徐兵，王喆，馮琳（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

響應面優(yōu)化微波輔助提取珊瑚菌多糖工藝研究

徐兵，王喆，馮琳（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

研究采用虞山的珊瑚菌作為試驗材料，應用微波輔助提取改進珊瑚菌多糖的工藝參數(shù)。首先以珊瑚菌多糖得率作為指標，進行單因素試驗，探究提取時間、微波功率以及液料比對其影響。在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗設計并結合響應面法來改進微波提取珊瑚菌多糖工藝，得出優(yōu)化后的提取參數(shù)：微波功率410 W、提取時間8 min、液料比33∶1（mL/g），珊瑚菌多糖得率為7.01%。

珊瑚菌多糖；微波輔助提??；響應曲面法

珊瑚菌（Ramariabotrytoides）是一種子實體接近珊瑚狀的陸生真菌，屬于傘菌目。珊瑚菌科各屬中有很多食藥兼?zhèn)淇墒秤镁怺1-2]。珊瑚菌作為食用菌界的奇葩，具有數(shù)十種氨基酸、維生素以及微量元素，是天然的功能性食品[3-4]。常正堯、齊冰的研究表明，珊瑚菌多糖具有抑制乳腺癌細胞生長的作用，同時也有文獻表明，該菌多糖具有抗氧化的生理活性，故珊瑚菌多糖頗具開發(fā)前景[5-6]。多糖提取的傳統(tǒng)方法包括熱水提取法[7]、酶催化法[8]和堿提法[9]等。能耗高，耗時長且得率較低是這些方法的通病。近些年，微波和超聲波輔助提取在多糖提取逐漸流行，因為微波法對提取物的結構破壞較少，從而效果好且提取率較高[10-11]。現(xiàn)如今，尚未有微波用于珊瑚菌多糖提取的研究，故利用單因素及響應面法優(yōu)化提取珊瑚菌多糖的工藝，可為其進一步利用和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料和試劑

珊瑚菌：采自虞山國家森林公園；葡萄糖、濃硫酸、乙醚、乙醇、重蒸苯酚等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

α-1900PCS雙光束紫外可見分光光度計：譜元儀器有限公司；WL 2S-1型微波萃取儀：南京蘇恩瑞微波設備；TG16-WS臺式高速離心機：上海申安醫(yī)療器械廠；M124A型電子天平：BEL；MJ-BL25C3型攪拌機：廣東美的電器制造有限公司；LGJ-10冷凍干燥儀：賽飛（中國）有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 珊瑚菌的預處理

用蒸餾水將珊瑚菌洗凈，在65℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干。攪拌機粉碎過65目篩，再用95%乙醇回流兩次除去部分脂溶性雜質(zhì)，得到預處理珊瑚菌粉[12-13]。

1.3.2 標準曲線的測定

用干燥的葡萄糖標準品配置濃度為0.04 mg/mL的標準溶液，移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于試管中，補齊至2 mL。在各管滴加1 mL 6%重蒸苯酚溶液，盡快滴入5 mL濃硫酸搖勻并靜置，等待5 min后50℃保持15 min，充分冷卻。用490 nm波長檢測不同標樣的吸光度。以葡萄糖標準品濃度（μg/mL）做自變量，吸光度做因變量，得標準曲線：y=0.014 38+0.026，R2=0.999 1。

1.3.3 珊瑚菌多糖的微波輔助提取

準確稱量珊瑚菌粉末樣品，提取介質(zhì)選用蒸餾水，在不同提取時間、微波功率和液料比條件下提取2次，冷卻離心合并濾液，而后進行減壓濃縮。加入無水乙醇，使溶液含醇量85%，放置1 d。再以5 000 r/min離心15 min，最后經(jīng)無水乙醇洗滌沉淀，凍干后得到珊瑚菌多糖。

