周 林 李 穎 呂振明 史會(huì)來 吳常文 遲長鳳①

(1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 舟山 316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316021)

曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)精子表面蛋白17(Sp17)基因克隆以及組織表達(dá)特異性分析*

周 林1李 穎1呂振明1史會(huì)來2吳常文1遲長鳳1①

(1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 舟山 316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316021)

精子表面蛋白17(Sp17)是參與受精過程的關(guān)鍵分子。本研究采用RT-PCR以及RACE技術(shù)克隆得到了曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)Sp17簡稱Sj-Sp17 cDNA的全長序列,序列全長1463bp,5′和3′非編碼區(qū)分別為92bp和222bp,預(yù)測的開放閱讀框(ORF)全長1149bp。編碼的蛋白理論分子量為42.0548kDa,等電點(diǎn)4.66,是一種親水性蛋白,不存在跨膜區(qū)以及信號(hào)肽序列,含有豐富的螺旋結(jié)構(gòu)(54%)。同源氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),與其他軟體動(dòng)物的相似性最高僅為44%,表明 Sp17在進(jìn)化中并不保守?；?Sp17氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,曼氏無針烏賊和加州雙斑蛸(Octopus bimaculoides)進(jìn)化關(guān)系最近。組織特異性分析發(fā)現(xiàn)Sp17在曼氏無針烏賊的生殖系統(tǒng)中均有較高的表達(dá)量,其中在精巢和儲(chǔ)精囊中有顯著表達(dá)。Sp17基因的成功克隆以及組織表達(dá)特異性分析對于深入研究其細(xì)胞定位以及生物學(xué)功能具有重要意義。

曼氏無針烏賊;Sp17;cDNA;生物信息學(xué);real-time PCR

精子表面蛋白 17(Sp17)是一種最初定位于哺乳動(dòng)物雄性個(gè)體生殖細(xì)胞表面的特異性自身抗原性物質(zhì),目前已經(jīng)在兔(Richardsonet al,1994)、鼠(Konget al,1995)、人(Leaet al,1997)等物種中有過研究,并發(fā)現(xiàn)在同一個(gè)物種中編碼成熟 Sp17的不同長度的mRNA都有相同的編碼區(qū)序列,在功能上已被證實(shí)具有結(jié)合卵膜透明帶,參與頂體反應(yīng),以及與葡聚糖、硫酸葡聚糖等大分子結(jié)合的作用(Richardsonet al,1994),是在受精過程中起關(guān)鍵作用的蛋白。除此之外在軟體動(dòng)物部分種類基因組序列中也發(fā)現(xiàn)了具有類似 Sp17結(jié)構(gòu)的基因。根據(jù)其自身抗原特性,越來越多的研究表明 Sp17除了雄性生殖系統(tǒng),在呼吸系統(tǒng)的纖毛細(xì)胞以及某些癌細(xì)胞組織中也有不同水平的表達(dá)(Grizziet al,2004),因此被作為一種候選的檢測抗原而被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究(De Jonget al,2002)。

曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、烏賊科(Sepiidae)、無針烏賊屬(Sepiella)。作為一種具有較高藥用、食用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)頭足類,自20世紀(jì)80年代以來自然種群數(shù)量急劇下降(吳常文等,2010),眾多學(xué)者對于其資源保護(hù)以及生殖發(fā)育進(jìn)行了研究(李星頡等,1986;張建設(shè)等,2011)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們首次克隆了編碼曼氏無針烏賊 Sp17(定義為Sj-Sp17)的 cDNA全長序列,結(jié)合生物信息學(xué)分析探討了Sj-Sp17基因以及蛋白結(jié)構(gòu)與其可能存在的生物學(xué)功能的關(guān)系,并通過 real-time PCR技術(shù)分析了編碼該蛋白的 mRNA在不同組織中的表達(dá)特異性,為進(jìn)一步研究Sj-Sp17的細(xì)胞定位以及蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 性成熟的曼氏無針烏賊雄性個(gè)體取自浙江溫州蒼南頭足類種苗繁育基地,活體解剖取精巢、儲(chǔ)精囊、輸精管、前列腺、精莢、胃、腸、肝、鰓、視葉、腦、心臟、胰、肌肉共14種組織樣品保存于 RNAstore中,以干冰裝運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,放置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 RNAstore購自 CWBIO公司;RNAiso Plus、PCR Master Mix、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、SYBR Premix Ex TaqTMII Kit、SMARTTMRACE kit 均購自TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取以及cDNA第一鏈的合成 取保存于 RNAstore中的新鮮精巢組織 50—100mg,根據(jù)RNAiso Plus試劑說明書提取總RNA。cDNA的合成按照M-MLV (RNase H-)反轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦的方法進(jìn)行。

1.2.2 曼氏無針烏賊 Sp17基因核心片段的克隆根據(jù)已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選并設(shè)計(jì)用于克隆Sj-Sp17基因核心片段的引物,序列如下:

表1 克隆Sp17基因所用引物Tab.1 Primers used in Sp17 gene clone

PCR 25μL體系根據(jù)PCR Master Mix試劑說明書進(jìn)行加樣,反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min,12℃5min結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,含有目的片段的 PCR產(chǎn)物送至上海華大生物公司進(jìn)行測序。

1.2.3 Sp17基因全長cDNA的克隆 根據(jù)上一步所得到的 Sj-Sp17基因核心序列,參考 SMARTTMRACE試劑盒的要求設(shè)計(jì)5’和3’RACE引物,見表2。

5’RACE 采用引物 SP17-5’Outer和試劑盒接頭引物5’adapter以加尾的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,然后以 SP17-5’Inner引物和5’adapter進(jìn)行巢式PCR 第二輪擴(kuò)增。3’RACE 采用引物 SP17-3’Outer和接頭引物3’adapter進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,接著以引物SP17-3’Inner和3’adapter進(jìn)行巢式PCR二輪擴(kuò)增。PCR條件參考試劑盒說明書。PCR產(chǎn)物電泳檢測并純化回收,連接到 PMD18-T載體,后轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng),挑取陽性克隆送至上海華大生物公司測序。

