劉麗梅，段立清,，蘇柳，馮淑軍

( 1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

四種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的毒力及3種酶活性的影響

劉麗梅1，段立清1,2，蘇柳2，馮淑軍1

( 1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

為給枸杞蚜蟲(chóng)Aphissp.的生物防治及新型殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，采用玻璃管藥膜法和廣口瓶密閉熏蒸法，分別測(cè)定4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺和熏蒸毒力，采用分光光度計(jì)法測(cè)定4種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)羧酸酯酶(CarE)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響。結(jié)果表明：羅勒Ocimumbasilicum，藿香Agastacherugosus，砂地柏Sabinavulgaris，薄荷Menthalongifolia精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺致死中濃度LC50分別為2.52，2.78，2.82，2.86 mL/L；熏蒸處理枸杞蚜蟲(chóng)24 h的熏蒸致死中濃度LC50依次為0.81，1.28，1.36，1.56 mL/L；4種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的毒殺作用顯著。4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)CarE、AChE和GSTs酶活性有不同程度的抑制作用，羅勒精油對(duì)CarE和GSTs的抑制作用強(qiáng)，藿香和沙地柏精油對(duì)AChE的抑制作用強(qiáng)。

枸杞蚜蟲(chóng)；精油；毒力；酶活性

枸杞Lyciumspp.為茄科枸杞屬多年生灌木，枸杞的果實(shí)、枝葉營(yíng)養(yǎng)豐富，易受多種病蟲(chóng)害的危害。枸杞蚜蟲(chóng)Aphissp.就是其中主要害蟲(chóng)，刺吸危害枸杞嫩葉、花蕾、幼果和生長(zhǎng)點(diǎn)，造成枸杞大量減產(chǎn)。蚜蟲(chóng)具有生活周期短、繁殖力強(qiáng)等特征，因而很難防治。目前，枸杞蚜蟲(chóng)的防治主要以化學(xué)藥劑為主，如高效氯氟氰菊酯[1]、3%啶蟲(chóng)脒[2]、阿維菌素[3]、10%吡蟲(chóng)啉與3%苯氧威[4]等。但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥使枸杞蚜蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性[5]，污染環(huán)境、影響食品安全[6]。

芳香植物精油是植物內(nèi)重要的次生物質(zhì)，其天然香氣成分有趨避、防治害蟲(chóng)的作用[7]。由于對(duì)人畜安全、不污染食物及環(huán)境、害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)備受關(guān)注。應(yīng)用芳香植物及精油防蟲(chóng)、驅(qū)蟲(chóng)在國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道。例如：Sampson等研究了23種精油對(duì)蘿卜蚜蟲(chóng)Lipaphispseudobrassicae的毒殺活性，均表現(xiàn)為很強(qiáng)的毒殺作用，其中薄荷Menthalongifolia精油的毒殺活性最強(qiáng)[8]。薄荷、百里香Thymusvulgaris2種精油對(duì)桃蚜Myzuspersicae的趨避效果均超過(guò)70%[9]，羅勒Ocimumbasilicum、丁香羅勒Ocimumgratissimum精油熏蒸處理四紋豆象Callosobruchusmaculatus成蟲(chóng)24 h，分別有80%和70%的成蟲(chóng)死亡[10]。羅勒和百里香精油對(duì)二斑葉螨TetranychusurticaeKoch和煙粉虱Bemisiatabaci(Genn)有明顯的觸殺作用[11]。藿香Agastacherugosus提取物對(duì)米象Sitophilusoryzae和綠豆象Callosobruchuschinensis有很強(qiáng)的觸殺作用[12]。用藜蘆堿[13]和外源茉莉酸誘導(dǎo)[14]等方法防治枸杞蚜蟲(chóng)也有一定效果，而芳香植物及其精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

羧酸酯酶(CarE)是昆蟲(chóng)體內(nèi)的重要解毒酶系[15]；乙酰膽堿酯酶(AChE)是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)藥劑的靶標(biāo)酶，該酶對(duì)藥劑敏感度的改變會(huì)影響到殺蟲(chóng)藥劑的毒力[16]；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系，參與許多分子的解毒機(jī)制[17]。目前關(guān)于薄荷、藿香、羅勒、砂地柏Sabinavulgaris精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)酶活性的影響還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，作者測(cè)定了4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺和熏蒸毒力及對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)離體CarE、AChE和GSTs活性的影響，為進(jìn)一步了解這4種精油的殺蟲(chóng)活性及殺蟲(chóng)作用機(jī)理，開(kāi)發(fā)環(huán)境友好、高效、安全的新型殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試?yán)ハx(chóng)枸杞蚜蟲(chóng)采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園的枸杞林，接于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)栽培的枸杞苗上培養(yǎng)待用。3種供試精油薄荷、藿香、羅勒購(gòu)于北京茂思商貿(mào)有限公司，砂地柏精油由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院提取。

