黃艷妮，趙祥祥，張亞利，程功

硫化氫對心肌缺血/再灌注損傷炎癥因子的影響

黃艷妮1，趙祥祥1，張亞利1，程功2

目的觀察硫化氫（H2S）對心肌缺血/再灌注損傷的影響。方法24只SD大鼠隨機分為A組、B組和C組，各8只，構(gòu)建Langendorff離體大鼠心臟灌注模型，分別予以KH液、KH液+NaHS（由HCl和Na2S臨用前配制，濃度為1 μM）和STH液進行灌注。在T0（手術開始前30 min）、T1（心臟停搏后15 min）、T2（心臟停搏后30 min）、T3（心臟復跳后15 min）、T4（心臟復跳后30 min）時，采用ELISA法測定灌流液中低氧誘導因子-1α（HIF-1α）及白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達情況。H9C2心肌細胞分為組1、組2和組3，分別予KH液、KH液+NaHS、STH液保存6 h后恢復室溫，ELISA法檢測細胞上清中HIF-1α、IL-6、IL-10和TNF-α表達。結(jié)果與術前比較，停搏后各組心肌HIF-1α表達均有所下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與A組和C組比較，B組HIF-1α的表達在T2、T3和T4各時間點均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與術前比較，各組大鼠心臟停搏后IL-6、IL-10以及TNF-α的表達均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。B組IL-6、IL-10以及TNF-α的表達在T2、T3和T4各時間點均低于A組和C組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與組1、組3相比，組2細胞上清的HIF-1α表達明顯升高，IL-6、IL-10、TNF-α的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。結(jié)論硫化氫降低心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應水平，增加HIF-1α的表達，發(fā)揮心肌保護作用。

硫化氫；缺血/再灌注；炎癥因子；心?。淮笫?/p>

目前心臟的冷保存時間僅為4～8 h，更長時間的缺血保存會嚴重影響移植后受體的生存質(zhì)量。Eric等[1]發(fā)現(xiàn)將小鼠置于不同濃度（0～80 ppm）的硫化氫（H2S）氣體中，小鼠出現(xiàn)了類假死現(xiàn)象。大鼠離體心臟的保存中，發(fā)現(xiàn)應用H2S的心臟保存KH液與臨床應用的STH液保存效果相近，作用機制與K+-ATP通道開放有關[2]。低氧誘導因子1α（HIF-1α）具有心肌保護作用，Mark等[3]發(fā)現(xiàn)在線蟲體內(nèi)，H2S可以引起HIF-1α的表達升高。本研究通過Langendorff離體灌注大鼠心臟和體外細胞培養(yǎng)，探究HIF-1α在H2S離體大鼠供體心臟保護作用中的作用通路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑陜西有限公司）；HIF-1α、IL-6、IL-10、TNF-α Elisa試劑盒（R&D公司）；DMEM、胎牛血清、胰酶（GIBCO公司）。LE-4250型Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)（Panlab公司）；WATER JACKET二氧化碳培養(yǎng)箱（日本ASTEC公司）；BSC-1600IIA2生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；Synergy2 多功能酶標儀（美國BioTek儀器有限公司）。H9C2心肌細胞（上海北諾生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠24只，體重（280±20）g，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（陜）2012-0014。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制 ①KH液：所含成分以mmol/L計，分別為NaCl 118.5，KCl 4.7，CaCl222.5，NaHCO325，MgSO41.2，KH2PO41.2，葡萄糖11，調(diào)節(jié)pH至7.3～7.4。②STH液：所含成分以mmol/L計，分別為NaCl 120，KCl 16，CaCl222.5，NaHCO310，MgCl216.6，調(diào)節(jié)pH至7.8。

1.3.2 Langendorff模型制備及動物分組 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，固定于操作臺。打開胸腔分離心臟，在主動脈距起始部3～4 mm處剪斷，立即置于裝有4℃冷KH液的培養(yǎng)皿中洗凈殘血，找到主動脈斷端套入Langendorff灌流系統(tǒng)的主動脈套管并固定，立即灌注持續(xù)充以95% O2和5%CO2混合氣體的KH液，在右心耳處剪一小口，以便流出冠狀動脈回流液，建立Langendorff離體心臟灌注模型。24只大鼠隨機分為A組、B組和C組，每組8只，分別采用KH液、KH液+NaHS（由HCl和Na2S臨用前配制，濃度為1μM）和STH液進行灌注。在T0（手術開始前30 min）、T1（心臟停搏后15 min）、T2（心臟停搏后30 min）、T3（心臟復跳后15 min）、T4（心臟復跳后30 min）時，采用ELISA法測定灌流液中HIF-1α及炎性因子白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達情況。

