范 強，王 樂，謝彩玲，張 寧，司懷軍，吳家和

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學 生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國科學院 微生物研究所，植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101)

棉花(Gossypiumspp.)是錦葵科棉屬草本植物，涉及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和紡織業(yè)，在日常生活中具有重要作用[1]。然而棉花黃萎病(Verticilliumwilt)嚴重制約著棉花的生產(chǎn)，它是一種土壤傳播的維管束病害[2]。黃萎病病原菌為大麗輪枝菌，該真菌屬于半知菌亞門輪枝菌屬。病原菌從棉花根部入侵，植株發(fā)病后會嚴重影響棉花的纖維產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。因此，分離和解析抗病功能基因已成為棉花抗病研究的一個重要方向。

植物毒素冠菌素不敏感因子(Coronatine-insensitive 1， COI1)是茉莉酸(Jasmonate， JA)信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子。在擬南芥中，COI1缺失突變體表現(xiàn)為對各種茉莉酸應答反應不敏感或者不響應，在受到病原菌侵染時不能啟動相應的應答反應[4]。植物中COI1與JAZ結(jié)合參與SCFCOI1(Skpl-Cullin-F-box protein， SCF)復合物的形成，這個復合物組成蛋白的缺失突變體，如AXR1、CUL1等都表現(xiàn)為茉莉酸不敏感，從而喪失抗病性[5]。研究表明COI1處于JA信號通路的上游，其功能的喪失會引起JA信號通路的中斷[6]。雖然COI1在擬南芥、煙草等模式植物中的研究比較清楚，但是有關(guān)棉花COI1和其在JA信號轉(zhuǎn)導途徑的研究還未見報道。

本研究從陸地棉中分離一個棉花COI1基因，并利用病毒誘導基因沉默(Virus-induced gene silencing， VIGS)技術(shù)從棉花植株沉默該基因表達[7]。對沉默植株接菌研究表明，抑制GhCOI1基因表達會減弱對大麗輪枝菌的抗性。總之，GhCOI1基因參與了棉花的抗病反應，促進棉花對大麗輪枝菌的抗性。因此，該基因可以作為棉花抗病育種的候選基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

棉花材料為陸地棉品種中棉所35，由山西農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所資源室提供。所用VIGS系統(tǒng)載體煙草脆裂病毒(TRV)干擾表達載體pYL-156和輔助載體pYL-192由清華大學劉玉樂教授惠贈。陽性對照載體pYL-156-PDS、農(nóng)桿菌GV3101、LBA4404和棉花黃萎病菌菌系 V991(Verticilliumdahliaestrain V991)均由植物基因組學國家重點實驗室保存。

PCR(Polymerase chain reaction)擴增所用試劑和酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒、pEASY-T1克隆載體試劑盒和大腸桿菌感受態(tài)細胞等購自北京全式金生物技術(shù)有限責任公司，qPCR試劑盒(SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit)購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 將中棉所35種植在直徑20 cm花盆里，培養(yǎng)土為富含腐殖質(zhì)的營養(yǎng)土?；ㄅ璺胖糜?6 h/8 h光照/黑暗、28 ℃的溫室中培養(yǎng)。

1.2.2 棉花RNA提取及cDNA的合成 稱取一定量的棉花樣品，液氮研磨成粉末。用RNA提取試劑盒分離棉花樣品的總RNA。取2 μg總RNA，50 pmol的Anchored Oligo(dT)18用于第1鏈cDNA的合成，具體步驟參照逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒說明書進行。獲得的cDNA用于基因克隆及表達分析。

1.2.3GhCOI1克隆和沉默載體構(gòu)建 為了分離GhCOI1基因，分析棉花基因組序列(http：//cgp.genomics.org.cn)，設計1對特異引物，引物序列為：(F：5′-ATGGGGGAAAATTATAACG-3′，R：5′-TTATAAACTTATACTCCT-3′)。以生長21 d棉花整株cDNA為模板進行PCR擴增，擴增片段被亞克隆到pEASY-T1載體上，然后進行測序鑒定。

為了構(gòu)建GhCOI1基因的病毒沉默載體，首先利用生物信息學技術(shù)分析GhCOI1基因的序列，發(fā)現(xiàn)753～1 025核苷酸序列片段是該基因特異的序列，設計引物(GhCOI1VF：5′-CCGGAATTCCAACGGTGGTTCTTTCTACG-3′，GhCOI1 VR：5′-CGCGGATCCCTTACAACTTCGGGCAACA-3′，下劃線部分為保護堿基及酶切位點)進行PCR擴增，獲得該特異片段。通過EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切擴增產(chǎn)物和pYL-156載體，純化后進行連接反應，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中得到重組載體[8]。最后將重組載體進行雙酶切和測序驗證，獲得帶有目的基因片段的質(zhì)粒，命名為pYL-156-GhCOI1。