供試藥劑固藍(lán)B鹽、硫代乙酰膽堿(ASCh)、5,5′-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)購(gòu)于Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白購(gòu)于Amresco公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、α-乙酸萘酯(α-NA)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；毒扁豆堿購(gòu)于Fluka公司；GSTs試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；丙酮、95%乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器有TU- 1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)( 北京普析通用儀器有限公司)，D- 78532 高速冷凍離心機(jī) ( 德國(guó)Hettich)，Sartorius BSS110S 電子天平( 北京塞多利有限公司)，HH-S 型恒溫水浴鍋 ( 武漢金寶華公司)，移液槍等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的生物活性測(cè)定

1.2.1.1 熏蒸作用 用廣口瓶密閉熏蒸法[18]進(jìn)行熏蒸毒力測(cè)定。以丙酮作為溶劑，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)將4種精油配置成0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL/L 6個(gè)濃度。挑取枸杞無(wú)翅蚜蟲(chóng)30頭放入125 mL的廣口瓶中，用微量移液槍移取不同濃度的精油10 μL滴于1 cm×4 cm的濾紙片上，使之懸于廣口瓶?jī)?nèi)，用封口膜密封；對(duì)照為丙酮。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，熏蒸24 h后記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，以毛筆撥動(dòng)蟲(chóng)體，無(wú)反應(yīng)者視為死亡。

1.2.1.2 觸殺作用 采用玻璃管藥膜法[19]測(cè)試4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺作用。以丙酮為溶劑將4種精油稀釋成1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，4.5，5.0 mL/L 6個(gè)濃度，分別吸1 mL于1.1 cm×8 cm的指形管內(nèi)，旋轉(zhuǎn)使液體在管內(nèi)壁成膜，對(duì)照管為丙酮，待丙酮揮發(fā)后進(jìn)行毒力測(cè)定。挑取枸杞無(wú)翅蚜蟲(chóng)30頭置于管內(nèi)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。4 h觀察記錄死亡蟲(chóng)數(shù)。

1.2.2 植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)3種離體酶的抑制作用測(cè)定

1.2.2.1 酶液和抑制劑制備 取枸杞蚜蟲(chóng)100頭，加入預(yù)冷的0.04 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液1 mL，于預(yù)冷玻璃勻漿器中冰浴勻漿，4 ℃下勻漿液12 000 rmp離心15 min，取上清液為CarE酶液。以相同方法，取200頭蚜蟲(chóng)用0.1 mol/L pH7.6的磷酸緩沖液制備AChE酶液；取200頭蚜蟲(chóng)用勻漿介質(zhì)(0.1 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液，0.01 mol/L 的Tris-HCl，0.000 1 mol/L的EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖和0.8%氯化鈉溶液)制備GSTs酶液。

取上述4種植物精油以丙酮為溶劑稀釋成0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL/L 6個(gè)濃度作為抑制劑。

1.2.2.2 對(duì)CarE抑制作用 參照 Van Aspern[20]的方法，抑制劑與CarE酶液以及α-NA構(gòu)成反應(yīng)體系，在 30 ℃水浴反應(yīng) 15 min 后加入顯色劑(1%固藍(lán) B 鹽與 5%十二烷基硫酸鈉( SDS) 溶液按2∶5比例混合)終止反應(yīng)，靜置5 min后在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)600 nm下測(cè)定吸光(OD)值。以丙酮為對(duì)照，每組重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算酶活性抑制率。

CarE活性抑制率(%)=(對(duì)照OD值-處理OD值)/對(duì)照OD值×100

1.2.2.3 對(duì)AChE抑制作用 參照Gorun[21]等的方法，抑制劑與AChE酶液以及硫代乙酰膽堿(ASCh)構(gòu)成反應(yīng)體系，在 30 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入DTNB終止反應(yīng)，靜置2 min后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在412 nm下測(cè)定OD值，以丙酮為對(duì)照。每組重復(fù)3次。

