郭香琴， 蔡 娜， 楊善彬， 周石洋， 陳意心， 柯道瑤

(1. 重慶師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 重慶 401331; 2. 重慶師范大學(xué) 活性物質(zhì)生物技術(shù)教育部工程研究中心， 重慶 401331)

研究報(bào)告—生物質(zhì)天然活性成分

超聲波輔助提取銀杏落葉中多糖的工藝初探

郭香琴1,2， 蔡 娜1， 楊善彬1,2*， 周石洋1,2， 陳意心1， 柯道瑤1

(1. 重慶師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 重慶 401331; 2. 重慶師范大學(xué) 活性物質(zhì)生物技術(shù)教育部工程研究中心， 重慶 401331)

以銀杏落葉為原料，采用超聲波輔助水提醇沉的方法提取銀杏落葉中的多糖，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法對銀杏落葉中多糖提取的工藝進(jìn)行初探。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為5.0 g銀杏落葉粗粉，超聲波功率600 W，液料比40∶1(mL∶g)，提取溫度84 ℃，提取時(shí)間50 min,多糖提取得率6.61 %。由于本研究只是對銀杏落葉中多糖提取工藝的初步研究，因此選擇提取的液料比時(shí)未深入考慮“少量多次，總液比盡量少”的提取原則。

銀杏落葉；多糖；超聲波提?。豁憫?yīng)曲面法

銀杏(GinkgobilobaLinn)又名白果樹、公孫樹，其葉、果、樹皮均可入藥，尤以葉的藥用價(jià)值最高[1]，是一種很有藥用價(jià)值和醫(yī)藥開發(fā)前景的植物[2-3]。近年來，有研究表明銀杏葉中的多糖(GBLP)具有延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生物活性，在生物農(nóng)藥和醫(yī)藥方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[4]。世界各國也相繼推出各種各樣的藥物制劑、保健食品、化妝品等。因此，銀杏葉越來越受各國相關(guān)行業(yè)廠家的青睞。然而，廠家從銀杏葉中提取多糖類化合物一般是采摘春、夏季生長旺盛的葉片，對于秋冬季的落葉，一般不予采用。據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，全國每年約有7 500 t的銀杏落葉被廢棄[5]。如果能對銀杏落葉中的多糖類物質(zhì)進(jìn)行提取，進(jìn)而開發(fā)成產(chǎn)品，就能夠變廢為寶。當(dāng)前銀杏多糖的研究主要是關(guān)于銀杏外種皮中多糖的提取[6]，已報(bào)道的提取方法主要有水提醇沉法[7-8]，在銀杏提取液中加入1～ 4倍乙醇，使醇不溶物及多糖靜置沉降而達(dá)到分離純化目的，但此方法提取率較低。超聲波輔助提取技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，破壞植物藥材的細(xì)胞，使溶劑滲透到藥材細(xì)胞中，該方法可縮短提取時(shí)間，提高提取得率。利用超聲波輔助提取銀杏落葉中多糖的方法未見報(bào)道。因此，本研究采用超聲波輔助水提醇沉的方法，以水為溶劑，在單因素分析的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面法研究浸取溫度、浸取時(shí)間和料液比3個(gè)因素對銀杏落葉中多糖提取得率的影響，對最佳提取工藝進(jìn)行初探，為開發(fā)利用銀杏落葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

銀杏落葉于2013年11月采集于重慶師范大學(xué)校園，通過清水洗凈、自然晾干后，于50 ℃烘干2 h，粉碎，保存?zhèn)溆?。無水乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠。SCQ-70型超聲波，上海聲彥超聲波儀器有限公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)，島津儀器有限公司。

