張秦鋒，韓立娟，劉 勝，杜宣利，唐佳芮，汪月月，胡志雄,3，張維農(nóng),3，齊玉堂

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023; 2.西安中糧工程研究設計院有限公司，西安 710082; 3.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430023)

Fenton-熒光法快速測定食用油中PAEs總量的研究

張秦鋒1，韓立娟1，劉 勝1，杜宣利2，唐佳芮2，汪月月1，胡志雄1,3，張維農(nóng)1,3，齊玉堂1

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023; 2.西安中糧工程研究設計院有限公司，西安 710082; 3.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430023)

建立了一種Fenton氧化結(jié)合熒光法快速測定食用油中鄰苯二甲酸酯(PAEs)的新方法。食用油樣品中的PAEs經(jīng)乙腈萃取濃縮、堿性條件下水解后，利用Fenton反應生成熒光性能較強的羥基鄰苯二甲酸類物質(zhì)進行間接熒光定量測定。對影響衍生化效率的水解條件及Fenton反應進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：優(yōu)化條件下，該方法具有較高的靈敏度，較好的線性關(guān)系(R2=0.999 2)及重復性(相對標準偏差0.35%～5.46%)，檢出限和定量限分別為0.05、0.15 nmol/mL，回收率在84.52%～100.13%之間。適合于食用油批量樣品的PAEs總量安全初篩過程中的高通量測定。

鄰苯二甲酸酯；食用油；Fenton氧化：熒光法

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一類世界范圍內(nèi)無處不在的化學物質(zhì)，具有較高的logKow值(大于4)，較易分散于富含油脂的食物中，而食用油多使用塑料包裝材料且儲存期限較長[1-2]，所以對于食用油中的PAEs類物質(zhì)進行定量檢測對保障消費者的健康具有非常重要的意義。目前，對于PAEs類物質(zhì)的測定方法主要包括：高效液相色譜法(HPLC)[3]，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[4-5]，氣相色譜法(GC)[6]，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[7-9]。Holadová 等[10]利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜定量檢測植物油中的6種PAEs(DMP、DEP、DnBP、BBP、DEHP、DnOP)，通過向食用油基質(zhì)中添加甲醇促進PAEs從基質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚二甲基硅氧烷萃取頭，從而完成預處理凈化過程，然后利用電子俘獲檢測器進行檢測，方法在加標水平2 mL/kg下的相對標準偏差為14%～23%。Sun等[11]使用甲醇在微波輔助下萃取食用油中的PAEs，然后利用凝膠滲透色譜及C18固相萃取柱進行凈化處理，最后使用GC-MS定量檢測20種PAEs，方法定量限為0.78～4.51 μg/kg，回收率為93.04%～104.60%?？梢钥闯?，基于色譜類的分析方法靈敏度高、準確性好，但為了排除食品基質(zhì)的干擾，通常需要進行較復雜的樣品預處理過程，耗時較長，測試成本高，在需要對大批量樣品進行高通量測定時，其弱勢尤為明顯。

Fenton反應發(fā)現(xiàn)于1894年，F(xiàn)enton[12]報道過氧化氫能夠被亞鐵鹽類激活從而氧化酒石酸。近年來，F(xiàn)enton反應被引入PAEs物質(zhì)的測定中，如李滿秀等[13]利用Fenton反應將PAEs水解生成的鄰苯二甲酸氧化生成含羥基的鄰苯二甲酸類物質(zhì)，提高其熒光效率，對環(huán)境樣品中的PAEs獲得較好測定效果。為了達到批量樣品高通量測定的要求，本研究提出一種對于食用油中PAEs類物質(zhì)進行分級篩選測定的思路，即采用高通量的光譜法進行PAEs類物質(zhì)總量閾值初篩，對可疑陽性樣品采用色譜法進行復核準確測定種類及含量。為此，本研究建立了一種Fenton-熒光法測定食用油中PAEs物質(zhì)總量的方法，其原理在于：提取食用油中PAEs物質(zhì)，首先通過堿性水解得到鄰苯二甲酸(PA)并利用Fenton反應衍生化，然后采用熒光光譜定量檢測得到的羥基鄰苯二甲酸(HPA)，最終通過計算間接得到PAEs總量。在本研究中，為了提高該方法的檢測效果，對影響檢測靈敏度的條件進行了優(yōu)化，并在優(yōu)化條件下，對5種常見食用油樣品進行了PAEs總量檢測、評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

