吳效楠，鄭哲奎，潘滋涵

(承德石油高等?？茖W(xué)校 化學(xué)工程系，河北 承德 067000)

固定化α-淀粉酶在鄰氨基對(duì)甲苯酚合成中的應(yīng)用

吳效楠，鄭哲奎，潘滋涵

(承德石油高等?？茖W(xué)校 化學(xué)工程系，河北 承德 067000)

以自制的固定化α-淀粉酶為催化劑，鄰硝基對(duì)甲苯酚為原料合成了鄰氨基對(duì)甲苯酚。確定了α-淀粉酶的固定化率和重復(fù)使用次數(shù)，并利用正交試驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度、溶劑組成和反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響，得出了最佳合成條件，其產(chǎn)率達(dá)到了93.73%(HPLC)。

鄰氨基對(duì)甲苯酚；鄰硝基對(duì)甲苯酚；固定化α-淀粉酶；正交試驗(yàn)

鄰氨基對(duì)甲苯酚在工業(yè)上是重要的染料及聚酯纖維熒光增白劑DT中間體[1]。該產(chǎn)品傳統(tǒng)的合成方法如硫化鈉、鐵粉還原法對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，而水合肼還原法報(bào)道較多，但因水合肼價(jià)格較高且采用了貴金屬作為催化劑，從而阻礙了該法的發(fā)展。酶法催化是近些年新興的技術(shù)，和傳統(tǒng)的制備工藝相比，高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保是該法最大的優(yōu)點(diǎn)[2]，尤其酶在固定化后不僅穩(wěn)定性得到了提高，而且活性和催化底物均產(chǎn)生了變化。本文以尼龍為載體，自制了固定化α-淀粉酶催化劑，以鄰硝基對(duì)甲苯酚為原料還原合成了鄰氨基對(duì)甲苯酚，并在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行了反應(yīng)條件的探索，該法目前在國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要試劑和儀器

鄰硝基對(duì)甲苯酚(工業(yè)品)；尼龍網(wǎng)(工業(yè)品)；去離子水(自制)；甲醇、可溶性淀粉、麥芽糖、α-淀粉酶、檸檬酸(鈉)、50%戊二醛、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉、碘化鉀、鹽酸、硼氫化鈉、土溫80、酒石酸鉀鈉、硫酸銅，分析純，均購(gòu)自天津市化學(xué)試劑供銷公司。

XT4A顯微熔點(diǎn)儀，河南鞏義市英峪予華儀器廠；pHS-25型pH計(jì)，上海精科雷磁；UV-1600型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；AX200型電子分析天平，上海精科天平；L-7000型液相色譜儀，北京萊伯泰科儀器有限公司；IR Prestige-21紅外光譜儀，長(zhǎng)春市輝浩科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)原理

采用戊二醛為交聯(lián)劑將游離α-淀粉酶固定在尼龍上[3]，并在最佳條件下與淀粉溶液進(jìn)行水解生成還原糖。水解后的產(chǎn)物配以適量的甲醇作為溶劑，在一定條件下和鄰硝基對(duì)甲苯酚反應(yīng)生成鄰氨基對(duì)甲苯酚。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 α-淀粉酶的固定化

尼龍固定化α-淀粉酶的制備參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.3.2 固定化α-淀粉酶最佳水解條件的確定[4]

經(jīng)斐林試劑法檢測(cè)固定化α-淀粉酶水解淀粉的最佳條件是：水解時(shí)間=4 h、pH值=7、溫度=70 ℃。

1.3.3 固定化α-淀粉酶還原鄰硝基對(duì)甲苯酚

取500 mL的三口燒瓶由左至右依次安裝溫度計(jì)、回流冷凝管、滴液漏斗。在右側(cè)滴液漏斗中加入0.2 g鄰硝基對(duì)甲基苯酚，并用適量甲醇溶解(甲醇用量參照正交試驗(yàn)表)。在燒瓶中放入用尼龍固定化好的α-淀粉酶，加入150 mL溫度為70 ℃的1%淀粉溶液，維持溫度不變水解4 h左右，然后將滴液漏斗中的原料溶液逐滴加入到三口燒瓶中，升高溫度并保持恒溫反應(yīng)一定時(shí)間。

