許冬梅，武晉孝，田文霞，閆 芳，高文偉，馬海利，鄭明學(xué)，程志學(xué)，趙宇軍

雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表達及抑菌研究

許冬梅1，武晉孝2，田文霞3，閆 芳3，高文偉3，馬海利3，鄭明學(xué)3，程志學(xué)3，趙宇軍3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省飼料獸藥檢查所，山西太原030027；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

為了研究雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的體外表達產(chǎn)物的活性，試驗進行了肝臟樣品無菌采集，基因的克隆及密碼子優(yōu)化和表達，以表達產(chǎn)物對致病菌做紙片法藥敏試驗，判斷其抑菌作用。結(jié)果表明，試驗經(jīng)低溫處理獲得了較好的肝臟總RNA，克隆并優(yōu)化了雞LEAP-2基因；經(jīng)誘導(dǎo)得到了表達產(chǎn)物，形式為包涵體；抑菌試驗表明，表達產(chǎn)物對16株分離致病菌具有抑制作用。

雞；LEAP-2；抗菌肽；原核表達；抑菌試驗

雞LEAP-2，是肝臟表達Ⅱ型抗菌肽，為肝臟中產(chǎn)生并微量存在的一種抗菌肽[1-8]。在肉雞和蛋雞養(yǎng)殖中，細菌感染和繼發(fā)感染的治療是一類比較棘手的問題。現(xiàn)代生活中，人們膳食結(jié)構(gòu)的改變和對飲食質(zhì)量的要求使得肉雞和蛋雞的生產(chǎn)逐年增加，其幅度之大可以用指數(shù)增長來形容。而動物的大量集中和高密度飼養(yǎng)使得病原菌有了很好的滋生條件，同時藥物的殘留及有效的抗生素在獸醫(yī)領(lǐng)域的禁用，導(dǎo)致了養(yǎng)雞生產(chǎn)中針對細菌感染的藥物選擇越來越少，雞LEAP-2抗菌肽的發(fā)現(xiàn)為解決這種困境提供了一種新的思路[9-16]。

本研究針對從雞肝臟中克隆并優(yōu)化了密碼子的LEAP-2進行了原核表達，旨在能夠提供一種可供選擇的抗菌產(chǎn)品來緩解生產(chǎn)中病原菌的困擾。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 5只2周齡健康紅布羅雞，購自太谷縣肉雞養(yǎng)殖場。4株致病性大腸桿菌來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防系獸醫(yī)微生物實驗室分離菌株。

1.1.2 主要試劑 DEPC溶液及DNA凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Code#AT301-02、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA限制性內(nèi)切酶Eco RI和Not I、反轉(zhuǎn)錄試劑盒E.coli DH5α，均購自天根生化科技（北京）有限公司；ITrizol試劑（貨號15596026），購自北京索萊寶科技有限公司；Trans5K DNAmarker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；低分子蛋白Marker，購自上海酶聯(lián)生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI基因庫中相關(guān)的序列設(shè)計引物，上游、下游引物序列分別為：LEAP-2 F （sense）：5′-GAA TTC ATG CAC TGC CT-3′，LEAP-2 R （anti-sense）：5′-GCG GCC GCT CAC TCGGACG-3′，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 肉雞肝臟總RNA的提取 口腔內(nèi)剪斷雞眼兩側(cè)動脈，放血處死肉雞，將整只雞浸泡于70%的乙醇中5 min，取出，在超凈臺上打開腹腔，剪取肝臟，于DEPC處理過的平皿中剪成碎片，每份稱取50～100 mg，保存于液氮中；另取一份放于-20℃冰箱內(nèi)提前降溫的研缽內(nèi)進行研磨，磨到溶液變得透明；將液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，取200μL氯仿加入，振蕩30 s后靜置10 min[5-7]，RNA的提取處理參照《分子克隆手冊》（2004-1）進行。

1.2.3 LEAP-2基因擴增 基因擴增的體系：上游引物 1 pmol，2×TSReaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNA 5 μL，RNase Free ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)條件為：42℃30 min，85℃5 s，放置在-20℃?zhèn)溆?。LEAP-2基因PCR擴增的反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2μL，dNTPMixture 1.6μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 13.2μL。PCR條件：94℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性 1 min，52 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；擴增產(chǎn)物連接到T載體送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 LEAP-2原核表達 鑒于雞LEAP-2基因為260 bp左右，交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用載體為PGEX-6P-1，合成之前進行密碼子優(yōu)化，LEAP-2基因與載體鏈接使用HindⅢ與BamhⅠ定向連接，命名為PGEX-6P-LEAP-2，IPTG 0.8 moL/L，37℃2 h，誘導(dǎo)菌離心后經(jīng)超聲波裂解，再經(jīng)變性復(fù)性之后經(jīng)GST標(biāo)簽柱層析進行鑒定[3，6-7，15]。

