黃曉宇，袁軍虎，楊巧麗，馬艷萍，滾雙寶，3

(1.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.河南省漯河市畜牧局，河南 漯河 462000；3.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070)

豬白細胞抗原 (Swine lymphocyte antigen，SLA)Ⅱ類基因簇是SLA三類基因中跨度最小(0.5 Mb)的基因分子，定位于7q1.1長臂，其主要功能是通過抗原呈遞細胞(APC)將外源性抗原呈遞給 CD4+輔助 T 細胞受體，導致 TCR 激活和分化，從而在清除外來抗原和誘發(fā)免疫應答過程中起重要作用，SLAⅡ類基因對動物的抗病性和生產性能方面具有廣泛的影響[1-2]。SLAⅡ類區(qū)域編碼多種多樣的基因，包括-DR、-DQ、-DM和-DO蛋白的 α 鏈和 β 鏈基因，其中僅有 -DR和 -DQ基因能在蛋白質水平上表達[3]。DRA基因位于Ⅱ類抗原 α 鏈，由 4 個外顯子組成，外顯子 1 編碼前導序列，外顯子2、3 分別編碼 α1 和 α2 功能區(qū)，外顯子 4 編碼跨膜區(qū)和胞漿區(qū)，DRA基因屬于低度多態(tài)，具有一定的保守性[4]。

目前，關于豬DRA基因的報道主要集中在不同豬種DRA基因外顯子多態(tài)性及其與生產性狀和疾病抗性等方面的研究[5-9]，而有關DRA基因蛋白質結構的研究僅見于長白豬、藏豬、合作豬、湖南大圍子豬、沙子嶺豬、八眉豬、巴馬小型豬[10-15]，尚未有關于煙臺黑豬DRA基因蛋白質結構特性的報道。莫斯科等[11]對甘肅藏豬DRA和DRB基因的同源性對比顯示了合作豬在豬-人異種移植中的應用潛力。唐醫(yī)亞等[12]和王燕等[13]通過對湖南沙子嶺豬和湖南大圍子豬SLA-DR基因克隆，認為2個品種豬SLA-DR基因與人HLA-DR基因間具有較高的同源性。劉麗霞等[14]對八眉豬DRA基因編碼區(qū)進行蛋白質結構預測發(fā)現(xiàn)DRA基因編碼一種不穩(wěn)定的不可溶蛋白。姜平等[15]對荷包豬DRA-HB全基因編碼區(qū)進行克隆測序并分析了其分子進化關系后，發(fā)現(xiàn)其變異區(qū)集中在135，159，202位點。

煙臺黑豬原產地為膠東地區(qū)，是以當?shù)鼗移ず谪i為基礎，選育而成的一種優(yōu)良地方豬種，具有抗逆性強、產仔率高、耐粗飼、生長發(fā)育快、肉品質好等特點[16]，因此，本研究以甘肅紅古區(qū)引入的煙臺黑豬為研究對象，采用 PCR-SSCP、克隆測序和生物信息學等方法研究SLA-DRA基因編碼區(qū)(Coding region，CDS)多態(tài)性、氨基酸理化性質、結構域特征，并對蛋白質的結構和功能進行預測和分析，以期明確煙臺黑豬SLA-DRA基因的遺傳特征，為該基因作為某些經(jīng)濟性狀和抗病候選基因等遺傳育種研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

290 頭煙臺黑豬來自甘肅省紅古區(qū)黑豬飼養(yǎng)場。采集耳組織樣品，-20 ℃ 保存，常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組 DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測 DNA 的純度和濃度，檢測合格后，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計和PCR擴增

參照 GenBank 中太湖豬SLA-DRA基因序列(登錄號:AY303990)，采用 Primer 5.0 軟件設計SLA-DRA基因4個外顯子的擴增引物(表 1)，由大連寶生物公司合成。

PCR 擴增采用 25 μL 的反應體系：10×Buffer 緩沖液 2.5 μL，dNTP 1 μL(2.5 mmol/μL)，上下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，TaqDNA聚合酶 0.5 μL(5 U/μL)，模板 DNA 1 μL(50～100 ng/μL)，滅菌 ddH2O 19 μL。PCR 擴增條件；預變性 94 ℃ 3 min；變性 94 ℃ 30 s，退火溫度詳見表 1，延伸 72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；最后延伸 72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存，PCR 產物用 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 PCR 擴增產物的 SSCP 檢測