1.2 銀杏落葉提取工藝流程

以蒸餾水為萃取劑，超聲波功率600 W，設(shè)置適當(dāng)?shù)囊毫媳?、超聲波提取時(shí)間、溫度。提取后經(jīng)離心機(jī)5 000 r/min離心10 min后收集上清液，殘?jiān)霸偬崛?次，合并兩次上清液。向上清液中加入適量活性炭，一段時(shí)間后真空抽濾。向?yàn)V液中加入一定體積的無水乙醇,在冰箱內(nèi)靜置24 h。對無水乙醇沉淀的絮狀多糖沉淀進(jìn)行離心。用無水乙醇洗滌多糖沉淀，然后將洗滌后的沉淀放入50 mL小燒杯中，放在水浴鍋中蒸干，放入50 ℃烘箱中干燥后得到多糖粗品。

1.3 定量分析

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取烘干至質(zhì)量恒定的無水葡萄糖0.500 0 g于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解稀釋至刻度。用移液管吸取此溶液1 mL于50 mL容量瓶中，稀釋定容，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后精密移取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL至10 mL具塞試管中，補(bǔ)加水至2 mL后加0.6 %苯酚1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻冷卻，置室溫下放置10 min，然后用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm 處測吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度(C，g/L)對吸光度(A)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.012 14C+0.067(R2=0.995 49)。方程在葡萄糖質(zhì)量濃度0.002 5～0.01 g/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.3.2銀杏落葉多糖含量的測定及多糖提取得率的計(jì)算 稱取100 mg 按1.2節(jié)制得的銀杏落葉多糖粗品置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解稀釋至刻度。精密吸取此樣品溶液1.0 mL至50 mL容量瓶，稀釋至刻度，即得多糖樣品溶液。多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[9]：移取0.6 mL多糖樣液置于10 mL具塞管中,加水至2 mL，加入0.6 %苯酚1 mL和濃硫酸 5 mL，搖勻并冷卻，在室溫中放置10 min，使用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算得到葡萄糖質(zhì)量濃度。按照下式計(jì)算多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P，%)：

式中：C—回歸方程中葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；D—樣品溶液稀釋倍數(shù)；F—換算因子(經(jīng)試驗(yàn)，F(xiàn)=0.91)；V—溶液體積，mL；m1—多糖樣品質(zhì)量，mg。

提取得率(Y,%)則按下式計(jì)算：

式中：C′—溶液中多糖質(zhì)量濃度，由葡萄糖質(zhì)量濃度換算得到，g/L；V—銀杏葉多糖樣品稀釋定容后的體積，mL；m2—銀杏落葉質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對提取率的影響

2.1.1液料比 取5份5 g銀杏落葉樣品分別置于250 mL具塞三角瓶中, 按液料比10∶1(mL∶g，下同)、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1分別加入 50、100、150、200、250 mL 的蒸餾水，于 80 ℃溫控下，進(jìn)行超聲波處理。超聲波功率 600 W，超聲波提取時(shí)間 40 min，提取2次，合并提取液。測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)并計(jì)算提取得率，結(jié)果見圖1(a)。

由圖1(a)可知，多糖的提取得率隨液料比的增加先增大后減小，當(dāng)液料比為 30∶1時(shí)，提取得率達(dá)最大值 4.3 %，可能是液料比較小時(shí)，多糖溶出不完全；液料比較大時(shí)，溶液量過多，超聲波輻射又被溶液大量吸收，不能完全作用于物料，從而影響多糖提取得率[10]。一般情況下，在保證提取率的前提下，液料比越低越好。因本研究只是對銀杏落葉中多糖的提取工藝的初步探究，并未對該提取原則進(jìn)行深入考察。鑒于液料比過大，會(huì)給后續(xù)處理帶來麻煩，造成資源和能源的浪費(fèi)，后續(xù)研究會(huì)在此提取條件的基礎(chǔ)上深入考察最低液料比。

2.1.2溫度 取5份5 g銀杏落葉樣品分別放于250 mL具塞三角瓶中，按液料比30∶1加入蒸餾水，超聲波功率600 W，分別在70、75、80、85和90 ℃中提取40 min，提取2次然后合并提取液，測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)并計(jì)算提取得率，結(jié)果如圖1(b)所示。

