金秀卿，張斌，李梅，聞鳳英，劉曉暉，王超楠，黃志銀

(1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津科潤蔬菜研究所，天津 300384)

大白菜干燒心病是我國近年來大白菜生產(chǎn)上繼三大病害之后，危害較為嚴重的一種病害[1-2]，是不可逆的生理病害之一，會造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]。干燒心病經(jīng)常和病原菌感染一起發(fā)生，進一步造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降[5]。干燒心病的成因極其復雜，現(xiàn)在人們普遍認為是由于鈣離子的缺失引起的生理性病害[6-9]。此外，由于干燒心病是數(shù)量性狀，受多基因控制，數(shù)量性狀在選擇中易受環(huán)境因素影響，因此成為育種工作的難點[10]。QTL定位與分子標記輔助選擇育種顯得尤為重要。國內(nèi)外有關大白菜干燒心病方面的報道主要集中在發(fā)病機理[2]、癥狀表現(xiàn)[11]、栽培防治[12-14]、遺傳規(guī)律[15]和室內(nèi)鑒定方法[16-17]等方面的研究，有關大白菜干燒心病QTL定位的研究雖然有一些報道，但目前研究尚少。孫秀峰等[18]首次將大白菜干燒心病的研究深入到分子方面，以F2作為群體，構建了AFLP分子遺傳圖譜，利用 MAPQTL 4.0 軟件檢測到與抗干燒心病有關的QTL位點共有4個，解釋的遺傳變異為11%～58.9%。李坤等[19]以F2群體為材料，利用SSR、SRAP分子標記，對大白菜干燒心病性狀相關的QTL與相應的連鎖關系進行分析，獲得2個與干燒心病性狀相關的QTL，都位于LG2連鎖群上，貢獻率分別為7.8%和16.5% 。黃萍等[20]報道了1個與大白菜干燒心病基因緊密連鎖的AFLP標記( E10/ M05)，E10/M05與大白菜干燒心病感病性狀是相連鎖的，此標記與干燒心病病情級數(shù)的相關系數(shù)為0.633，達到極顯著相關。石姜超[15]報道了2個與大白菜干燒心病基因連鎖的SRAP分子標記，遺傳距離分別為6.5，5.8 cM。對大白菜干燒心病性狀進行QTL定位，以期利用與QTL緊密連鎖的分子標記進行大白菜資源干燒心病抗性的輔助選擇。

1 材料和方法

1.1 永久群體和圖譜的構建

本研究材料黑227為青麻葉類型大白菜高代自交系，抗干燒心病；包頭型高代自交系B120，感干燒心病，由天津科潤蔬菜研究所提供。以黑227為父本、B120為母本配制雜交一代，通過游離小孢子培養(yǎng)的方法構建了含99個株系的DH群體為永久作圖群體。以該群體為試材已繪制完成一張大白菜遺傳圖譜。該圖譜含有108個標記位點(其中34個SSR標記，74個InDel標記)，全長1 004.7 cM，平均圖距9.30 cM，包含12個連鎖群，其中可與大白菜9條染色體一一對應[21]。

1.2 試驗設計

試驗分別在2015年春季和2016年春季進行，2015年播種日期為1月29日，定植日期為3月5日，調(diào)查日期為5月7日；2016年播種日期為2月14日，定植日期為3月15日，調(diào)查日期為5月17日。試材種植在天津市寶坻區(qū)農(nóng)業(yè)局農(nóng)場日光溫室中，各株系調(diào)查株數(shù)均為5株。種植密度為：行距50 cm，株距40 cm。常規(guī)栽培管理。

1.3 大白菜干燒心病的田間鑒定

春季在日光溫室進行DH群體的種植，根據(jù)田間干燒心病發(fā)病程度對每個株系進行病害分級，群體病情分級標準如表1所示，抗性歸類標準如表2所示，病情指數(shù)(DI) =∑(每個病級的植株總數(shù)×所歸類的級別數(shù))/(植株總數(shù)×最高級別數(shù))×100。將病情指數(shù)進行整理，用SPSS軟件對2年的結果進行統(tǒng)計，計算遺傳參數(shù)并繪制頻數(shù)分布直方圖。