分別取 3 μLSLA-DRA基因 PCR 產物，加入 7 μL 變性劑(98% 去離子甲酰胺、0.025% 溴酚藍、0.025% 二甲苯青、10 mmol/L EDTA(pH值0.8))，經(jīng) 98 ℃ 變性 10 min，迅速冰浴 10 min，上樣于充分預冷的非變性聚丙烯酰胺凝膠，4 ℃ 條件下進行電泳，電泳條件參見表 1，電泳結束后銀染法顯色。

表1 SLA-DRA基因外顯子的引物序列和SSCP反應條件Tab.1 Primer and SSCP condition of SLA-DRA gene exons

注：Acr∶Bis.丙烯酰胺與N，N′-亞甲基雙丙烯酸酰胺的比值。

Note： Acr∶Bis.The ratio of acrylamide and N，N′-methylenebisacrylamide.

1.4 克隆測序

根據(jù)顯影后不同的 SSCP 條帶模型，每種類型隨機挑取 3 個不同的 PCR 產物，用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收純化后，采用載體 pMD?19-T Vector 連接，構建重組質粒，并轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α 菌株；挑選陽性克隆培養(yǎng)后，進行菌液 PCR 擴增；菌液 PCR 產物與初始 PCR 產物再次通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，顯色后進行模型條帶比較，進一步確定測序菌落的正確性，每一種基因型挑選 2 個克隆的菌液 PCR 產物送上海生物工程有限公司進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及生物信息學分析

利用PopGene 32 軟件和 PIC 軟件(Bostein)[17]計算基因的多態(tài)性信息，MEGA 6.0 軟件進行 DNA 分析與比對，SLA-DRA基因及其蛋白質的生物信息學分析過程如表 2 所示。

表2 蛋白質功能和結構預測相關網(wǎng)站Tab.2 The websites and softwares of prediction of function and structure of protein

2 結果與分析

2.1 SLA-DRA基因核苷酸序列多態(tài)性分析

2.1.1 PCR 擴增及 SSCP 檢測SLA-DRA基因外顯子的PCR擴增產物經(jīng) 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶清晰且無非特異擴增者，判斷其擴增產物為目的條帶，再進行后續(xù)試驗分析。經(jīng) SSCP 檢測，exon 1 檢測到 2 種等位基因(A 和 B)，共形成 3 種基因型(AA、BB 和 AB，圖 1-A)；exon 2 檢測到 3 種等位基因(A、B 和 C)，共形成 4 種基因型(AA、BB、AB 和 AC，圖 1-B)；exon 3 僅檢測到 1 種等位基因 A，形成1種基因型 AA(圖 1-C)，exon 4 檢測到 5 種等位基因(A、B、C、D和 E)，共形成 8 種基因型(AA、BB、AB、CC、BC、AC、DD和 AE，圖 1-D)。

每種帶型代表1種基因型。Every pattern represents one genotype.

2.1.2SLA-DRA基因外顯子序列比對分析 將克隆測序得到的序列去除引物序列及內含子序列，得到有效的外顯子序列，將4個外顯子的等位基因序列利用 dbSNP 進行比對，發(fā)現(xiàn) exon 1、2、4 分別檢測到 2，2 ，7個SNPs(表 3)，共導致 7 個氨基酸發(fā)生錯義突變，exon 1 等位基因 A含有 2個SNPs(c.178A>G和c.179G>A)，導致1個氨基酸發(fā)生變異 p.10Gly>Arg；exon 2 等位基因 C包含2個 SNP 位點，其中包括1個新的SNP位點c.3104C>T，該位點沒有引起氨基酸的變異；exon 4 共檢測到7個SNPs，多態(tài)性最為豐富，導致5個氨基酸發(fā)生變異(p.206Gln>Asn、p.212Thr>Asn、p.216Thr>Pro、p.219Ala>Ser 和 p.248Arg>His)，屬于錯義突變，詳見表 3。各外顯子等位基因序列提交至 GenBank，登錄號見表 4。

表3 煙臺黑豬SLA-DRA基因CDS區(qū)突變位點Tab.3 The mutations sites of SLA-DRA gene CDS region in Yantai black pig

注：加下劃線表明新突變位點。

Note：The underline represent the new mutation site.