不同種類食用油樣品購于本地超市并儲存于陰涼干燥處。鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)標準品，純度99%，購于阿拉丁生化科技股份有限公司。氫氧化鈉、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、七水合硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、30%過氧化氫，分析純；乙腈、己烷，色譜純，均購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗中所用水均為Milli-Q 超純水系統(tǒng)凈化得到的超純水。

1.1.2 儀器與設備

TG-16臺式低速離心機；F-4600熒光光譜儀，日本株式會社日立制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 空白食用油樣品及混合標準溶液的制備

向食用油樣品中按料液比1∶10加入乙腈，渦旋混合2 min后于4 000 r/min離心5 min棄去上清液。重復多次直至樣品中PAEs總量低于檢出限，即為空白食用油樣品，將其儲存于磨口玻璃廣口瓶中，并避光置于干燥處。將適量DMP、DBP、DEHP、DINP溶于正己烷中制備濃度為1.0 mmol/L的標準溶液，并按體積比1∶1∶1∶1將4種標準溶液混合、搖勻即得混合標準溶液，置于避光干燥處備用。

1.2.2 液液萃取食用油中的PAEs

稱取1.00 g食用油樣品于50 mL玻璃離心管中，加入5.0 mL乙腈渦旋混合2 min，4 000 r/min離心收集上清液，重復3次合并上清液。將所得萃取液轉(zhuǎn)移至25 mL玻璃具塞比色管中并氮吹至干，加入1.0 mL乙腈溶解待測。

1.2.3 PAEs的堿性水解

向1.0 mL PAEs待測液中加入10.0 mL(0.2 mol/L)氫氧化鈉溶液，渦旋混合30 s后于90℃恒溫水解90 min，水解過程中間歇性振蕩。水解液冷卻至25℃后使用鹽酸調(diào)節(jié)至pH 7.0。

1.2.4 Fenton氧化-熒光衍生化

選擇EDTA螯合亞鐵離子作為Fenton反應的催化劑。向水解液中依次加入7.0 mL(0.2 mol/L)磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)，0.4 mL(5.0 mmol/L)EDTA-Fe(Ⅱ)溶液，1.0 mL 3%過氧化氫溶液，25℃反應60 min后檢測熒光強度。為了優(yōu)化水解及衍生化條件，分別選取氫氧化鈉濃度、水解溫度、水解時間、EDTA-Fe(Ⅱ)添加量、過氧化氫體積、反應時間進行單因素實驗。

1.2.5 熒光光譜條件

激發(fā)波長305 nm，發(fā)射波長410 nm，光柵狹縫10 nm，光電倍增管電壓600 V，掃描速率240 nm/min。

1.2.6 標準曲線

將0.75～100 μL混合標準溶液加入空白食用油樣品中使得PAEs濃度為0.75～100 nmol/mL，渦旋混合5 min，然后按1.2.2～1.2.5方法處理并測定、記錄相應熒光強度，繪制標準曲線。

1.2.7 方法學驗證

稱取1.00 g空白食用油樣品于25 mL玻璃離心管中，分別加入5.0、10.0、20.0 μL混合標準溶液使得PAEs濃度為5.0、10.0、20.0 nmol/mL，渦旋混合5 min后依照1.2.2～1.2.5方法進行處理，并測定其熒光強度，每種標準溶液的不同質(zhì)量濃度的添加樣品重復測定3次，根據(jù)所得結(jié)果計算回收率與相對標準偏差，評價該方法的準確度與重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

食用油是一類成分較為復雜的樣品，不僅自身化學成分復雜，而且還可能含有營養(yǎng)強化成分(如甾醇、維生素E、谷維素等)、痕量污染物(如苯并芘、3-氯-1,2-丙二醇等)。為了采用該方法對食用油中PAEs進行測定，需要對樣品進行預處理，以便提高檢測靈敏度、減少其他物質(zhì)的干擾。實驗發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為萃取劑對PAEs具有較好提取、富集效果，其沸點較低、易揮干濃縮，且水溶性好，預處理后的樣品可直接應用Fenton-熒光法進行測定，因此本實驗選定方法1.2.2對食用油樣品進行預處理。經(jīng)Fenton反應處理后，測得樣品溶液最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為305 nm和410 nm(激發(fā)通帶和發(fā)射通帶均為10 nm)。