表1 大白菜干燒心病病情分級標準

表2 大白菜干燒心病抗性歸類標準

1.4 大白菜干燒心病QTL定位

采用MapQTL 5.0進行QTL分析，首先使用置換測驗做1 000次重復，用于估算大白菜基因組范圍內(nèi)α=0.05水平上的LOD閾值。本研究中2015年使用的LOD閾值為7.7，2016年使用的LOD閾值為2.8。然后利用區(qū)間作圖法進行QTL分析，在每條染色體上每間隔1 cM的位置對QTL存在的可能性進行1次掃描。對于檢測到的QTL位點，將最高的LOD值所在位置的分子標記或與其緊密連鎖的分子標記作為協(xié)同因子，再對這些QTL位點進行多座位QTL模型檢測，將LOD值最高的位置作為本試驗QTL的位置，以2-LOD所在的區(qū)間作為95%的置信區(qū)間。QTL的命名規(guī)則為：干燒心性狀的英文縮寫+連鎖群號+QTL編號。

使用復合區(qū)間作圖法在大白菜全基因組范圍內(nèi)進行QTL掃描，用似然比LR大于11.5，即LOD值大于2.5來判斷QTL存在的閾值。

1.5 QTL 定位區(qū)域的序列分析

使用NCBI中的Blast 功能將檢測到的QTL 定位區(qū)域序列同大白菜全基因組序列進行比較，利用提供的基因注釋功能對QTL 定位區(qū)域中的所有候選基因進行分析。

2 結果與分析

2.1 大白菜干燒心病的抗性鑒定結果與遺傳分析

對本試驗中2015，2016年的親本、F1以及DH群體的抗病性進行調(diào)查，統(tǒng)計與分析的結果如表3所示。2015，2016年黑227的DI均為0，表現(xiàn)為高抗，B120 的 DI 分別為 82.14和85.71，表現(xiàn)為高感，F(xiàn)1的 DI 分別為16.67和15.43，介于2個親本之間，并且趨于抗病。根據(jù)2個年度大白菜DH群體鑒定得到的DI結果，繪制頻數(shù)分布直方圖(圖 1，2)。結果表明，本研究中所用DH群體2015年的DI結果不符合正態(tài)分布，而2016年該群體的DI結果服從正態(tài)分布，屬于數(shù)量性狀遺傳，該群體可以用于QTL分析。

圖1 2015年DH群體干燒心病病情指數(shù)的頻數(shù)分布圖Fig.1 Frequency distributions of disease index oftipburn in DH populations in 2015

圖2 2016年DH群體干燒心病病情指數(shù)的頻數(shù)分布圖Fig.2 Frequency distributions of disease indexof tipburn in DH populations in 2016

2.2 大白菜干燒心病抗性基因的 QTL 定位

利用MapQTL 5.0軟件進行QTL分析，2015，2016年連續(xù)2年的數(shù)據(jù)，對大白菜DH群體進行QTL定位，發(fā)現(xiàn)檢測到的QTL位點一致，可以認為是相同的 QTL，因此給予了相同的命名tb7.1，2次結果的遺傳貢獻率均大于10%，為主效QTL，該QTL位于 Chr.7上(圖3)，其中BrID10343為共分離標記，BrID10349為緊密連鎖標記，加性效應均為正值。

根據(jù) 2015年干燒心病抗性鑒定結果，tb7.1位于標記BrID10343和BrID10349之間，距離兩側標記的遺傳距離分別為6.9，5.0 cM，2個標記的LOD 值分別為9.91，9.72，遺傳貢獻率分別為41.5%，41.1%，tb7.1為增效位點，加性效應為正值。根據(jù) 2016年干燒心病抗性鑒定結果，2個標記的LOD 值分別為4.46，4.10，遺傳貢獻率分別為19.6%，18.2% (表4)。

表3 親本、F1的病情指數(shù)及DH群體的遺傳參數(shù)

表4 2015，2016年大白菜干燒心病抗性基因的 QTL 分析

圖3 大白菜Chr.7分子遺傳圖譜Fig.3 Molecular genetic linkage mapof Chinese cabbage chromosome 7#