表4 豬 SLA-DRA基因等位基因和基因型的頻率、遺傳參數(shù)及 GenBank 基因序列登錄號Tab.4 The allelic and genotypic frequencies，population genetic parameters of SLA-DRA gene and the accession numbers in GenBank database

2.2 SLA-DRA基因CDS區(qū)蛋白質的功能和結構預測

2.2.1SLA-DRA基因開放閱讀框(Open reading frame，ORF)的分析 根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫 ORF Find 在線軟件預測煙臺黑豬SLA-DRA基因編碼區(qū)開放閱讀框，由圖 2 所示，一共預測出6個開放閱讀框，其中第 1～758 bp 為最長、最完整的SLA-DRA基因開放閱讀框。

圖2 SLA-DRA 基因開放閱讀框預測Fig.2 The open reading frame prediction of SLA-DRA gene sequence

2.2.2SLA-DRA基因氨基酸序列理化性質分析 豬SLA-DRA基因編碼區(qū)核苷酸序列全長為 759 bp，共編碼 252 個氨基酸和 1 個終止子，其中有 7 個氨基酸發(fā)生變異，分布在 exon 1、2、4 區(qū)域。SLA-DRA基因與參考序列AY303990的 CDS 氨基酸對比見圖 3。SLA-DRA基因的氨基酸分子式為C2267H3777N759O941S208，分子量為 7 952，等電點(pI)理論值為 5.08，偏弱酸性。脂肪系數(shù)為 23.58，半衰期為 4.4 h，不穩(wěn)定系數(shù)為 50.11(<40 為穩(wěn)定蛋白)，屬于不穩(wěn)定蛋白質。蛋白質功能位點預測結果顯示：SLA-DRA基因氨基酸鏈包括2個N-糖基化位點(第141～143，244～246位)和 10 個磷酸化位點(第36，38，42，64，116，166，179，184，207，213位)。

波浪下劃線為N-糖基化位點；加粗下劃線為磷酸化位點；黑色方框為信號肽區(qū)域。The wave underline represents N-glycosylation site；Bold underlined represents phosphorylation site；Black box is signal peptide.

2.2.3SLA-DRA基因氨基酸序列的疏水性分析 對SLA-DRA基因氨基酸親水性進行預測，發(fā)現(xiàn) 4 個親水性密集區(qū)域(圖 4)：第 36～77 位、第 96～123 位、第 160～215 位和第 240～248 位，其中第 227 位的纈氨酸(Val)親水性最強，第 102 位的天冬氨酸(Asn)疏水性最強，總平均疏水系數(shù)為 0.842，為親水性蛋白質。

2.2.4SLA-DRA基因蛋白質的結構域分析 對蛋白質結構域進行預測，結果發(fā)現(xiàn)SLA-DRA基因存在1個信號肽區(qū)域(第1～23位)和2個免疫球蛋白結合域(Immunoglobulin domain)，分別位于：第 125～196 位 IGc1 域和第 199～251 位 C1 恒定區(qū)。

2.2.5SLA-DQA基因蛋白質高級結構的同源建模及合理性分析SLA-DRA基因的二級結構包含 α螺旋 59個(23.32%)，β 折疊25個(9.88%)，無規(guī)則卷曲96個(37.94%)和延伸鏈 73個(28.85%)(圖5)。以 SWISS-MODEL 數(shù)據(jù)庫序列4fqx.1.D(2.60?)為模板[18]，構建SLA-DRA基因蛋白質三維結構的同源模型，結果見圖6，該模型為單鏈空間構型，包括第 25～204 位氨基酸，該模型與模板序列相似性為0.58%，序列一致性達到 85.86%。全球模型質量評估(GMQE)得分為 0.79[19-20]。運用DeepView 軟件拉氏構象圖檢測同源模型的合理性，結果發(fā)現(xiàn)三維模型包括180 個氨基酸，其中173個氨基酸殘基(96.1%)的二面角落在允許的范圍內，僅有 7 個氨基酸殘基(3.9%)的二面角落在不允許范圍內(圖7)，SLA-DRA基因三維模型的二面角(φ，ψ)構象能量最低且穩(wěn)定，符合立體化學所允許的構象圖。

圖4 SLA-DRA基因 CDS 蛋白質親水性預測Fig.4 The hydropathicity prediction of SLA-DRA gene CDS protein

圖5 SLA-DRA基因 CDS 蛋白質二級結構預測Fig.5 Putative result of SLA-DRA gene CDS protein secondary structure

圖6 豬SLA-DRA蛋白三級結構模型預測Fig.6 Putative result of SLA-DRAprotein tertiary structure

A.允許區(qū)；B.臨界限制區(qū)；C.不允許區(qū)。A.Appropriate area；B.Critical limits area；C.Inadmissibility area.