1.2.4 序列分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 將GhCOI1與其他物種的COI1蛋白進行同源比對分析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并用Clustalx 2.1進行多重比對，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。通過在線Protparam工具(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)將ORF(Open reading frame)翻譯成氨基酸序列，并對其蛋白質(zhì)進行分析，如等電點、結(jié)構(gòu)域等。

1.2.5 沉默GhCOI1植株的培育 將重組質(zhì)粒pYL-156-GhCOI1通過電擊的方法導入農(nóng)桿菌GV3101中。電擊完成的農(nóng)桿菌利用含有卡拉霉素(Kan)和利福平(Rif)的固體LB培養(yǎng)基進行劃線培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后，挑單克隆在含有Kan(50 μg/mL)和Rif(25 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基再次進行過夜培養(yǎng)。取過夜后的菌液于10 mL離心管中，4 000 r/min離心15 min棄上清液，加入適量重懸液(重懸液成分MgCl210 mmol/L，AS 200 μmol/L，MES 10 mmol/L)重懸菌體，并測OD值調(diào)整到OD600=1.5左右。再分別將含pYL-156-GhCOI1、pYL-156、陽性對照pYL-156-PDS與pYL-192菌液按體積比1∶1 混合，室溫下靜置3 h待用。

溫室中培養(yǎng)的棉花子葉平展時(一般7～10 d)，用針頭在子葉背面輕劃出小傷口，用去掉針頭的1 mL注射器將混合菌液從背面注入子葉中，盡量使整個子葉被侵染。注射后的植株避光處理12 h后，再次置于光照下培養(yǎng)。每個試驗單元進行3次生物學重復。

1.2.6 RT-PCR和qPCR分析 RT-PCR檢測：利用樣品cDNA為模板，采用半定量RT-PCR方法檢測GhCOI1的表達水平。特異引物為F：5′-AGGAGGTTGCTTCTTCAGC-3′，R：5′-CGGATGCTCTACCACGACTA-3′，擴增片段大小為214 bp，選用Actin為內(nèi)參基因來進行半定量。

qPCR檢測方法：將cDNA模板稀釋10倍，反應體系為20 μL，具體步驟參照試劑盒說明書進行，40個循環(huán)后作熔解曲線。設計特異性引物(F：5′-TTACACGACGAGTCCCGAAC-3′，R：5′-GCACCGATTTCAAGCAAGTC-3′)，以Actin為內(nèi)參，獲得的結(jié)果采用2-ΔCt或2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量，試驗重復3次。

1.2.7 大麗輪枝菌接種棉花 取出保存于-80 ℃冰箱中的大麗輪枝菌，在冰上溶解后，吸取50 μL孢子液涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基[9]。在25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 d。用打孔器取出菌絲塊，置于Czapek′s液體培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)7 d(25 ℃，120 r/min)后用雙層醫(yī)用紗布過濾出去菌絲[10]。通過血球計數(shù)板來統(tǒng)計真菌孢子濃度，并用無菌水將濾液調(diào)整到適宜濃度備用。

為了驗證GhCOI1的抗病功能，采用直接注射法進行孢子接種。首先選用1 mL注射器針頭在棉花植株子葉節(jié)以下1 cm處向下輕劃，然后在傷口處滴加3～5 μL已經(jīng)制備好的孢子液，待植株將液滴完全吸入后放置到溫室中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如上所述。接菌后觀察植株生長和發(fā)病情況，在21 d后統(tǒng)計發(fā)病株數(shù)和發(fā)病程度，計算病株率和病情指數(shù)。相同的試驗進行3次重復。

另外，為了分析GhCOI1基因?qū)Υ篼愝喼膽鸱磻?，采用水培接菌法進行試驗。簡單的步驟為：將發(fā)芽好的棉花種子定植到水培培養(yǎng)盒中，水培液中加入1/16 MS培養(yǎng)基無機鹽，培養(yǎng)盒放在溫室中，培養(yǎng)條件如上所述。待棉花苗生長到2片真葉時，將棉花根浸染在上述制備好的大麗輪枝菌孢子液中30 min，然后再轉(zhuǎn)到水培盒中繼續(xù)培養(yǎng)。然后進行不同時間的根器官取樣，取樣時間為0，3，12，36，48 h，收集根材料用流水洗凈并用滅菌的濾紙將多余水分吸干，放于-80 ℃冰箱中備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花COI1基因克隆和序列分析

