陳良，蔣錦琪，馮輝，張穎

N-乙酰半胱氨酸預(yù)防硝酸酯耐藥的實驗效果及機制探討

陳良1，蔣錦琪1，馮輝1，張穎1

目的通過建立單硝酸異山梨醇酯（ISMN）耐藥動物模型，觀察N-乙酰半胱氨酸（NAC）對預(yù)防硝酸酯耐藥的實驗效果，分析相關(guān)機制。方法取成年雄性新西蘭大白兔32只，體質(zhì)量（2500±200）g，隨機分為對照組、常規(guī)組、耐藥組和NAC組，每組8只。對照組不予用藥；常規(guī)組經(jīng)胃管灌服ISMN 25 mg，1/d；耐藥組灌服ISMN 25 mg，1/12 h；NAC組同時灌服ISMN 25 mg和NAC 100 mg，1/12 h。7 d后處死所有實驗兔，取腹主動脈，每5 mm剪為數(shù)段，分別檢測血管環(huán)舒張反應(yīng)以及血管組織總巰基（T-SH，微量酶標(biāo)法）、超氧陰離子（O2-，化學(xué)比色法）、超氧化物歧化酶（SOD，黃嘌呤氧化酶法）、丙二醛（MDA，硫代巴比妥酸法）、內(nèi)皮素-1（ET-1，雙抗體夾心法）和亞硝酸鹽（NO2-，硝酸還原酶法）水平。結(jié)果隨著硝酸甘油（GTN）濃度的遞增，各組腹主動脈血管環(huán)的舒張幅度都呈現(xiàn)不同程度的增加。耐藥組血管環(huán)的舒張幅度均明顯小于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；而對照組、常規(guī)組和NAC組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。當(dāng)GTN濃度增至10-4mol/L時，對照組、常規(guī)組和NAC組的舒張幅度分別達到（98.91±1.99）%、（95.59±3.97）%和（93.18±6.36）%；而耐藥組僅達到（63.62±6.03）%，明顯低于其他3組。T-SH含量和SOD活力由高到低依次為對照組、NAC組、常規(guī)組和耐藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與之相反，O2-、MDA、ET-1和NO2-含量由高到低則依次為耐藥組、常規(guī)組、NAC組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論口服NAC可通過增加血管組織的巰基含量、抑制ISMN誘發(fā)的氧化應(yīng)激和縮血管物質(zhì)的生成來預(yù)防硝酸酯的耐藥性，進而充分發(fā)揮其擴血管效應(yīng)。

N-乙酰半胱氨酸；硝酸酯耐藥；5-單硝酸異山梨醇酯；巰基；氧化應(yīng)激；兔

1879年英國醫(yī)生Willian Murrell首次報道硝酸甘油可有效緩解心絞痛，至今已研發(fā)出包括硝酸甘油（GTN）、二硝酸異山梨醇酯（ISDN）、5-單硝酸異山梨醇酯（ISMN）和戊四硝酸醇酯（PETN）等一系列硝酸酯類藥物，并被廣泛應(yīng)用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、充血性心力衰竭、高血壓病等心血管疾病的治療。然而硝酸酯耐藥是困擾其臨床使用的主要問題。以往對硝酸酯耐藥的認(rèn)識大多基于GTN注射劑或貼劑的研究，而對于口服ISMN的研究則較少。Oelze等[1]曾通過動物研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用ISMN同樣可引起血管內(nèi)皮功能損傷、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮素-1的生成而誘發(fā)耐藥。而N-乙酰半胱氨酸（NAC）為活性巰基（-SH）的載體、還原型谷胱甘肽（GSH）的前體，具有顯著的抗氧化作用，能清除自由基、保護酶活性[2]。因此，本研究嘗試采用ISMN建立硝酸酯耐藥的動物模型，觀察口服NAC對硝酸酯耐藥的預(yù)防作用并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料與試劑