由圖1(b)可知，隨著溫度的升高多糖提取得率先逐漸升高，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，多糖提取得率最高，可達(dá)6.4%。超過80 ℃以后提取得率下降，可能是由于溫度過高，多糖發(fā)生了降解，說明此時(shí)條件不利于多糖的提取[11]，因此本研究的最佳提取溫度為80 ℃。

2.1.3提取時(shí)間 取5份5 g銀杏落葉樣品分別置于250 mL具塞三角瓶中，按液料比30∶1,分別加入150 mL蒸餾水，于80 ℃溫控下進(jìn)行超聲波處理，超聲波功率600 W，超聲波提取時(shí)間分別為10、20、30、40和50 min，提取2次，合并提取液，測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)并計(jì)算提取得率 ,結(jié)果見圖1(c)。由圖1(c)可知,隨著超聲波處理時(shí)間的延長多糖提取得率先逐漸增加，10～30 min時(shí)，提取得率呈緩慢增加趨勢，40 min 時(shí)提取得率達(dá)最大值 4.2 %。40 min 后，提取得率反而呈下降趨勢。可能是由于超聲波處理時(shí)間較短，多糖溶出量較低，因此提取得率也較低；而后隨超聲波處理時(shí)間延長，細(xì)胞破碎程度越來越大，多糖溶出量也就越來越高；當(dāng)時(shí)間大于 40 min時(shí)，細(xì)胞壁進(jìn)一步破碎，溶解雜質(zhì)相應(yīng)增加，影響多糖的測定效果，所以多糖提取得率略呈下降趨勢。

圖1 不同提取條件對多糖提取得率的影響Fig. 1 Effect of different conditions on extraction yield of polysaccharide

2.2 響應(yīng)曲面法確定多糖提取最佳工藝條件

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對多糖提取得率有顯著影響的提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素，分別以X1、X2、X3為代表，以多糖提取得率為響應(yīng)值(Y)，采用3因素3水平Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對銀杏落葉多糖提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表2 回歸模型方差分析

由圖2可知，溫度對試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，表現(xiàn)為曲面最陡，液料比的影響次之，提取時(shí)間的影響最小，與上述方差分析結(jié)果一致。此外，由方差分析及圖2 可知，3因素之間的相互作用很小，X1X2、X2X3間的相互作用對試驗(yàn)結(jié)果影響很小。經(jīng) Design-Expert 8.0.5軟件分析得出的最佳理論提取方案為: 提取溫度83.93 ℃，提取時(shí)間50.00 min，液料比40∶1(mL∶g)，銀杏落葉多糖的理論提取得率為6.72 %?？紤]到實(shí)際操作的局限性，將銀杏落葉的提取條件設(shè)為84 ℃，提取時(shí)間50.00 min，液料比40∶1。由于本研究只是對銀杏落葉中多糖提取工藝研究的初步探究，因此在單因素試驗(yàn)關(guān)于選擇提取的液料比時(shí)未深入考慮選用“少量多次，總液比盡量少”的提取原則。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，得到銀杏落葉的多糖提取得率為6.61 %。

圖2 響應(yīng)曲面圖Fig. 2 Response surfaces plots

3 結(jié) 論

采用單因素試驗(yàn)法和響應(yīng)曲面法對超聲波輔助提取銀杏落葉中多糖的工藝進(jìn)行了初探，確定了多糖提取的最佳工藝條件為：以蒸餾水為提取劑，超聲波輔助提取，銀杏落葉5 g, 超聲波功率600 W, 提取溫度84 ℃，液料比40∶1(mL∶g)，超聲波提取時(shí)間50 min，在此條件下多糖提取得率可達(dá)6.61 %。本實(shí)驗(yàn)只是對銀杏落葉中多糖提取工藝研究的初步探究，在單因素試驗(yàn)選擇液料比時(shí)未深入考慮選用“少量多次，總液比盡量少”的提取原則。鑒于實(shí)驗(yàn)室小試最終回歸產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提取的液料比過大會(huì)消耗更多的能源，不利于產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際使用。因此，本課題組會(huì)在后續(xù)的研究中考慮“多次提取+總液比盡量少”這一原則。

[1]陳金娥,匡強(qiáng)明,張海容. 正交優(yōu)化-微波輔助提取銀杏葉黃酮[J]. 光譜實(shí)驗(yàn),2011,28(2):623- 626.