使用植物RNA提取試劑盒分別提取棉花根、莖、葉的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳對不同組織器官的總RNA進行分離，圖1-A顯示這些總RNA包含清晰的28S和18S RNA條帶，表明這些RNA的質(zhì)量較好，能夠用于后續(xù)的分子研究。根據(jù)棉花基因組數(shù)據(jù)庫(http：//cgp.genomics.org.cn)釋放的GhCOI1基因序列，設計1對特異性引物，以棉花根的cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物在凝膠電泳上顯示出2 213 bp大小的目的基因(圖1-B)。利用膠回收試劑盒，將上述擴增產(chǎn)物切膠回收，回收產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果表明獲得的目的序列與棉花基因組釋放的GhCOI1序列一致(圖2)。

A.棉花不同組織器官總RNA的電泳圖；B.GhCOI1基因的PCR擴增。-CK.水為陰性對照；M.DNA分子量。A. Isolation of total RNA from cotton root， stem and leaf；B. Detection of GhCOI1 gene by PCR amplification.-CK.H2O used as negative control；M.DNA molecular marker.

通過生物信息學分析，GhCOI1蛋白含有600個氨基酸，分子量大小為68 kDa，其等電點pI為7.06，在多肽的N端含有典型F-box，在C端富含亮氨酸重復序列(Leueine rich repeat， LRR)結(jié)構(gòu)域(圖2)。

在NCBI上選取與GhCOI1直系同源的不同植物進行分析，它們包括TcCOI1、VvCOI1、GmCOI1、PtCOI1、SlCOI1、MtCOI1、AtCOI1。多重序列比對分析表明這些COI1蛋白在氨基酸序列進化組成上差異較小，具有較高的同源性，并都具有典型的F-box和LRR保守區(qū)域(圖3-A)。再將棉花COI1蛋白與上述所選的植物COI1蛋白進行系統(tǒng)進化分析，利用Clustalx 2.1分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining， NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。圖3-B顯示GhCOI1和TcCOI1蛋白高度相似，同時從進化的相似程度來看，該蛋白在植物進化中變異速度較慢。

框里氨基酸代表F-box；下劃線氨基酸代表亮氨酸重復序列。

2.2 GhCOI1基因組織器官表達分析

為了分析GhCOI1基因在棉花不同營養(yǎng)器官中的表達情況，利用RT-PCR和qRT-PCR分析棉花GhCOI1在根、莖、葉中的表達水平。以棉花Actin作為內(nèi)參基因來均一化各棉花組織器官的表達量，半定量和定量qPCR分析結(jié)果均表明，GhCOI1在陸地棉的根、莖、葉中均有表達，但是在根中優(yōu)勢表達，莖中表達量最低(圖4)。

2.3 大麗輪枝菌對GhCOI1的誘導表達分析

用大麗輪枝菌接種生長2片真葉的棉花，分別提取接種后0，3，12，36，48 h的根，通過qPCR檢測GhCOI1基因的表達情況，以棉花Actin為內(nèi)參基因。結(jié)果表明GhCOI1的表達受到病原菌的誘導，表達量隨著誘導時間的增加而上升，在接種病原菌12 h時表達水平達到高峰，此后略有下降(圖5)。結(jié)果說明GhCOI1可能參與棉花的抗病反應。

2.4 GhCOI1基因沉默減弱棉花抗病性

選取GhCOI1基因特異核苷酸序列(圖6方框中所示)作為基因沉默的靶序列，這段序列覆蓋A、D亞組的2個拷貝。利用PCR技術(shù)克隆了這個片段，然后插入到煙草脆裂病毒TRV載體中，構(gòu)建了病毒沉默載體pYL-156-GhCOI1(圖6-A)。把pYL-156-GhCOI1和標記載體pYL-156-PDS以及輔助載體pYL-192通過農(nóng)桿菌注射法感染棉花子葉，獲得VIGS棉花植株。感染14 d后，注射標記基因PDS的VIGS植株葉片沿著葉脈呈現(xiàn)白色，隨著時間的延長，葉片失綠加重，直至全白；而注射空載體的陰性對照葉片仍然為綠色(圖6-B)。標記基因的沉默表型表明TRV系統(tǒng)在棉花植株中已經(jīng)成功地進行基因沉默。為了分析VIGS植株中GhCOI1基因的抑制水平，利用RT-PCR和qPCR方法分別分析了沉默植株的表達情況，結(jié)果表明，目標基因GhCOI1已經(jīng)被成功地抑制，平均抑制水平在90%以上(圖6-C)。