MPA 2000離體實驗系統(tǒng)、ALC-M恒溫組織浴槽由上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)。抗超氧及產(chǎn)生超氧陰離子自由基（·O2-）測試盒（20140114）、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（20140115）、丙二醛（MDA）測試盒（20140117）、一氧化氮（NO）試劑盒（20131231）和微量總巰基（T-SH）（A063）測試盒購于南京建成生物工程研究所，內(nèi)皮素-1（ET-1）放射免疫分析藥盒（S20083014，北京北方生物技術(shù)研究所），乙酰半胱氨酸顆粒（H20000472，海南贊邦制藥有限公司），單硝酸異山梨醇酯緩釋膠囊（H20031224，優(yōu)時比制藥有限公司），硝酸甘油注射液（H11020291，北京益民藥業(yè)有限公司）。K-H溶液配方：NaCl 130 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.17 mmol/L、KH2PO41.18 mmol/L、NaHCO314.9 mmol/L、CaCl21.6 mmol/L、Glucose 5.5 mmol/L、EDTA 0.026 mmol/L。

1.2 動物分組與用藥

取雄性新西蘭大白兔（由上海杰思捷實驗動物有限公司提供）32只，體質(zhì)量（2500±200）g，隨機分為4組：對照組、常規(guī)組、耐藥組和NAC組，每組各8只。對照組普通飼養(yǎng)，不予用藥；常規(guī)組每日固定時間經(jīng)胃管灌服ISMN（取膠囊內(nèi)小丸）25 mg，1/d，7 d；耐藥組于每日固定時間以同樣方法灌服ISMN 25 mg，1/12 h，共7 d；NAC組則于每日固定時間同時灌服ISMN 25 mg和NAC 100 mg，1/12 h， 共7 d。

1.3 取材與組織生化測定

干預(yù)7 d后處死所有實驗兔，取出由腎動脈遠(yuǎn)端至髂總動脈近端的腹主動脈段，將其剪成若干段，每段5 mm，其中1段用以血管環(huán)舒張反應(yīng)檢測，其余各段分別通過相應(yīng)的試劑盒進行組織T-SH（微量酶標(biāo)法）、·O2

-（化學(xué)比色法）、SOD（黃嘌呤氧化酶法）、MDA（硫代巴比妥酸法）、NO2-（硝酸還原酶法）和ET-1（雙抗體夾心ABC-ELISA法）測定，操作過程和計算方法嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進行。

1.4 血管環(huán)舒張反應(yīng)檢測

分別取各組實驗兔的5 mm長血管1段，一端與肌力傳感器相連，懸掛于盛有10 ml K-H溶液的ALC-M恒溫組織浴槽中（溫度37℃，pH=7.4），另一端施加2 g負(fù)荷，連續(xù)通入含95%·O2+5%CO2的混合氣體，平衡2 h，期間每30 min更換K-H溶液一次。平衡后通過MPA 2000離體實驗系統(tǒng)記錄血管環(huán)靜息張力值和收縮舒張曲線，繼而加入10-5mol/L的苯腎上腺素100 μL，使血管環(huán)激動收縮，當(dāng)其收縮最大張力值并在舒張反應(yīng)穩(wěn)定后依次加入10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L的GTN注射液，觀察記錄血管環(huán)的張力值，最后計算不同組別血管的舒張幅度百分比=（最大張力值－不同濃度GTN時的張力值）/（最大張力值－靜息張力值）×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS 8.1軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管環(huán)舒張反應(yīng)

隨著GTN濃度的遞增，各組腹主動脈血管環(huán)的舒張幅度都呈現(xiàn)不同程度的增加。耐藥組血管環(huán)的舒張幅度均明顯小于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；而對照組、常規(guī)組和NAC組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。當(dāng)GTN濃度增至10-4 mol/L時，對照組、常規(guī)組和NAC組的舒張幅度分別達到（98.91±1.99）%、（95.59±3.97）%和（93.18±6.36）%；而耐藥組僅達到（63.62±6.03）%，明顯低于其他三組，表1。

2.2 血管組織生化檢測結(jié)果

所有血管組織的生化檢測指標(biāo)中，T-SH含量和SOD活力由高到低依次為對照組、NAC組、常規(guī)組和耐藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與之相反，·O2-、MDA、ET-1和NO2-含量由高到低則依次為耐藥組、常規(guī)組、NAC組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），表2。