[2]宋麗艷,于榮敏,馬文霞,等. 銀杏細(xì)胞培養(yǎng)物多糖與銀杏葉多糖生物活性研究[J]. 中國生化藥物雜志,1999,20(5):217-218．

[3]侯華新,黎丹戎,黃桂寬,等. 銀杏葉多糖在腫瘤放射化學(xué)治療中的增敏作用研究[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,22(1):29-31．

[4]XU A H,CHEN H S,SUN B C,et al.Therapeutic mechanism ofGinkgobilobaexocarp polysaccharides on gastric cancer[J]. World Journal of Gastroenterology,2003,9(11):2424-2427.

[5]姚鑫,周桂生,唐于平,等. 銀杏落葉化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(10):1377-1381.

[6]WANG Q,ZOU J,WEN Q B. Extraction of polysaccharide fromGinkgobilobaseed by ultrasonicwave[J]. Food and Fermentation Industries,2006,32(1):126-128.

[7]王敏,呂鳳霞,陸兆新,等. 銀杏葉多糖提取及超濾工藝的研究[J]. 中國中藥雜志,2007,32(15):1589-1591.

[8]姜波,王艷穎,劉長建,等. 銀杏葉多糖提取、純化及其含量的測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥,2007,18(11):2729-2731.

[9]張青,張?zhí)烀? 苯酚-硫酸比色法測定多糖含量[J]. 山東食品科技,2004,6(7):168-170.

[10]張林濤,張鋒,王志祥,等． 銀杏葉黃酮提取工藝的優(yōu)化[J]. 中國藥物警戒,2011,8(3):65-71.

[11]禹文峰,任鳳蓮,吳曉斌. 百合多糖的超聲波提取工藝研究[J]. 廣州化學(xué),2007,32(2):36-40.

Preliminary Research on Ultrasonic Assisted Extraction Technologyof Polysaccharides in Ginkgo biloba Leaves

GUO Xiangqin1,2, CAI Na1, YANG Shanbin1,2, ZHOU Shiyang1,2, CHEN Yixin1, KE Daoyao1

(1. College of Chemistry,Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China; 2. Engineering Research Center of Biotechnology of Active Substances(Ministry of Education) in Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

Polysaccharide was extracted fromGinkgobilobafallen leaves by ultrasound-assisted water extraction and alcohol precipitation. The extraction technology was preliminarily studied by single factor and response surface method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：G.bilobafallen leaves 5.0 g, ultrasound power 600 W, liquid/solid ratio 40∶1(mL∶g), extraction temperature 84 ℃, extraction time 50 min, the final polysaccharide yield was 6.61 %. Because this study was only a preliminary study on the extraction process of polysaccharides from the leaves ofGinkgobiloba, the extraction principle of “small amount of times and total liquid ratio is less” was not considered.

Ginkgobilobafallen leaves;polysaccharide;ultrasonic extraction;response surface method

TQ35

A

1673-5854(2017)06- 0043- 05

10.3969/j.issn.1673-5854.2017.06.008

2016-10-16

活性物質(zhì)生物技術(shù)教育部工程研究中心開放基金項(xiàng)目(20150408,AS201607)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510637085);重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CXTDX201601018)

郭香琴(1991— )，女，重慶人，碩士生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程；E-mail1072271995@qq.com

*

楊善彬，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)、制藥工程；E-mailshanbiny@126.com。