1.3.3 細胞培養(yǎng)及分組 H9C2心肌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的H9C2細胞，胰酶消化后調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，接種于培養(yǎng)皿中，隨機分為3組（組1、組2和組3），棄去培養(yǎng)基，分別予以4℃KH液、KH液+NaHS（1μM）和STH液保存6 h后恢復至室溫。

1.4 ELISA法測定相關指標 檢測上清中HIF-1α及炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α的表達。按試劑盒的說明書操作，簡述步驟如下：加樣、溫育、洗滌，加酶、溫育、洗滌，顯色，終止反應，測定OD值。根據(jù)制備的標準曲線，計算樣本含量。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌HIF-1α的表達情況 與術前比較，停搏后各組大鼠心肌HIF-1α表達均有所下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與A組和C組比較，B組HIF-1α的表達在T2、T3和T4各時間點均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），表1。

2.2 各組大鼠離體心臟炎性因子的表達變化 與術前比較，各組大鼠心臟停搏后IL-6、IL-10以及TNF-α的表達均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。B組加入NaHS后，IL-6、IL-10以及TNF-α的表達在T2、T3和T4各時間點均低于A組和C組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），表2～表4。

2.3 各組H9C2心肌細胞測定結(jié)果與組1、組3相比，組2細胞上清的HIF-1α表達明顯升高，IL-6、IL-10、TNF-α的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），表5。

表1 各組大鼠心肌HIF-1α的表達情況（ng/ml）

表2 各組IL-6的表達（pg/ml）

表3 各組IL-10的表達（pg/ml）

表4 各組TNF-α的表達（ng/ml）

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，H2S是血液和組織內(nèi)生理存在的，并可內(nèi)源性產(chǎn)生；哺乳動物內(nèi)源性H2S合成酶被發(fā)現(xiàn)；H2S被發(fā)現(xiàn)可以抑制中性粒細胞粘附性及活性[4-6]。

H2S的作用機制包括開放K+-ATP通道，激活蛋白激酶C，抑制線粒體呼吸功能，激活Erk和Akt，減少細胞色素C釋放，誘導COX-2，Hsp90，Hsp70，Bcl-2，Bcl-xL等表達，調(diào)整細胞保護基因Nrf-2活性等。Elrod等[7]發(fā)現(xiàn)H2S可以改善缺氧復氧處理后線粒體的功能。心臟缺血動物模型證實了H2S使K+-ATP通道開放的作用機制[8]，其后又采用類似的方法證實了H2S激活PKC，Erk和Akt，誘導COX-2等作用機制[9-11]。Yao等[12]采用乳鼠心肌細胞模型，發(fā)現(xiàn)H2S通過使GSK-3beta去磷酸化等機制減少缺氧復氧細胞凋亡。通過離體心臟缺血再灌注模型研究，Ji[13]和Zhang[14]發(fā)現(xiàn)H2S通過開放K+-ATP通道從而提高心功能恢復，減少心律失常，減少凋亡和梗死面積。應用離體心臟復蘇模型，Minamishima[15]認為H2S可以保護線粒體功能，減輕氧自由基產(chǎn)生，激活NO合成酶3。Sivarajah[16,17]在大鼠的心肌缺血再灌注研究中，證實H2S可以減少心肌梗死面積，作用機制為抑制p38MAPK和NF-κB活性。Calvert[18]發(fā)現(xiàn)H2S預處理可以減少缺血再灌注鼠的心肌梗死面積，增加心肌收縮力，其機制包括激活Nrf-2，增加HO-1、硫氧還蛋白1等抗氧化物表達，上調(diào)Hsp90 、Hsp70、Bcl-2、Bcl-xL和COX-2。在離體大鼠供體心臟的長期保存中，將H2S加入到無心臟保存作用的KH液中，發(fā)現(xiàn)H2S使KH液對供體心臟具有良好的保存效果，其效果與目前常用的心臟保存液STH液相當。其后又有研究[19]發(fā)現(xiàn)H2S在動物模型體外循環(huán)心肺轉(zhuǎn)流中具有保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)停搏后離體大鼠心肌HIF-1α表達下調(diào)，加入1μM NaHS（外源性H2S供體）可以降低心肌HIF-1α表達的下調(diào)幅度，同時可以下調(diào)IL-6、IL-10以及TNF-α的表達。HIF-1由缺氧誘導產(chǎn)生，能與促紅細胞生成素（EPO）基因上的缺氧反應元件（HRE）結(jié)合，從而促進其轉(zhuǎn)錄[20]。HIF-1由α和β兩個亞單位組成，兩個亞單位聚合后才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。HIF-1對凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用。在急性缺氧時，HIF-1可減少細胞凋亡的發(fā)生，對細胞有保護作用，在缺血再灌注損傷時可提高細胞的存活率。