3 討論

硝酸酯是非內(nèi)皮依賴性的血管擴張劑，進入血管平滑肌細(xì)胞后，通過釋放NO刺激鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）濃度增加，降低細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，導(dǎo)致血管平滑肌舒張。在連續(xù)使用硝酸酯后發(fā)生的血液動力學(xué)和抗缺血效應(yīng)迅速減弱至消失的現(xiàn)象稱之為硝酸酯耐藥。隨著1888年美國醫(yī)生Stewart首次報道硝酸甘油耐藥以來，人們對硝酸酯耐藥的機制進行了廣泛的研究卻仍無定論。目前根據(jù)硝酸酯耐藥機制不同可分為[3]：①假性耐藥（神經(jīng)激素激活）：多發(fā)生于短期（1 d）連續(xù)使用后，可能與交感-腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等神經(jīng)激素的反向調(diào)節(jié)和血管容量增加有關(guān)；②真性耐藥（血管性耐藥）：長期（3 d以上）應(yīng)用硝酸酯后引起血管自身結(jié)構(gòu)和功能改變而產(chǎn)生耐藥；③交叉性耐藥：一種硝酸酯抑制或削弱其他硝酸酯或NO供體性血管擴張劑及內(nèi)源性NO等的作用。后二者的發(fā)生多與巰基耗竭、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)。

表1 不同濃度GTN時各組血管環(huán)的舒張幅度（%，n=8）

表2 各組實驗兔血管環(huán)生化檢測結(jié)果比較（n=8）

如何預(yù)防硝酸酯耐藥的發(fā)生，目前依然是個醫(yī)學(xué)難題，雖然做出了眾多嘗試[4-8]，如聯(lián)合使用卡維地洛、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑、他汀類藥物、肼苯噠嗪、維生素C、維生素E、葉酸、ET-1受體阻滯劑等，具有一定效果但仍不盡如人意[9]。雖然目前常采用間隙或偏心給藥來預(yù)防硝酸酯耐藥[3]，但仍無法實現(xiàn)對心血管的24 h全程保護。探索一種新的即可以改善硝酸酯耐藥又可以充分發(fā)揮其擴血管效應(yīng)的手段將成為解決硝酸酯耐藥的新方法，國外研究顯示鳥苷酸環(huán)化酶激活物BAY 60-2770可以部分改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，增加血管NO水平來改善硝酸酯耐藥[10]；松弛素可以通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，升高乙醛脫氫酶來發(fā)揮保護內(nèi)皮細(xì)胞，減輕或逆轉(zhuǎn)硝酸酯耐藥的效應(yīng)[11,12]。NAC作為一種含有巰基的抗氧化劑在呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)均具有重要的臨床價值，但其在改善硝酸酯耐藥性方面的研究還較少。

本研究采用每12 h給予ISMN的方式誘發(fā)硝酸酯耐藥。通過檢測各組實驗兔血管環(huán)在不同濃度GTN作用下的舒張反應(yīng)顯示，雖然各組血管均隨著GTN濃度的遞增而呈現(xiàn)舒張幅度的增加，但耐藥組的舒張幅度明顯低于對照組和常規(guī)組，這不僅證實了ISMN所致硝酸酯耐藥模型的確立，同時也提示了血管對GTN交叉耐藥的存在；而NAC組的舒張幅度明顯高于耐藥組，甚至接近于對照組和常規(guī)組，證明NAC能改善血管環(huán)的舒張活性、抑制硝酸酯耐藥的產(chǎn)生。在進行組織生化檢測后發(fā)現(xiàn)，服用硝酸酯的3組（以下合稱用藥3組）兔血管中T-SH含量及SOD活力均低于對照組，但NAC組T-SH含量及SOD活力高于耐藥組，這表明硝酸酯類藥物的應(yīng)用導(dǎo)致了血管組織-SH的消耗，且隨著用藥間隔的縮短致-SH消耗更為嚴(yán)重。NAC可以外源性補充活性-SH有效彌補血管組織中-SH的缺失，進而促進GSH的生成，清除H2O2恢復(fù)SOD活性。研究還發(fā)現(xiàn)，用藥3組的·O2-和MDA含量均顯著高于對照組，耐藥組O2-和MDA含量最高，提示硝酸酯的應(yīng)用誘發(fā)了組織氧化應(yīng)激的形成，導(dǎo)致·O2-生成增多，繼而誘發(fā)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA，且隨著用藥間隔的縮短更加劇了氧化應(yīng)激的程度，NAC可以通過恢復(fù)SOD活力，清除·O2-，減少MDA生成來減輕硝酸酯所帶來的負(fù)面效應(yīng)。結(jié)果中還顯示各組ET-1含量的變化與·O2-、MDA的變化平行，其間原因可能是氧化應(yīng)激的存在和程度決定了ET-1含量的高低。