2 產(chǎn)品分析與表征

2.1熔點(diǎn)測(cè)定儀分析

用顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定產(chǎn)品鄰氨基對(duì)甲苯酚的熔點(diǎn)為136.5 ℃,與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)135～137 ℃基本一致[5]。

2.2產(chǎn)品鄰氨基對(duì)甲苯酚的IR表征

鄰氨基對(duì)甲苯酚的紅外圖譜見圖1。

由圖1可知，3 034 cm-1為苯環(huán)上(=C-H)碳?xì)渖炜s振動(dòng)峰,且1 520 cm-1與1 601 cm-1處也有吸收,證明了該化合物中苯環(huán)的存在;2 954 cm-1與2 870 cm-1分別為甲基(CH3-)的碳?xì)洳粚?duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；3 652 cm-1為苯酚羥基(-OH)的伸縮振動(dòng)吸收峰;1 396 cm-1為苯酚羥基(-OH)的彎曲吸收振動(dòng)峰;1 289 cm-1與1 230 cm-1為苯環(huán)與羥基的(C-O)伸縮振動(dòng)吸收峰;804 cm-1處的吸收峰說明了該芳香化合物是1,2,4-取代，由此可推斷出產(chǎn)物為鄰氨基對(duì)甲苯酚。

2.3HPLC檢測(cè)(峰面積法)

檢測(cè)條件如下：反向C18色譜柱；流動(dòng)相中v(CH3OH) ∶v(H2O)=70 ∶30；流量0.5 mL/min；L-7420型UV-Vis檢測(cè)器；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。此條件下產(chǎn)物出峰位置的保留時(shí)間在4 min附近(見圖2)，因此可確定為產(chǎn)物。

3 結(jié)果與討論

3.1α-淀粉酶的固定化率測(cè)定

根據(jù)下面的公式進(jìn)行α-淀粉酶固定化率的計(jì)算：

其中游離酶的活性通過3,5-二硝基水楊酸對(duì)還原糖進(jìn)行顯色反應(yīng)來測(cè)定[6]。取7支干凈的具塞刻度試管并編號(hào)，將各試管搖勻，置沸水浴中煮沸5 min 后取出冷卻，加蒸餾水定容至25 mL。以1號(hào)管作為空白樣，在540 nm波長(zhǎng)下通過比色法測(cè)定吸光度，并以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。

從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3可以看出，在540 nm下，麥芽糖含量與吸光度成正線性關(guān)系,符合線性方程：y=0.185 94x+0.022 09(R2=0.998 25)。即通過測(cè)定的吸光度，可以求得麥芽糖的量，再根據(jù)下面公式可得到α-淀粉酶的活性。

取四份0.2 g α-淀粉酶分別溶于100 mL濃度為1%的淀粉溶液中，在60 ℃的條件下水解4 h后測(cè)得的吸光度見表1。

將四塊大小均一的尼龍放入0.2 g α-淀粉酶的水溶液中按照步驟1.3.1進(jìn)行固定化，隨后取出固定化后的尼龍，將剩余的淀粉酶溶液和淀粉配成100 mL濃度為1%的淀粉溶液水解4 h，同時(shí)測(cè)量剩余游離α-淀粉酶的活性，見表2。

表1 游離α-淀粉酶的活性測(cè)定

表2 剩余游離α-淀粉酶的活性測(cè)定

根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以得到α-淀粉酶的固定化率為39.26%。

3.2固定化α-淀粉酶還原鄰硝基對(duì)甲苯酚

在合成鄰氨基對(duì)甲苯酚的實(shí)驗(yàn)中，為了考察反應(yīng)溫度、溶劑組成(甲醇與水的比例)和反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響，按照步驟1.3.3及設(shè)計(jì)的表3(三因素四水平正交試驗(yàn)表)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。其中，A因素為溫度，四組水平分別為40 ℃、60 ℃、80 ℃ 和回流溫度；B因素為溶劑組成(甲醇與水的體積比)，四組水平分別為蒸餾水、1 ∶9、1 ∶4 和1 ∶2；C因素為反應(yīng)時(shí)間，四組水平分別為2 h、4 h、8 h和12h 。測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 三因素四水平正交試驗(yàn)表

表4 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)

(注：溶劑的總體積是165 mL；鄰硝基對(duì)甲苯酚為0.2 g)