H2S和HIF-1α均對心肌具有保護作用，二者之間是否具有內(nèi)在聯(lián)系，H2S的心肌保護作用是否由HIF-1α介導？有研究發(fā)現(xiàn)H2S可以獨立引起漂亮新小桿線蟲體內(nèi)HIF-1α的表達增加。HIF-1α參與了低氧環(huán)境下H2S的血管生成作用。在以上研究的基礎上，HIF-1α很可能參與了H2S的心臟保護作用。

表5 各組H9C2心肌細胞HIF-1α、IL-6、IL-10、TNF-α的表達（n=3）

[1]Satterly SA,Salgar S,Hoffer Z,et al. Hydrogen sulfide improves resuscitation via non-hibernatory mechanisms in a porcine shock model[J]. J Surg Res,2015,199(1):197-210.

[2]Hu X,Li TS,Jin Z,et al. Possible role of hydrogen sulfide on the preservation of donor rat hearts[J]. Transplant Proc,2007,39(10):3024-9.

[3]Budde MW,Roth MB. Hydrogen Sulfide Increases Hypoxiainducible Factor-1 Activity Independently of von Hippel-Lindau Tumor Suppressor-1 in C. elegans[J]. Molecular Biology of the Cell,2010,21(1):212-7.

[4]Kimura H. Hydrogen sulfide: from brain to gut[J]. Antioxidants &Redox Signaling,2010,12(9):1111-23.

[5]Whiteman M,Perry A,Zhou Z,et al. Phosphinodithioate and Phosphoramidodithioate Hydrogen Sulfide Donors[J]. Handb Exp Pharmacol,2015,230:337-63.

[6]Yuan B,Tang WH,Lu LJ,et al. TLR4 upregulates CBS expression through NF-κB activation in a rat model of irritable bowel syndrome with chronic visceral hypersensitivity[J]. World J Gastroenterol,2015,2 1(28):8615-28.

[7]Dai SH,Chen T,Wang YH,et al. Sirt3 attenuates hydrogen peroxideinduced oxidative stress through the preservation of mitochondrial function in HT22 cells[J]. Int J Mol Med,2007,104(39):15560-5.

[8]Calvert JW,Jha S,Gundewar S,et al. Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through Nrf2 signaling[J]. Circ Res,2009,105(4):365-74.

[9]Hu Y,Chen X,Pan TT,et al. Cardioprotection induced by hydrogen sulfide preconditioning involves activation of ERK and PI3K/Akt pathways[J]. Pflugers Archiv : European journal of physiology,2008,455(4):607.

[10]Nakano S,Ishii I,Shinmura K,et al. Hyperhomocysteinemia abrogates fasting-induced cardioprotection against ischemia/reperfusion by limiting bioavailability of hydrogen sulfide anions[J]. J Mol Med (Berl),2015,93(8):879-89.

[11]Li H,Zhang C,Sun W,et al. Exogenous hydrogen sulfide restores cardioprotection of ischemic post-conditioning via inhibition of mPTP opening in the aging cardiomyocytes[J]. Cell Biosci,2015,5:43.

[12]Yao LL,Huang XW,Wang YG,et al. Hydrogen sulfide protects cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis by preventing GSK-3beta-dependent opening of mPTP[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,298(5):H1310-9.