此外，由于目前尚無法直接測定組織中的NO含量，僅能通過測定其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物NO2-/ NO3-以間接反映NO水平。本研究發(fā)現(xiàn)用藥3組的NO2-含量均高于對照組，尤以耐藥組最高，所以ISMN的生物轉(zhuǎn)化并未由于縮短用藥間隔而受到抑制，且其代謝產(chǎn)物隨著用藥頻次增加而增多。而所測NAC組的NO2-卻明顯低于耐藥組，甚至還略低于常規(guī)組，可能由于外源性-SH的補充加強了GSH的抗氧化活性，抑制了NO氧化為NO3-/ NO2-，故而未能被有效檢測到，因而出現(xiàn)NAC組NO2-含量較低而血管舒張反應(yīng)卻反而加強的現(xiàn)象。

綜前所述，本研究發(fā)現(xiàn)NAC可能通過提高血管組織-SH含量而有效抑制硝酸酯誘發(fā)的氧化應(yīng)激，恢復(fù)SOD活性、清除·O2-及其氧化產(chǎn)物、減少縮血管物質(zhì)的生成來改善血管的舒張功能，抑制或延緩硝酸酯耐藥的產(chǎn)生，從而更有效、更持久地發(fā)揮硝酸酯的擴血管和抗心肌缺血作用。但NAC是否能通過抑制NO氧化而延長其作用時間和效能，有待進一步研究。

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Experimental effect and mechanism of N-acetylcysteine in preventing nitrate resistance

Chen Liang*,Jiang Jinqi, Feng Hui, Zhang Ying.
*Emergency Department, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030, China.
Corresponding author: Jiang Jinqi, E-mail: 123jiangjq@sina.com

ObjectiveTo observe the experimental effect of N-acetylcysteine (NAC) in preventing nitrate resistance and analyze relevant mechanism through establishing an animal model of isosorbide-5-mononitrate(ISMN) resistance.MethodsMale adult New Zealand rabbits (n=32) with body mass=(2500±200) g were randomly divided into control group, routine group, drug-resistance group and NAC group (each n=8). The control group was not given any drugs, routine group was intragastrically given ISMN (25 mg/time) once a day, drugresistance group, ISMN (25 mg/time) once every 12 h, and NAC group, ISMN (25 mg/time) and NAC (100 mg) once every 12 h. All rabbits were executed after 7 d and the abdominal aorta was collected and cut into segments (5 mm) for detecting vascular ring relaxation response, and levels of total sulfhydryl (T-SH, micro enzyme standard method), superoxide anion (O2-, chemical colorimetry), superoxide dismutase (SOD, xanthine oxidase method),malondialdehyde (MDA, thiobarbituric acid method), endothelin-1 (ET-1, double antibody sandwich method),and nitrite (NO2-, nitric acid reductase method).ResultsAs the concentration of nitroglycerin (GTN) increased progressively, vascular ring relaxation amplitude of abdominal aorta increased in varying degrees in all groups. The vascular ring relaxation amplitude was lower in drug-resistance group than that in other 3 groups (all P＜0.01), and the difference among control group, routine group and NAC group had no statistical difference (all P＞0.05). When the concentration of GTN increased to 10-4mol/L, the vascular ring relaxation amplitude reached to (98.91±1.99)% in control group, (95.59±3.97) % in routine group, (93.18±6.36) % in NAC group, and only (63.62±6.03) %in drug-resistance group. The level of T-SH and SOD vitality showed a descending order in control group, NAC group, routine group and drug-resistance group (all P＜0.05). While the levels of O2-, MDA, ET-1 and NO2-showed a descending order in drug-resistance group, routine group, NAC group and control group (all P＜0.05).ConclusionOrally administrated NAC can prevent nitrate resistance and exert the effect of vascular dilation through increasing sulfhydryl level and inhibiting oxidative stress and generation of vasoconstrictive substance induced by ISMN.

N-acetylcysteine; Nitrate resistance; Isosorbide-5-mononitrate; Sulfhydryl; Oxidative stress; Rabbits

R541

A

1674-4055(2017)11-1334-04

中國醫(yī)師協(xié)會探索心血管研究基金(DFCMDA201431)

1200030 上海,上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院急診科

蔣錦琪,E-mail:123jiangjq@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.11.12

姚雪莉