2.3 干燒心病抗性基因所在區(qū)域的生物信息學分析

利用BRAD (http：// brassicadb.org/brad/index.php)的BlastP工具獲得與大白菜中相對應的擬南芥中的同源基因及基因注釋功能，對大白菜干燒心病抗性基因QTL所在區(qū)域進行了序列分析，發(fā)現(xiàn)標記BrID10343和BrID10349間的物理距離為903.61 kb，在這兩標記區(qū)間共有202個候選基因(圖3)。這些候選基因主要分為以下幾類：鋅指結構、轉(zhuǎn)運蛋白、酶類、轉(zhuǎn)錄因子以及3個 NBS 抗病基因(Bra016029、Bra016028、Bra016027)(表5)，這些抗病候選基因是下一步工作的研究重點。

表 5 大白菜干燒心抗性基因的預測結果Tab. 5 Results of tipburn resistance gene prediction in Chinese cabbage

3 討論

3.1 關于2015，2016年DH群體的參數(shù)分析

根據(jù)2015，2016年的數(shù)據(jù)，通過計算偏度g1和峰度g2及其標準誤σg1及σg2然后作U檢驗。U檢驗公式為和。根據(jù)2015年的數(shù)據(jù)，0.116/0.343<1.96，1.464/0.674>1.96，該組資料不服從正態(tài)分布。根據(jù)2016年的數(shù)據(jù)，0.717/0.386<1.96，0.064/0.411<1.96，2種檢驗同時得出U0.05的結論，可以認為該組資料服從正態(tài)分布。

3.2 關于2015，2016年DH群體干燒心病病情指數(shù)分布的差異

2年的病情指數(shù)分布存在差異，可能有以下幾個原因：①群體2年所處的自然環(huán)境存在差異，包括光照、水分、溫度、濕度等，導致發(fā)病程度不一。②由于土地面積原因，每種材料種植的數(shù)量較少，應盡可能擴大樣本容量，減少引起的抽樣誤差。③對于抗性鑒定的分級，受到筆者經(jīng)驗的影響，存在主觀因素。但2年均定位到同一位點，并且LOD遠遠大于2.5，說明定位結果的可靠性。

3.3 關于大白菜干燒心病的分子標記

由于大白菜干燒心病的鑒定易受環(huán)境因素的影響，比較費時費力，研究者們主要利用MAS 育種選擇抗病品種，以提高育種效率。然而，目前與大白菜干燒心病抗性基因緊密連鎖的分子標記報道較少，且大多為 SRAP和AFLP標記，由于這些標記的連鎖距離不夠緊密，加上 SRAP 和AFLP技術的局限性，導致前人研究結果對于MAS育種的應用性不強。

本研究首次利用InDel標記對大白菜干燒心性狀進行了定位，相較于孫秀峰等[22]和黃萍等[20]利用的AFLP標記，李坤等[19]和石姜超等[11]利用的SRAP標記、InDel標記具有許多優(yōu)點，它廣泛存在于基因組中，并且穩(wěn)定性高，重復性好，易于操作，多態(tài)性水平高[23]。InDel標記的開發(fā)，對基因精細定位的研究和分子標記輔助育種具有重要的價值。

3.4 關于大白菜干燒心病抗性基因的QTL定位

目前，大白菜干燒心QTL的定位只是在各自構建的連鎖群上，沒有實現(xiàn)與染色體的對應，彼此之間的 QTL 也很難進行比較分析。本研究首次利用DH群體將大白菜干燒心病抗性QTL 定位到了大白菜染色體上。筆者嘗試將本研究QTL 定位的結果與前人的結果進行對比分析，但由于沒有發(fā)現(xiàn)共用的分子標記，所以無法進行比較。

QTL定位是采用田間試驗與分子標記分析相結合的方法進行的，因此它是連接作物遺傳和育種的紐帶。與大白菜干燒心基因緊密連鎖的分子標記的開發(fā)為大白菜主要經(jīng)濟性狀分子標記輔助選擇提供了理論基礎。

3.5 關于大白菜干燒心病抗性基因主效 QTL 的生物信息學分析

在大白菜干燒心病抗性基因主效QTL所在區(qū)域預測到了3個抗病基因Bra016029、Bra016028、Bra016027，這些基因?qū)⑹墙窈笱芯康闹攸c。