選擇GhCOI1基因抑制較好的VIGS植株進行大麗輪枝菌接菌處理，分析該基因在棉花抗病中的功能。對鑒定過后的沉默植株進行子葉節(jié)下方注射孢子，接菌處理21 d后進行分析。結(jié)果表明，所有接種黃萎病菌的植株均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，葉片出現(xiàn)黃化、萎蔫并脫落，植物生長狀況較差。相較于對照植株，沉默植株發(fā)病癥狀更加嚴重(圖7-A)。發(fā)病株率和病情指數(shù)(DI)分析表明，GhCOI1基因沉默植株明顯高于對照(圖7-B)，暗示該基因的沉默降低了棉花的抗病能力。

A.不同種植物COI1的氨基酸序列多重比對；B.不同種植物COI1蛋白的系統(tǒng)進化樹分析；劃線部分為保守結(jié)構(gòu)域F-box和LRR。

圖4 棉花不同組織中GhCOI1的表達情況Fig.4 The relative expression levels of GhCOI1 in different tissues of cotton

圖5 棉花受到大麗輪枝菌侵染后GhCOI1基因在不同時間段的表達情況Fig.5 The relative expression levels of GhCOI1 incourse of time under V.dahliae infection

3 討論

棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，其生產(chǎn)的天然纖維是紡織工業(yè)的重要原材料。隨著人們生活質(zhì)量的日益提高，對棉紡織業(yè)的要求也愈來愈高。因此，提高棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量成為當前棉花生產(chǎn)的主要目標。然而棉花病蟲害的危害嚴重地制約了棉花的生產(chǎn)，尤其棉花黃萎病的危害大大降低了棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量[11]。當前由于棉花缺少黃萎病的抗原，造成棉花抗病育種裹步不前[12]。利用基因工程分子育種技術(shù)也是目前改良植物抗病性的一個主要手段，其中最主要的是抗病基因的分離和功能鑒定。在這個研究中筆者分離了一個棉花抗病相關(guān)基因COI1，研究報道說明COI1是JA信號途徑中的一個重要成分，參與植物的抗性，包括生物和非生物逆境的抗性。通過VIGS的手段來沉默基因的表達，并對沉默植株進行接菌分析，研究表明，GhCOI1參與了棉花對大麗輪枝菌的抗性。因此，該基因可以作為棉花抗病育種的一個候選基因。

A.沉默載體構(gòu)建示意圖；B. GhPDS沉默植株的葉片漂白表型；C.GhCOI1基因沉默效果；

A．GhCOI1基因沉默植株的抗病性下降；B.病株率(左圖)和病指(右圖)分析。

研究表明，GhCOI1基因受到大麗輪枝菌浸染的誘導，其表達量隨著浸染時間的延長呈現(xiàn)上調(diào)，結(jié)合利用VIGS的反向遺傳學方法確證了GhCOI1正調(diào)控棉花對大麗輪枝菌的抗性。有研究指出，COI1作為JA分子的一個共受體(Co-receptor)參與SCFCOI1復合體的形成[13]。目前大量研究數(shù)據(jù)表明，JA在植物抗逆反應中發(fā)揮著重要的作用，JA直接調(diào)控防衛(wèi)化學物質(zhì)的合成與代謝，最終精細調(diào)控植物對病原微生物或逆境的抗性反應[14]。COI1蛋白的抗性功能已在多種植物進行報道，如擬南芥、番茄、煙草、大豆和水稻等[15-21]。本研究在棉花中研究結(jié)果也表明GhCOI1也參與棉花黃萎病的抗性反應，進一步確證了COI1是一個JA抗病途徑中主要成分，是植物抗病反應中重要調(diào)控蛋白。

本研究中分離的棉花GhCOI1基因在根器官中優(yōu)勢表達，在莖中表達量較低，并受到大麗輪枝菌浸染的誘導。沉默GhCOI1基因棉花的抗病性減弱，說明該基因編碼的蛋白是棉花抗病反應的一個正調(diào)控因子，可以考慮作為棉花抗病育種的候選基因。然而有關(guān)該蛋白過量表達是否能夠提高棉花的抗病性，以及其是否和擬南芥等植物中擁有一樣的抗病機制等問題，有待于進一步的研究和探討。