[13]Peake BF,Nicholson CK,Lambert JP,et al. Hydrogen sulfide preconditions the db/db diabetic mouse heart against ischemiareperfusion injury by activating Nrf2 signaling in an Erk-dependent manner[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2013,304(9):H1215-24.

[14]Zhang Z,Huang H,Liu P,et al. Hydrogen sulfide contributes to cardioprotection during ischemia-reperfusion injury by opening K ATP channels[J]. Can J Physiol Pharmacol,2007,85(12):1248-53.

[15]Minamishima S,Bougaki M,Sips PY,et al. Hydrogen sulfide improves survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation via a nitric oxide synthase 3-dependent mechanism in mice[J]. Circulation,2009,120(10):888-96.

[16]Sivarajah A,Collino M,Yasin M,et al. Thiemermann, Anti-apoptotic and anti-inflammatory effects of hydrogen sulfide in a rat model of regional myocardial I/R[J]. Shock, 2009,31(3):267-74.

[17]Sivarajah A,McDonald MC,Thiemermann C,et al. The production of hydrogen sulfide limits myocardial ischemia and reperfusion injury and contributes to the cardioprotective effects of preconditioning with endotoxin, but not ischemia in the rat[J]. Shock,2006,26(2):154-61.

[18]Calvert JW,Jha S,Gundewar S,et al. Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through Nrf2 signaling[J]. Circ Res,2009,105(4):365-74.

[19]Szabó G,Veres G,Radovits T,et al. Cardioprotective effects of hydrogen sulfide[J]. Nitric Oxide,2011,25(2):201-10.

[20]Xu G,Xue M,Wang H,et al. Hypoxia-inducible factor-1α antagonizes the hypoxia-mediated osteoblast cell viability reduction by inhibiting apoptosis[J]. Exp Ther Med,2015,9(5):1801-6.

Influence of hydrogen sulfide on inflammatory factors after myocardial ischemia-reperfusion injury

Huang Yanni*, Zhao Xiangxiang, Zhang Yali, Cheng Gong.
*Department of Internal Medicine, People's Hospital of Zhouzhi County, Shaanxi Province, Zhouzhi 710400, China.
Corresponding author: Cheng Gong, E-mail: xianchenggong@163.com

ObjectiveTo observe the influence of hydrogen sulfide (H2S) on myocardial ischemia

reperfusion injury.MethodsSD rats (n=24) were randomly divided into groups A, B and C (each n=8), and model of Langendorff cardiac perfusion in vitro was established. The groups were given, respectively, perfusion of KH solution, KH solution+NaHS (prepared with HCl and Na2S just before using, 1μM) and STH solution. At the time points of T0 (30 min before the operation), T1 (15 min after asystole), T2 (30 min after asystole), T3 (15 min after heart resuscitation) and T4 (30 min after heart resuscitation), the expressions of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in perfusion solution were detected by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). H9C2 myocardial cells were divided into groups 1, 2 and 3, given, respectively, KH solution, KH solution+NaHS and STH solution, stored for 6 h and then recovered to room temperature. The expressions of HIF-1α, IL-6, IL-10 and TNF-α in cell supernatant were detected by using ELISA.ResultsThe expression of HIF-1α decreased in all groups after asystole compared with before (all P＜0.05). The expression of HIF-1α increased in group B compared with group A and group B at time points of T2, T3 and T4 (all P＜0.05). The expressions of IL-6, IL-10 and TNF-α increased in all groups after asystole compared with before (all P＜0.05). The expressions of IL-6, IL-10 and TNF-α were lower in group B than those in group A and group C at time points of T2, T3 and T4 (all P＜0.05). The expression of HIF-1α increased significantly, and expressions of IL-6, IL-10 and TNF-α decreased significantly in group 2 compared with group 1 and group 3 (all P＜0.05).ConclusionH2S can reduce inflammatory reactions, improve expression of HIF-1α and play a role of protecting myocardium in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.

Hydrogen sulfide; Ischemia-reperfusion; Inflammatory factors; Myocardium; Rats

R541.4

A

1674-4055(2017)11-1372-03

1710400 周至,周至縣人民醫(yī)院內(nèi)科;2710068 西安,陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科

程功,E-mail:xianchenggong@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.11.23

姚雪莉