2.2.6SLA-DRA基因 CDS 區(qū)蛋白質功能特性預測 對SLA-DRA基因的蛋白質功能進行預測，結果見表 5。由表 5 數(shù)據(jù)可以看出，SLA-DRA基因的蛋白在信號轉導、受體、脅迫應答、免疫應答和生長因子等方面的幾率均較高。

表5 SLA-DRA基因編碼蛋白質的功能預測Tab.5 Putative result of protein function between SLA-DRA gene

2.3 SLA-DRA 基因分子進化樹的構建

為了研究煙臺黑豬SLA-DRA基因的分子進化關系，利用 Mega 6.0 構建該基因及 GenBank 中檢索到的國內外共 28 個豬種SLA-DRA基因編碼區(qū)序列的分子進化樹。結果發(fā)現(xiàn)，煙臺黑豬SLA-DRA基因與其他豬種DRA基因同源性高達 99.0% 以上，分子進化樹如圖8所示。從圖8可以看出，煙臺黑豬SLA-DRA基因與廣西巴馬小型豬及雜交豬在同一進化支，同時與大白豬也具有相對較近的親緣關系。

圖8 煙臺黑豬 SLA-DRA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構建Fig.8 The phylogenetic tree construction of SLA-DRA gene in Yantai black pig

3 討論與結論

豬SLA基因是豬基因組中最具多態(tài)性的基因之一，SLAⅡ 類抗原能夠結合并呈遞外源性抗原多肽到免疫細胞，進行免疫應答[1]，SLAⅡ 類抗原的表達具有一種偏好性，與DQ抗原相比，DR抗原在 CD8+T 細胞能夠集中表達，在 CD4+T 細胞中少量表達[11]，而DR和DQ抗原可表達于 B 淋巴細胞和巨噬細胞表面，說明DRA基因的多態(tài)性與抗病能力具有非常重要關系，具有高度多態(tài)性的個體對環(huán)境和外界抗原的適應性能力比低度多態(tài)的個體更有優(yōu)勢。

目前 MHC 免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(IPD-MHC：http：//www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/sla/)已收錄了 169 條SLAⅡ 類等位基因，包括 82DRB1、44DQB1、20DQA和 13DRA。DRA基因屬于等位基因最少、多態(tài)性最低、相對保守的基因，有研究顯示DRA基因與人DRA基因序列同源性更高，且具有較一致的氨基酸長度[21]，對DRA基因的深入研究能夠為進一步揭示DRA基因的遺傳特征、免疫機制，并為異種移植的免疫排斥反應提供有價值的理論依據(jù)。

本研究在煙臺黑豬DRA基因 CDS 區(qū)共檢測到11個SNPs，共導致 7 個氨基酸發(fā)生變異，這些突變位點與大白豬、長白豬、杜洛克、八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬DRA基因的突變一致[7，14，22]，進一步證明了DRA基因具有較低的多態(tài)性。在DRA基因4個外顯子中，exon 4 的變異位點最多，多態(tài)性最為豐富，在其所形成的 8個基因型中，等位基因E只以雜合子形式存在，該種現(xiàn)象可能與近郊繁殖有關，仍需進一步研究確定。exon 4 主要編碼跨膜區(qū)和胞漿區(qū)，能夠通過該片段的疏水性區(qū)域插入細胞膜中，調節(jié)細胞膜的融合功能，其序列多態(tài)性的增加有利于細胞膜的跨膜運輸與信號轉導，誘發(fā)機體更強的免疫反應，在抗原的識別與遞呈、免疫應答與調控等方面產生影響[23]。

SLA-DRA基因 CDS 區(qū)全長為 759 bp，是完整的開放閱讀框區(qū)域，共編碼 252 個氨基酸和 1 個終止子，氨基酸的理化性質分析顯示，SLA-DRA基因蛋白質是一種偏酸性，不穩(wěn)定，親水性蛋白質，與吳雪斌[10]對長白豬的預測結果一致。煙臺黑豬的等電點值為 5.08，較之于八眉豬的等電點值 5.12偏低[14]。半衰期遠低于八眉豬的 30 h，賈浩等[24]認為蛋白質半衰期與其穩(wěn)定性之間具有一定的正相關性，半衰期越長則蛋白質越穩(wěn)定，說明煙臺黑豬SLA-DRA基因蛋白質穩(wěn)定性比八眉豬的低，這種現(xiàn)象可能與蛋白質的結構和生理功能相關，有待進一步研究。

糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，能夠調控蛋白質在組織和細胞中的定位、功能和活性，是與蛋白質結構和功能的關系密切的蛋白質修飾手段，其位點的變異可能與疾病的發(fā)生有關[25]，本研究預測到的氨基酸序列存在2個 N-糖基化修飾區(qū)：第 141～143位、244～246 位，在合作豬、荷包豬、大圍子豬、沙子嶺豬和八眉豬中均有報道，說明這2個糖基化位點序列高度保守，可能與其承擔重要的生物學功能有關。蛋白質磷酸化能夠改變激酶的活性和離子通道，調節(jié)蛋白質在信號轉導的過程，改變基因的表達，影響細胞的生產和分化[26]。本研究在煙臺黑豬中預測到 10 個磷酸化位點，涉及蛋白激酶C 和酪蛋白激酶等磷酸化作用，與劉麗霞等[14]預測的八眉豬SLA-DRA基因氨基酸鏈中含有11個潛在磷酸化位點基本一致。

煙臺黑豬DRA蛋白質結構域分析結果顯示，氨基酸序列第 1～23 位是信號肽區(qū)域，第 125～196 位形成了免疫球蛋白(IGc1)區(qū)，該段區(qū)域對應于 exon 3 序列，高度保守，因此，免疫球蛋白 C1 的高度特異性可能與SLAⅡ 類基因分子 α2 功能區(qū)在免疫過程中的重要作用緊密相關。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)第 199～251 位是免疫球蛋白的 C1 恒定區(qū)。有研究表明：Ig 和 Ig-like 主要分為 V 可變區(qū)、C1 恒定區(qū)和 C2 恒定區(qū)等[27]，C1 恒定區(qū)專一性與 MHC Ⅰ和Ⅱ 類復合體和不同的 T 細胞受體等分子相互作用，參與免疫系統(tǒng)反應，C1 恒定區(qū)還認為與抗體的效應功能相關，能夠激活補體，結合細胞表面的 Fc 受體，能夠介導抗體、補體與吞噬細胞表面結合的調理作用及超敏反應等過程[28]。

與其他豬種SLA-DRA基因蛋白質的結果相似，煙臺黑豬SLA-DRA基因蛋白質二級結構是含有α 螺旋(59 個)、β 折疊(25 個)、無規(guī)則卷曲(96 個)和延伸鏈(73 個)的混合模型，其三級結構是由DRA基因 exon 2、3 編碼的第 25～204 位氨基酸組成的單鏈空間構型，是蛋白質行使生物功能的主要區(qū)域，這與 exon 2、3 編碼 α 鏈功能區(qū)的作用緊密相關[4]。此外，SLA-DRA基因蛋白質的功能預測結果顯示信號轉導、受體、脅迫應答、免疫應答的幾率均略高于八眉豬，生長因子與八眉豬的一致[14]，說明DRA基因功能在不同品種豬間相對穩(wěn)定，且可能對豬的抗原遞呈、結合等免疫過程以及生產性能方面起到較高的調節(jié)作用。分子進化樹研究發(fā)現(xiàn)，煙臺黑豬DRA基因與其他豬種DRA基因同源性高達 99.0% 以上，在進化關系上與巴馬小型豬和雜交豬親緣關系較近，并且與大白豬隸屬同一進化分支，該結果可為煙臺黑豬進化起源研究提供理論依據(jù)。

煙臺黑豬SLAⅡ 類DRA基因 4 個外顯子具有不同程度的多態(tài)性，外顯子 4 多態(tài)性最為豐富，豬SLA-DRA基因多態(tài)性的差異與豬對疾病抵抗能力的強弱有關，SLA-DRA基因的蛋白質的二級結構都是親水性、不穩(wěn)定的混合蛋白，SLA-DRA基因可能對豬的抗原結合、呈遞能力和生產力起到較高的調節(jié)能力，本研究結果可為豬SLA-DRA基因作為某些經(jīng)濟性狀和抗病分子育種的候選基因和分子標記研究提供重要的參考。