1.2.2.4 對(duì)GSTs抑制作用 取上述抑制劑，以丙酮為對(duì)照。按照GSTs試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每組重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理 毒力測(cè)定數(shù)據(jù)采用 POLO軟件處理，計(jì)算LC50、LC90值和95%置信區(qū)間、斜率以及自由度。將抑制劑的終濃度轉(zhuǎn)換成負(fù)對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)的抑制率的機(jī)率值作圖，計(jì)算出4種精油對(duì)CarE、AChE和GSTs的抑制中濃度(I50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的熏蒸作用 枸杞蚜蟲(chóng)對(duì)羅勒精油最敏感，羅勒精油熏蒸處理24 h對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的致死中濃度LC50值最小，為0.81 mL/L，其95%的置信區(qū)間0.65～0.98 mL/L，與薄荷精油1.25～1.96 mL/L、藿香精油1.04～1.56 mL/L和沙地柏1.12～1.65 mL/L之間均沒(méi)有覆蓋，說(shuō)明羅勒精油的熏蒸毒力與其他3種精油間存在極顯著差異，薄荷精油與藿香精油的置信區(qū)間覆蓋率小于50%，說(shuō)明二者存在顯著差異，藿香精油與沙地柏精油的置信區(qū)間覆蓋率大于50%，說(shuō)明2種精油間不存在差異，即枸杞蚜蟲(chóng)對(duì)薄荷精油的敏感性最低，熏蒸處理24 h其LC50值為1.56 mL/L。即4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的熏蒸毒力由大到小依次為羅勒、藿香、沙地柏、薄荷。4種精油的回歸斜率有一定差異，枸杞蚜蟲(chóng)個(gè)體對(duì)羅勒精油的敏感性差異較小(表1)。

表1 4種植物精油熏蒸處理24 h對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的熏蒸毒力

2.2 4種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺作用 羅勒精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺活性最高，LC50值為2.52 mL/L，其95%置信區(qū)間為2.33～2.71 mL/L，與薄荷精油2.52～3.24 mL/L、藿香精油2.59～2.98 mL/L和沙地柏精油2.62～3.31 mL/L之間的覆蓋率均小于50%，根據(jù)Ebling對(duì)LC50值95%置信區(qū)間的分析[22]，羅勒精油的觸殺作用與其他3種精油之間存在顯著差異；薄荷、藿香和沙地柏3種精油的95%置信區(qū)間的覆蓋率均大于50%，說(shuō)明3種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺毒力間差異不顯著，薄荷精油的敏感性最低，LC50值為2.86 mL/L。即4種精油的觸殺毒力由大到小依次為羅勒、藿香、沙地柏、薄荷(表2)。

表2 4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺毒力

2.3 精油對(duì)3種酶的抑制作用 4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)CarE、AChE、GSTs均有不同程度的抑制作用，且抑制作用呈明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，即隨精油濃度的升高，抑制作用加強(qiáng)。

抑制中濃度(I50)通常表示酶對(duì)抑制劑的敏感度，I50值越大，說(shuō)明酶對(duì)抑制劑越不敏感；反之，I50值越小，說(shuō)明越敏感。羅勒精油對(duì)CarE的抑制作用最強(qiáng)，其I50值為3.05 mL/L，明顯低于其他3種精油，薄荷，藿香，沙地柏精油的I50值分別為羅勒精油的1.35，2.37，3.57倍，4種精油對(duì)CarE的抑制效果從強(qiáng)到弱順序?yàn)榱_勒，薄荷，藿香，沙地柏精油。藿香和沙地柏精油對(duì)AChE的抑制作用強(qiáng)，I50值分別為5.64 mL/L和5.74 mL/L，薄荷和羅勒精油對(duì)AChE的抑制作用較弱，其I50值分別為藿香精油的1.65和3.14倍。羅勒精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)GSTs抑制作用最強(qiáng)，I50值為1.71 mL/L，其次為藿香、薄荷及沙地柏精油(表3)。

表3 4種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)3種酶抑制中濃度的比較

注：*以最小抑制中濃度I50值為1進(jìn)行比較。

3 結(jié)論和討論

4種植物精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)均有很強(qiáng)的熏蒸活性和一定的觸殺作用，熏蒸活性高于觸殺活性。4種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)3種離體酶均有顯著的抑制作用，其中羅勒精油對(duì)CarE和GSTs的抑制作用最顯著，藿香精油和沙地柏精油對(duì)AChE的抑制作用較強(qiáng)，精油對(duì)不同酶類活性的抑制作用與其殺蟲(chóng)機(jī)理的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