1.2.5 紙片法檢測表達產(chǎn)物的抑菌作用 制備直徑為3mm的定量濾紙紙片，浸入質(zhì)量濃度為0.1mg/L的表達產(chǎn)物純化液中，30 s后取出備用；將山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防系獸醫(yī)微生物實驗室分離的雞4株致病性大腸桿菌接種至營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)8 h，將肉湯以三角玻璃棒均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂表面，共4個平皿，將紙片輕輕貼附于瓊脂表面，37℃培養(yǎng)過夜觀察結(jié)果，測量抑菌環(huán)直徑，并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞肝臟mRNA提取

肝臟經(jīng)低溫處理研磨后進行電泳，結(jié)果顯示，肝臟總RNA提取效果良好。

2.2 LEAP-2基因擴增結(jié)果

經(jīng)PCR擴增后獲得了目標(biāo)基因，大小為263 bp，經(jīng)測序并于NCBI基因庫中進行BLAST同源性序列檢索，確定為LEAP-2基因（圖1）。

2.3 LEAP-2表達

密碼子優(yōu)化后的合成基因經(jīng)誘導(dǎo)及經(jīng)過層析柱純化，主要存在于沉淀中，大小為33 ku（圖2）。

2.4 紙片法抑菌

經(jīng)37℃培養(yǎng)后，對4個平皿進行抑菌圈直徑測量，表達蛋白的復(fù)性產(chǎn)物對4株山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防系獸醫(yī)微生物實驗室保存菌株的抑菌圈均在6 mm左右，結(jié)果表明，該表達產(chǎn)物具有一定的抑菌作用，其結(jié)果列于表1。

表1 表達產(chǎn)物對4株致病性大腸桿菌的抑制作用 mm

3 討論

雞LEAP-2是一類體內(nèi)表達量很小的多肽，在實際應(yīng)用中直接從動物體提取，成本較高，較難在實際生產(chǎn)中得到應(yīng)用，利用生物技術(shù)進行制備是一種新的選擇[17-18]。

肝臟總RNA的提取相對來說比較困難，因為在肝臟內(nèi)有較其他組織中多的RNA酶，在提取過程中注意對低溫和操作的嚴(yán)謹(jǐn)性有較高的要求。筆者在綜合了其他組織RNA提取的文獻資料后，經(jīng)過對幾種不同方法的比較，得到了比較有效的肝臟總RNA。

很多組織可以產(chǎn)生抗菌肽，肝臟表達的抗菌肽具有一定的使用前景[19-20]，從產(chǎn)生部位來看，可以直接對經(jīng)由消化道進入血液系統(tǒng)的微生物進行第一時間處理，但其表達量的限制，使得直接提取成本較高，本研究的表達雖然嘗試了體外表達的生物學(xué)技術(shù)，然而表達的效果依然不能有效降低生產(chǎn)成本。因此，對該抗菌肽的生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)措施仍有待繼續(xù)探索。

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Study on Prokaryotic Expression and Bacteriostasis Activity of Chicken Type II Antimicrobial Peptide LEAP-2

XUDongmei1，WUJinxiao2，TIANWenxia3，YANFang3，GAOWenwei3，MA Haili3，ZHENGMingxue3，CHENGZhixue3，ZHAOYujun3
（1.Collegeof Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Feed and Veterinary Drug Inspection Department of Shanxi Province，Taiyuan 030027，China；3.Collegeof Animal Science and Veterinary，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Todeterminetheantibiotic activity of chicken LEAP-2 expressed in vitro,the geneof LEAP-2 was applied by RT-PCR instructed by the sequence NM_001001606,and then wasdone with codon optimization and cloned into pGEX-6P-1.After expressed in E.coli DE3,the expressed product was managed to do antibiotic experiment by bacteriostasis circle test.Theresults showed that chicken LEAP-2 gene had a satisfied gain under liquid nitrogen processing,LEAP-2 was cloned and after optimized then expressed by incusion bodiestype,antimicrobial susceptibility test result showed that 16 E.coli strain owned in laboratory was sensitived tothe protein.

chicken;LEAP-2;antimicrobial peptide;prokaryotic expression;bacteriostatic test

S831.5

A

1002-2481（2017）12-1998-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.24

2017-08-29

山西省科技攻關(guān)項目（20140311021-3）

許冬梅（1974-），女，山西太谷人，講師，碩士，主要從事動物遺傳及機制研究工作。趙宇軍為通信作者。