2.1 條件參數(shù)優(yōu)化

PAEs的水解和Fenton氧化過程是該方法的關(guān)鍵步驟，為了提高該方法的靈敏度，分別對PAEs的水解條件及Fenton氧化條件進行了優(yōu)化。

2.1.1 水解條件參數(shù)優(yōu)化

水解需要保證所有的PAEs均轉(zhuǎn)化為PA，Albro等[14]研究發(fā)現(xiàn)10.0 mL尿液樣品(PAEs濃度大于0.5 nmol/L)在堿性條件下于(95±5)℃水解90 min后，DMP、DEP、DBP及DOP均得到完全水解，但僅60%的DEHP得到了水解，這說明具有較長烷基鏈的PAEs相對于具有較短烷基鏈的PAEs水解速率更慢，水解更困難。故本實驗中采用小幅度提升氫氧化鈉添加量的方式，以加快水解速率，并以具有較長烷基鏈、相對較難水解的DEHP作為PAEs的代表性物質(zhì)對后續(xù)水解條件進行優(yōu)化。

固定其他反應條件不變，分別測定水解的氫氧化鈉濃度、水解溫度和水解時間對最終生成HPA的熒光強度的影響，結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1 氫氧化鈉濃度對HPA熒光強度的影響

從圖1可以看出，HPA的熒光強度隨著氫氧化鈉濃度的增大而升高，并在0.2 mol/L時達到最大，繼續(xù)提高氫氧化鈉濃度后熒光強度逐漸下降。故選取最佳氫氧化鈉濃度為0.2 mol/L。

圖2 水解溫度對HPA熒光強度的影響

從圖2可以看出，HPA的熒光強度隨著水解溫度的升高而增大，說明PAEs的水解速率是逐漸增大的，這與Ostrovsk等[15]的報道是一致的。但由于該反應體系是在水相中進行，過高的水解溫度會加速體系中水的蒸發(fā)，故最佳水解溫度選取90℃。

圖3 水解時間對HPA熒光強度的影響

從圖3可以看出，在水解溫度90℃下，逐漸延長水解時間，HPA的熒光強度隨著水解時間的延長逐漸增大，并在90 min時達到最大，而繼續(xù)延長水解時間熒光強度保持相對穩(wěn)定。這一變化趨勢說明在90℃下水解90 min即可實現(xiàn)具有不同烷基鏈長度的PAEs的完全水解，故選取最佳水解時間為90 min。

2.1.2 Fenton氧化條件參數(shù)優(yōu)化

如Pignatello等[16]所述，F(xiàn)enton氧化反應中的EDTA-Fe(Ⅱ)添加水平、過氧化氫體積和反應時間對衍生化效果具有重要的影響，故本研究針對上述3個因素進行優(yōu)化，結(jié)果分別如圖4～圖6所示。

圖4 EDTA-Fe(Ⅱ)添加量對HPA熒光強度的影響

從圖4可以看出，亞鐵離子作為Fenton氧化反應中的催化劑[17]，其濃度較低時會造成整體反應速率降低，但其濃度過大時，多余的Fe2+容易轉(zhuǎn)變?yōu)殍F離子并產(chǎn)生沉淀從而影響反應的持續(xù)進行。故選取0.4 mL為最優(yōu)添加量。

圖5 過氧化氫體積對HPA熒光強度的影響

過氧化氫是反應中·OH的唯一來源，但其添加量過多時會發(fā)生多種副反應[16]，產(chǎn)生諸如過氧自由基(·OOH)等與·OH存在競爭作用的副產(chǎn)物，進而影響反應的進行，引起HPA熒光強度的降低(見圖5)。故選取過氧化氫體積1.0 mL。

圖6 反應時間對HPA熒光強度的影響

除此之外，由于·OH的壽命極短，隨著反應的進行不斷生成也不斷被消耗，生成速率大于消耗速率，因此直至反應結(jié)束，HPA熒光強度隨著·OH含量的變化呈緩慢增加趨勢(見圖6)。故選擇60 min為最終反應時間。