1.3.4 珊瑚菌多糖純度以及得率計算

選用苯酚-硫酸法來測定珊瑚菌多糖含量[14-15]。

1.3.5 單因素試驗

試驗以蒸餾水作溶劑，探究不同提取時間，液料比以及微波功率對珊瑚菌多糖得率的影響。再以1.3.3中提取及得率計算方法測出不同條件下珊瑚菌多糖得率。

1.3.5.1 提取時間對珊瑚菌多糖得率的影響

按時間將試驗分為 5 組：4、6、8、10、12 min，做 2 次平行。試驗固定液料比30∶1（mL/g），微波功率400 W。

1.3.5.2 提取功率對珊瑚菌多糖得率的影響

設定提取時間 8 min，液料比 30∶1（mL/g），考察珊瑚菌多糖在功率 200、300、400、500、600 W 時得率的變化。

1.3.5.3 液料比對珊瑚菌多糖的影響

在使用液料總體積不變的情況下，按液料比不同，試驗劃分為 5 組：15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）。試驗提取8 min，微波功率400 W，并做3次平行試驗。

1.3.6 響應面試驗設計

響應面法在工程應用、理化試驗、生物科學及食品科學等諸多領域有著深入的應用[16-17]。Box-Behnken Design（BBD）是廣泛應用的一種探究最佳工藝參數(shù)的設計方法[18-19]。該試驗中，設計三水平三因素試驗方案見表1所示，探究珊瑚菌多糖微波輔助提取的優(yōu)化提取參數(shù)。

表1 試驗編碼和試驗參數(shù)對照關系Table 1 The comparison relationship between encode and actual concentration of factor

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 提取時間對珊瑚菌多糖提取率的影響

微波提取時間對珊瑚菌多糖的得率的影響見圖1。

圖1 微波提取時間對珊瑚菌多糖的得率的影響Fig.1 Effects of microwave-assisted time on the extraction rate of the Ramariabotrytoides polysaccharide

從圖1可見，在微波提取時間由4 min上升至8 min過程中，珊瑚菌多糖得率出現(xiàn)躍變，并在達到最大值。而之后，伴隨提取時間延長，多糖得率出現(xiàn)下降。因此，選擇較優(yōu)提取時間8 min，提取率為6.94%。

2.1.2 微波功率對珊瑚菌多糖提取率造成的影響

微波提取功率對珊瑚菌多糖提取率的影響見圖2。

從圖2可以看出，在微波處理功率從200 W提至400 W時，珊瑚菌多糖提取得率變化幅度很大，并在400 W時出現(xiàn)最大值，而后提取功率進一步增大時，得率逐漸下降。這可能是因為先是微波促進細胞壁破碎而后隨功率增大，溫度提升過快反而破壞多糖結構。在此條件下較佳提取功率400 W，得率6.98%。

圖2 微波提取功率對珊瑚菌多糖提取率的影響Fig.2 Influence of microwave power on the extraction rate of the Ramariabotrytoides polysaccharide

2.1.3 液料比對珊瑚菌多糖提取率的影響

液固比對珊瑚菌多糖提取率的影響見圖3。

圖3 液固比對珊瑚菌多糖提取率的影響Fig.3 Influence of material-to-liquid ratio on the extraction rate of the Ramariabotrytoides polysaccharide

由圖 3可見，液料比從 15∶1（mL/g）提升至 30∶1（mL/g）過程中，珊瑚菌多糖得率變化明顯。這可能是由于液料比過低使珊瑚菌粉沒有充分分散于介質(zhì)中而降低提取率。在液料比達到30∶1（mL/g）后，多糖得率趨于穩(wěn)定。因此選擇30∶1（mL/g）作為珊瑚菌多糖提取的較佳液料比，得率6.92%。

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗結果

試驗應用Design-Expert8.06Trial軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理，進組合試驗結果見表2。

在這17組數(shù)據(jù)中，有12個析因點和5個用于估算誤差的零點。

表2 Box-Behnken試驗設計以及珊瑚菌多糖提取結果Table 2 Design and responses values of Box-Behnken design

2.2.2 方差分析結果

珊瑚菌多糖得率的方差分析見表3。

表3 珊瑚菌多糖得率的方差分析Table 3 The variance analysis result of Ramariabotrytoides polysaccharide yield

運用design-expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)做出處理，經(jīng)多元回歸擬合，計算出珊瑚菌多糖得率回歸方程式：

