) 作者簡(jiǎn)介：麥靜愔(1979-)，女，副主任醫(yī)師，博士，從事中西醫(yī)結(jié)合臨床和基礎(chǔ)研究。

引證本文：MAI JY, CHEN TY, CHENG Y. Changes in microRNA expression profile in the liver of mice with nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2372-2375. (in Chinese)

麥靜愔， 陳天陽(yáng)， 成揚(yáng). 高脂飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝臟microRNA表達(dá)譜的變化分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(12): 2372-2375.

(本文編輯：王 瑩)