Buentello 等發(fā)現(xiàn)羅勒精油熏蒸果蠅Anastrephaludens的LC50為8.05 mL/L[23]；熏蒸米象3，4，5 d的LC50分別為8.14，6.50，4.9 μL/mL[24]，我們測(cè)定的羅勒精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的熏蒸和觸殺致死中濃度LC50值分別為0.81，2.52 mL/L，羅勒精油對(duì)枸杞蚜的毒殺作用較強(qiáng)。藿香精油對(duì)白紋伊蚊Aedesalbopictus的熏殺效果最好，LC50值為26.12 μg/cm3[25]，藿香精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的熏蒸LC50值為1.28 mL/L，明顯低于對(duì)白紋伊蚊的LC50值。薄荷精油熏蒸朱砂葉螨Tetrangchuscinubrinus24 h的LC50值為0.347 9 mg/L[26]，相同時(shí)間對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的熏蒸LC50值為1.56 mL/L，對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的熏殺作用不及對(duì)朱砂葉螨的；砂地柏精油熏蒸玉米象SitophiluszeamaisMotschulsky、赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Herbst)、粘蟲(chóng)MythimnaseparataWalker和小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Linnaeus)的LC50值分別為161.12，100.12，22.13，9.74 mg/L[27]，均高于對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的LC50值1.36 mL/L，薄荷和沙地柏精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)也有較高的毒殺作用。

CarE在昆蟲(chóng)代謝藥物的過(guò)程中起著重要的解毒作用[28]，多種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera( Hübner) CarE有明顯的抑制作用[29]，植物性辣椒堿對(duì)煙粉虱BemisiatabaciGennadius體內(nèi)CarE有明顯的抑制作用[30]，豬毛蒿精油對(duì)玉米象酸性磷酸酯酶、堿性磷酸酯酶、羧酸酯酶有明顯的抑制作用[31]，我們測(cè)定的4種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)CarE的作用與這些研究結(jié)果一致。AChE是有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑和氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑的直接作用靶標(biāo)，AChE對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性下降是害蟲(chóng)抗藥性的重要機(jī)制之一[17]，測(cè)定的4種精油對(duì)AChE抑制作用顯著，但AChE是否是精油的作用靶標(biāo)還需深入研究。辣椒堿對(duì)小菜蛾[32]、豬毛蒿精油對(duì)玉米象的GSTs有明顯的抑制作用[31]，測(cè)定的4種精油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)GSTs作用與前人相似。

植物精油的殺蟲(chóng)成分主要是單萜類化合物[33]，作用位點(diǎn)是昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)，是神經(jīng)系統(tǒng)中章魚(yú)胺受體的拮抗劑[34]，精油導(dǎo)致枸杞蚜CarE、AChE、GSTs等解毒酶活性的降低，是否會(huì)影響蚜蟲(chóng)對(duì)精油的解毒代謝，從而引起中毒死亡有待深入研究。

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(責(zé)任編輯 李海燕)

ToxicitiesoffouressentialoilsagainstAphissp.andtheireffectsontheactivitiesofthreeenzymesfromAphissp./

LIU Limei,et al.

(College of Agriculture,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010019,China)

In order to provide a scientific basis for the biological control and the development of the environment-friendly,efficient and safe pesticide againstAphissp.,toxicity activities of four essential oils againstAphissp.were tested with residual film in glass tube and fumigation method,and enzyme activities were tested by the method of spectrophotometer.The results indicated that essential oil fromOcimumbasilicum,Agastacherugosu,SabinavulgarisandMenthalongifoliahad strong contact toxicity againstAphissp.with LC50value of 2.52,2.78,2.82,2.86 mL/L,respectively.Essential oil fromO.basilicumwas the best fumigation againstAphissp.with the lowest LC50value of 0.81 mL/L after fumigated 24 h.The LC50value of essential oil fromA.rugosus,S.vulgarisandM.longifoliawere 1.28,1.36,1.56 mL/L,respectively.Activities of CarE,AChE and GSTs fromAphissp.were obviously inhibited by four essential oils.Essential oil ofO.basilicumhad the strongest inhibition effect on CarE and GSTs,and essential oils fromA.rugosusandS.vulgarishad stronger inhibition effect on AChE than the others.

Aphissp.;essential oil;toxicity;enzymes activity

2016-03-07；

2016-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360182)

劉麗梅(1988—)，女，內(nèi)蒙古通遼人，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治，E-mail:liulm2015@126.com

段立清， 教授，E-mail:duanlq2013@163.com。

S763.36

A

1671-0886(2017)01-0005-05