2.2 分析方法特性

在優(yōu)化水解和氧化條件下，按照1.2.2、1.2.3中所述方法，利用HPA熒光強度與PAEs總量的對應關(guān)系對不同濃度梯度PAEs混合標準溶液進行熒光強度定量測定，所得結(jié)果擬合得到線性回歸曲線。HPA的熒光強度與PAEs總量在PAEs質(zhì)量濃度范圍0.75～100.00 nmol/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，并且不同單一標準溶液與混合標準溶液所得到回歸曲線的斜率與截距幾乎一致，故最終選取相關(guān)系數(shù)最高的一條回歸曲線作為定量標準曲線，見表1。

表1 PAEs總量的回歸曲線，線性范圍，R2，檢出限及定量限

由表1可以看出，檢出限和定量限分別為0.05、0.15 nmol/mL，說明本研究提出的檢測方法具有良好的靈敏度而不需額外凈化步驟。若待測樣品中PAEs實際含量高于給出的線性范圍，可以先將待測樣品質(zhì)量濃度稀釋至線性范圍內(nèi)再檢測。

本方法的回收率通過4種標準溶液在3個不同水平下的加標實驗進行評估，結(jié)果見表2。

表2 PAEs總量的回收率和相對標準偏差(n=3)

從表2可以看出，回收率為84.52%～100.13%，且相對標準偏差(RSD)小于等于5.46%，最低RSD僅為0.35%，說明本方法具有良好的精密度。

2.3 樣品檢測

為驗證本方法的實際應用性，對市售的5種食用油(生產(chǎn)日期為近期)中的PAEs總量進行了定量檢測。對5種不同種類食用油樣品按照1.2.2及1.2.3中所述方法進行堿性水解和Fenton氧化衍生化并定量檢測，結(jié)果見表3。

表3 實際食用油樣品中的PAEs總量檢測結(jié)果

從表3可以看出，選取的5種食用油樣品中的PAEs總量為9.25～20.35 nmol/mL，均未超過國家標準GB 9685—2008中對于PAEs在食品體系中的最大遷移量。食用油樣品的組成復雜，但使用本研究所述的檢測方法得到的基質(zhì)干擾性較小，實現(xiàn)了實際樣品中的定量檢測，說明本方法適用于食用油中PAEs含量的檢測，且方法的靈敏度和準確度可靠。

3 結(jié) 論

本方法通過結(jié)合一種快速并易操作的衍生化方法及高通量的熒光光譜實現(xiàn)對于食用油樣品中復雜基質(zhì)內(nèi)的痕量PAEs總量閾值初篩。在本研究中，通過使用Fenton氧化反應結(jié)合熒光光譜建立了一種對食用油中PAEs總量定量檢測的便捷方法。Fenton氧化反應在增強熒光性方面展現(xiàn)出了優(yōu)秀的性能，同時熒光光譜也表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏度。結(jié)果表明，F(xiàn)enton-熒光法是一種有效地快速定量檢測食用油中PAEs含量的方法，便于對PAEs物質(zhì)的分級篩選以發(fā)現(xiàn)可疑樣品，最終實現(xiàn)對PAEs暴露量進行健康風險評估。

[1] NANNI N，F(xiàn)ISELIER K，GROB K，et al. Contamination of vegetable oils marketed in Italy by phthalic acid esters [J]. Food Control，2011，22(2)：209-214.

[2] WU P，YANG D，ZHANG L，et al. Simultaneous determination of 17 phthalate esters in edible vegetable oils by GC-MS with silica/PSA-mixed solid-phase extraction [J]. J Sep Sci，2012，35(21)：2932-2939.

[3] 馬燕玲，陳令新，丁養(yǎng)軍，等. 超聲輔助分散液液微萃取-高效液相色譜測定水樣中的4種鄰苯二甲酸酯類增塑劑[J]. 色譜，2013，31(2)：155-161.

[4] 徐敦明，鄭向華，楊黎忠，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飲料中鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯和鄰苯二甲酸二異壬酯[J]. 分析化學，2012，40(2)：304-308.

[5] 李擁軍，熊文明，陳堅文，等. 固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羅非魚中9種鄰苯二甲酸酯[J]. 分析測試學報，2012，31(3)：278-283.

[6] 李康雄，鐘海雁，羅凡，等. 油茶籽油中鄰苯二甲酸酯的氣相色譜分析方法建立及應用[J]. 中國油脂，2016，41(1)：56-59.