由表3分析可得，該模型的P值<0.01，說明本試驗模型具有統(tǒng)計學意義；失擬項P值為0.410 1，顯示數(shù)學模型和實際試驗值擬合度很好，從而回歸方程可近似代替試驗真實點。此外，模型中一次項X2、X3，二次項 X12、X22、X32以及交互項 X1X2的 P 值都＜0.05，說明本試驗的各個因子以及因子間的交叉作用都對多糖得率有顯著影響。同時注意到在單因素中，對珊瑚菌多糖提取率變化貢獻大小為微波功率＞提取時間＞液料比。

2.2.3 珊瑚菌多糖得率的響應面優(yōu)化

通過回歸模型，可以得到任意兩個選定因子以及其交叉作用對珊瑚菌多糖提取率的相應等高線圖和響應面見圖4～圖6。

圖4 提取時間和微波功率對珊瑚菌多糖得率的交叉效應的響應面圖和等高線Fig.4 Microwave treatment time and microwave power on the interaction polysaccharide yield of a response surface plot and contour lines

圖5 液料比和提取時間對珊瑚菌多糖提取率的交叉效應的響應面圖和等高線Fig.5 Liquid ratio and microwave treatment time on the interaction polysaccharide yield of a response surface plot and contour lines

圖6 液料比和微波功率對珊瑚菌多糖提取率的交叉效應的響應面圖和等高線Fig.6 Response surface plot and contour lines of the interaction of liquid-material ratio and microwave power on the polysaccharide yield response surface plot and contour lines

從圖4可以看出，在固定液料比30∶1（mL/g）的情況下，珊瑚菌多糖得率隨時間變化并不明顯。反觀縱坐標方向，隨著微波功率的變化多糖得率變化很明顯。同時看到等高線為橢圓形，說明這兩個因子之間交叉影響作用非常顯著。

從圖5可以看出，在固定微波功率400 W的情況下，液料比因素與提取時間因素對多糖得率變化的影響基本相同。同時注意到隨著液料比的增加及提取時間的延長，得率又一個先增大后減小的過程。

從圖6觀察得，在固定提取時間8 min時，多糖得率隨液料比變化不明顯，而隨微波功率從300 W提升至400 W是，其先起后伏的變化明顯。

通過design-expert軟件分析，可得珊瑚菌多糖提取工藝的最優(yōu)解：既微波功率407 W，提取時間8 min，液料比 33∶1（mL/g），得率 7.12%。參考實際條件，確定實際操作的最優(yōu)方案：微波功率410 W，提取時間8 min，液料比 33∶1（mL/g）。經(jīng)過 3次平行試驗，測得實際多糖提取率7.01%，這與理論值的相差在2%以下。由此可見，應用響應面法改進微波輔助提取珊瑚菌多糖是可行的，具有應用于實際生產(chǎn)的價值。

3 結論

微波輔助提取采用于珊瑚菌多糖，使提取變得高效而節(jié)能。試驗采用Design expert 8.0.6 Trial軟件設計試驗，通過響應面分析得到提取率與提取時間、微波功率及液料比因素的模型方程。相比較，李華等[20]使用單因素和正交試驗優(yōu)化提取工藝，通過用熱水浸提的試驗方法得出結論：珊瑚菌的最佳提取條件為浸提溫度為 90℃、浸提時間 2 h、液料比 20 ∶1（mL/g），粗多糖平均得率為5.64%；朱曉娟等[21]使用超聲波輔助提取法的最佳工藝參數(shù)為超聲功率108 W、液料比25∶1（mL/g）、超聲時間45 min、提取4次，在此條件下，珊瑚菌多糖得率為6.86%。而本試驗得出珊瑚菌多糖提取工藝的最優(yōu)解：既微波功率410 W，提取時間8 min，液料比33∶1（mL/g），得率 7.01%。由此可見，微波輔助提取法行之有效的提高了珊瑚菌多糖的得率。

[1]卯曉嵐．食用珊瑚菌[J].中國食用菌,1987(1):22

[2]李仲賢.秦巴山區(qū)野生珍稀珊瑚菌分離培養(yǎng)研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學,2013(3):54-55

[3]王法云,崔波,古奕慶,等．河南的珊瑚菌科食用菌資源研究及開發(fā)利用[J].河南科學,1997,15(1):57-64

[4]Kavishree S,Hemavathy J,Lokesh B R,et al.Fat and fatty acids ofIndian edible mushrooms[J].Food Chemistry,2008,106(2):597-602