從上面的16組正交試驗(yàn)的結(jié)果中可以看到，影響產(chǎn)率的因素排序?yàn)椋築>A>C，最好一組的水平組合是A4B2C4,而在這16組中并無該水平組合，并且從這16組整體數(shù)據(jù)中可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高、反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，所要得到的產(chǎn)物的產(chǎn)率就有提高的趨勢(shì)。因此，根據(jù)上面的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果又選取了A4B2C4這組條件重復(fù)了以上實(shí)驗(yàn)，得到的最終產(chǎn)率為93.7%(高效液相譜圖見圖2)。故最佳的反應(yīng)條件是在混合溶劑甲醇 ∶水(體積比)=1 ∶9中，于回流溫度下反應(yīng)12 h。

3.2固定化α-淀粉酶重復(fù)使用性

按照1.3.3的步驟并采用A4B2C4組實(shí)驗(yàn)條件對(duì)固定化α-淀粉酶進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，來驗(yàn)證固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)。結(jié)果見圖4。

由圖4可知，固定化α-淀粉酶在使用5次后，產(chǎn)品的產(chǎn)率有明顯的下降，故重復(fù)使用次數(shù)為5次。

4 結(jié)論

以固定化α-淀粉酶為載體催化還原制備鄰氨基對(duì)甲苯酚，是生物催化劑應(yīng)用的一種探索。由于交聯(lián)劑戊二醛分子兩端的兩個(gè)醛基可以分別與載體及配基上的氨基以五碳橋的形式交聯(lián)起來，所以載體與酶的結(jié)合力較強(qiáng)。而尼龍是由酰胺鍵聯(lián)接起來的親水性載體，與肽鍵結(jié)構(gòu)非常相似，其價(jià)格低廉，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的可操作性。此外，尼龍固定化α-淀粉酶的各項(xiàng)性能都有顯著的提高，并可多次重復(fù)使用，所得產(chǎn)物鄰氨基對(duì)甲苯酚的產(chǎn)率也較高，最高可以達(dá)到93.73%，因此該技術(shù)在工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景，是綠色化工的發(fā)展方向。本實(shí)驗(yàn)中尼龍對(duì)酶的固定化率為39.26%，說明今后還可以在增加酶的固定量以及溶劑回收方面進(jìn)行更深一步的探索研究。

[1] 吳效楠,劉濤,何南思，等.水合肼法催化還原鄰硝基對(duì)甲基苯酚的研究[J].承德石油高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2014,16(5):15.

[2] 陳陶聲,居乃琥,陳石根.固定化酶理論與應(yīng)用[M].北京:北京輕工業(yè)出版社,1987.

[3] 陳盛,劉艷如,余萍.淀粉酶的固定化及其柱式反應(yīng)器的研究[J],福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1996,12(4):75-79.

[4] 吳效楠.尼龍載體固定化α-淀粉酶的研究[J],化工中間體.2014(10)：30.

[5] 唐坤.中間體化學(xué)工藝學(xué)[M].化學(xué)工業(yè)出版社，1984.

[6] 陳石根,周潤(rùn)琪.酶學(xué)[M].上海:復(fù)旦大學(xué)出版社,2001.

Immobilizedα-amylaseandItsApplicationinSynthetizingo-amino-p-methylphenol

WU Xiao-nan, ZHENG Zhe-kui, PAN Zi-han

(Department of Chemical Engineering, Chengde Petroleum College, Chengde 067000, Hebei, China)

Synthesis of o-amino-p-methylphenol by catalytic reduction of o-nitro-p-methylphenol in the presence of self-made immobilized α-amylase was studied. The immobilization rate and the number of repeated use of the immobilized α-amylase were determined, and the effects on the yield of temperature, solvent composition and reaction time have been reported by using the orthogonal test. Under the optimum conditions, the yield of o-amino-p-methanephenol was 93.73%(HPLC).

o-amino-p-methylphenol; o-nitro-p-methylphenol; immobilized α-amylase; orthogonal test

TQ203

B

1008-9446(2017)05-0015-05

2016-11-14

吳效楠(1980-),男，河北承德人,副教授,碩士,主要研究方向?yàn)楣I(yè)催化，E-mail：cdpcwxn2007@163.com。