[7] 吳雪，董海峰，湯樺，等. 凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜法測定食用油中8種鄰苯二甲酸酯類增塑劑[J]. 中國油脂，2016，41(5)：53-55.

[8] 曹九超，俞曄，朱云，等. 食用油中5種鄰苯二甲酸酯的液液萃取-固相萃取耦合富集和氣質(zhì)聯(lián)用的測定[J]. 中國油脂，2014，39(1)：43-46.

[9] 鄒柯婷，秦國富，李永波. 市售菜籽油中16種鄰苯二甲酸酯類塑化劑的含量監(jiān)測分析[J]. 中國油脂，2016，41(8)：62-65.

[11] SUN H，YANG Y，LI H，et al. Development of multiresidue analysis for twenty phthalate esters in edible vegetable oils by microwave-assisted extraction-gel permeation chromatography-solid phase extraction-gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Agric Food Chem，2012，60(22)：5532-5539.

[12] FENTON H. LXXIII.—Oxidation of tartaric acid in presence of iron[J]. J Chem Soc Trans，1894，65：899-910.

[13] 李滿秀，王華燕. 熒光法測定環(huán)境樣品中的鄰苯二甲酸酯[J]. 分析化學，2005，33(9)：1315-1317.

[14] ALBRO P W，JORDAN S，CORBETT J T，et al. Determination of total phthalate in urine by gas chromatography[J]. Anal Chem，1984，56(2)：247-250.

[16] PIGNATELLO J J，OLIVEROS E，MACKAY A. Advanced oxidation processes for organic contaminant destruction based on the Fenton reaction and related chemistry[J]. Crit Rev Env Sci Tec，2006，36(1)：1-84.

[17] GALLARD H，DE LAAT J. Kinetics of oxidation of chlorobenzenes and phenyl-ureas by Fe (II)/H2O2and Fe (III)/H2O2. Evidence of reduction and oxidation reactions of intermediates by Fe (II) or Fe (III)[J]. Chemosphere，2001，42(4)：405-413.

ArapidapproachofFentoncoupledwithfluorescencespectrometryforthequantitativedeterminationoftotalphthalateestersinedibleoils

ZHANG Qinfeng1, HAN Lijuan1, LIU Sheng1, DU Xuanli2, TANG Jiarui2, WANG Yueyue1, HU Zhixiong1,3, ZHANG Weinong1,3, QI Yutang1

(1.College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2.Xi’an COFCO Research amp; Design Institute Co., Ltd., Xi’an 710082, China; 3.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China)

A rapid approach of Fenton oxidation coupled with fluorescence spectrometry for the quantitative determination of total phthalate esters (PAEs) in edible oils was established. PAEs in edible oils were extracted by acetonitrile and hydrolyzed in aqueous alkaline solutions. Hydroxyphthalic acids with significant fluorescence properties were produced by the Fenton reaction and analyzed by fluorescence spectrometry. The experimental parameters relating to the efficiency of the derivative reaction such as hydrolysis conditions and Fenton reaction were optimized. The results showed that under the optimal conditions, the method had the items of high sensitivity, good linearity (R2= 0.999 2), and repeatability (RSDwas in the range of 0.35%-5.46%). The limits of detection and quantity were 0.05 nmol/mL and 0.15 nmol/mL respectively, and the recoveries were in the range of 84.52%-100.13%. The approach was suitable for the high throughput determination in preliminary security screening of total PAEs in batch edible oil samples.

phthalate esters; edible oil; Fenton oxidation; fluorescence spectrometry

TS225;TS207.5

A

1003-7969(2017)11-0137-05

2017-02-26；

2017-08-18

湖北省自然科學基金項目(2014CFB885)；國家自然科學基金項目(31371783)；國家糧食局公益性行業(yè)科研專項(201513003)；國家自然科學基金青年基金項目(31601505)

張秦鋒(1992)，男，在讀碩士，研究方向為油脂質(zhì)量檢測與安全控制(E-mail)qinfeng.zhang@outlook.com；韓立娟(1986)，女，講師，研究方向為油料副產(chǎn)物綜合利用(E-mail)hanlj.whpu@hotmail.com。張秦鋒、韓立娟同為第一作者。

胡志雄，副教授(E-mail)e_huzhixiong@126.com；張維農(nóng)，教授(E-mail)zhangweinong@163.com。