[5]常正堯,吳亞楠,李永芳,等.珊瑚菌抗乳腺癌作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2013(1):152-154

[6]王麗娟,張飛,苗玉潔.珊瑚菌多糖的提取及其對羥自由基的清除作用研究[J].食品工業(yè),2012(10):43-46

[7]Lalaoui,K Satta,D.Immunostimulating activity of the hot water-soluble polysaccharide extracts of Anacyclus pyrethrum,Alpiniagalanga and Citrulluscolocynthis[J].Journal of Ethnopharmacology,2003,88(2/3):155-160

[8]陳煉紅,楊麗珠,索化夷,等.響應面法優(yōu)化松茸多糖酶法提取工藝及其體外抗氧化性分析[J].食品科學,2014(16):23-28

[9]曹湛慧,劉亞,黃和,等.堿法提取淮山多糖及其體外抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè),2015(2):25-28

[10]朱彩平,高貴田,李建科,等.響應曲面法優(yōu)化微波輔助提取平菇多糖工藝研究[J].食品科學,2010(4):68-72

[11]陳曉青,劉覃,蔣新宇,等.Microwave-assisted extraction of polysaccharides from solanumnigrum[J].Journal of Central South University of Technology(English Edition),2005(5):556-560

[12]盛家榮,歐陽遜,鄧秋波,等.南板藍根多糖提取的最佳脫脂工藝[J].中藥材,2007(1):99-101

[13]張斌,張璐,李沙沙,等.均勻設計法研究甘蔗渣多糖提取的最佳脫脂工藝[J].時珍國醫(yī)國藥,2012(7):1713-1714

[14]劉玲,陶松,應萍,等.苯酚硫酸法測補腎口服液中多糖含量及其不確定度評價[J].江西中醫(yī)學院學報,2013(3):38-41

[15]Xu Xiu-quan,Yu Rong-min,Liu ke,et al.Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from RHIZOMA AREACTYLODIS LANCEAE by Response Surface Methodology[J].Medicinal Plant,2011(5):67-70

[16]李莉,張賽,何強,胡學斌.響應面法在試驗設計與優(yōu)化中的應用[J].試驗室研究與探索,2015(8):41-45

[17]王曉陽,唐琳,趙壘.響應面法優(yōu)化刺槐花多酚的超聲提取工藝[J].食品科學,2011(2):66-70

[18]Yang Shangying,Li Ying,Jia Dongyin,et al.The synergy of Box-Behnken designs on the optimization of polysaccharide extraction from mulberry leaves[J].Industrial Crops&Products,2017,99:70-78

[19]吳美媛,王喜周,余甜女,等.Box-Behnken效應面法優(yōu)化微波提取猴頭菇多糖工藝[J].食品研究與開發(fā),2014(9):23-26,35

[20]李華,竇曉蘭,陸啟玉.葡萄狀枝瑚菌粗多糖的提取及其清除DPPH自由基活性[J].食用菌學報,2012(3):69-72

[21]朱曉娟,鄭國棟.超聲法優(yōu)化提取珊瑚菌多糖的工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2016(18):45-48

Study on the Microwave-assisted Extraction of Polysaccharides from Ramariabotrytoides by Response Surface Methodology

XU Bing，WANG Zhe，F(xiàn)ENG Lin
（College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

This article used Ramariabotrytoides which from YuShan as experimental material.Microwave assisted method was used to improve extraction technology of polysaccharides.The extraction rate was set as evaluation index，and some single factors（material liquid ratio，exaction time，and microwave power.）were studied.And on this base，Box-Behnken Design（BBD）and response surface methodology（RSM）were used to design experiments for optimization of extraction technology of polysaccharides from Ramariabotrytoides.Results showed that material-liquid ratio 33∶1（mL/g），microwave time 8 min with microwave power 410 W were the optimum extraction parameters.Under these conditions，the extraction rate of polysaccharide from Ramariabotrytoides was 7.01%.

Ramariabotrytoides polysaccharides；microwave-assisted extraction （MAE）；response surface methodology（RSM）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.014

蘇州市科技計劃項目（SNG201615）

徐兵（1982—），男（漢），實驗師，碩士，研究方向：食用菌學。

2017-05-11