表2 Sp17基因RACE使用引物Tab.2 Primers used in RACE of Sp17 gene

1.2.4 曼氏無針烏賊 Sp17基因全長及序列分析將測序得到的片段通過DNAMAN軟件進(jìn)行拼接,并用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線工具預(yù)測基因的開放閱讀框(ORF)位置;然后利用Expasy-ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)(Gasteigeret al,2003)將其翻譯為氨基酸序列并預(yù)測蛋白的相對分子量和等電點(diǎn);應(yīng)用在線工具 SignaIP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)(Bendtsenet al,2004)以及 TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對其進(jìn)行信號(hào)肽以及跨膜區(qū)的預(yù)測;NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)軟件分析其磷酸化位點(diǎn);保守結(jié)構(gòu)域分析采用 NCBI在線搜索工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi);Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)(Thompsonet al,1997)對Sj-Sp17及其同源氨基酸序列進(jìn)行比對,基于Sp17氨基酸序列分析不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系并利用貝葉斯法構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

1.2.5 曼氏無針烏賊精子表面蛋白Sp17的組織表達(dá)特異性分析 根據(jù)已知的 Sj-Sp17基因全長,在ORF區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)用于real-time PCR的引物,選擇曼氏無針烏賊β-actin基因(S.japonicaJN564496.1)作為內(nèi)參基因,合成的引物經(jīng)普通PCR驗(yàn)證,序列見表3。

表3 Sj-Sp17熒光定量引物Tab.3 Primers of Sj-Sp17 used in real-time PCR

各組織的RNA提取以及合成cDNA第一鏈的方法,如實(shí)驗(yàn)方法中 1.2.1節(jié)所述。反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA利用核酸蛋白檢測儀測定濃度,并取足量稀釋到100ng/μL備用,real-time PCR加樣體系及反應(yīng)條件按照SYBR Premix Ex TaqTMII Kit產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 曼氏無針烏賊Sp17基因全長的獲得

以曼氏無針烏賊精巢cDNA為模板,以SP17-1F/1R、SP17-2F/2R和SP17-3F/3R為引物擴(kuò)增分別得到338bp、256bp和336bp的核心片段,拼接后根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)RACE引物,采用5′RACE和3′RACE方法分別獲得了210bp和563bp的兩個(gè)目的片段(圖1)。

2.2 曼氏無針烏賊Sp17基因cDNA全長的序列特征

利用 DNAMAN軟件將擴(kuò)增得到的長度分別為338bp、256bp和336bp的核心片段以及 3’RACE和5’RACE長度分別為210bp和563bp的片段拼接得到Sj-Sp17基因全長cDNA 1463bp,預(yù)測ORF為1149bp,5’UTR區(qū) 92bp,3’UTR區(qū) 222bp,共編碼 382個(gè)氨基酸(圖2)。

圖1 曼氏無針烏賊Sp17基因cDNA的擴(kuò)增Fig.1 The amplification of Sp17 gene cDNA in S.japonica

2.3 曼氏無針烏賊Sp17氨基酸序列比對以及同源性分析

選用來自 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫的Sp17同源性序列與Sj-Sp17進(jìn)行氨基酸比對,發(fā)現(xiàn)組成該蛋白的氨基酸序列中前 100個(gè)氨基酸比較保守。圖3中列出部分氨基酸序列的比對結(jié)果,Sj-Sp17氨基酸序列和太平洋牡蠣(Crassostrea gigasXP_011412976.1)、海蝸牛(Aplysia californicaXP_012936202.1)、加州雙斑蛸(Octopus bimaculoidesXP_014778086.1)、光滑雙臍螺(Biomphalaria glabrataXP_013090015.1)、紫海膽(Strongylocentrotus purpuratusXP_011680588.1)以及囊舌蟲(Saccoglossus kowalevskiiXP_006818979.1)的相似性分別為36%、36%、36%、31%、44%和38%。保守結(jié)構(gòu)域的分析發(fā)現(xiàn)在不同物種的Sp17氨基酸序列中同一位置(12—50aa)均存在DD CABYR SP17結(jié)構(gòu)域,此外還存在至少一個(gè)IQ結(jié)構(gòu)域(圖4)。采用mrBayes軟件(Ronquistet al,2003)對曼氏無針烏賊和來自于NCBI數(shù)據(jù)庫的65條氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。其中曼氏無針烏賊和加州雙斑蛸位于同一進(jìn)化支,證明其親緣關(guān)系最近,頭足類和其他軟體動(dòng)物例如太平洋牡蠣、海蝸牛、紫海膽等位于同一較大進(jìn)化支。

2.4 曼氏無針烏賊Sp17基因的生物信息學(xué)分析

分析表明,Sj-Sp17基因編碼的蛋白質(zhì)包括320個(gè)親水性氨基酸和54個(gè)疏水性氨基酸,為親水性蛋白。理論分子量(MW)為42.0548kDa,等電點(diǎn)(pI)4.66。信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白無跨膜區(qū)(圖6)以及信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(圖7)。磷酸化位點(diǎn)分析表明,該蛋白存在45個(gè)可能發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)。采用Antheprot5.0軟件(Geourjonet al,1991)對SP17蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),該蛋白含有54%的螺旋(Helix),3%的折疊(Sheet),6%的轉(zhuǎn)角(Turn)以及38%的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Coil)(圖8)。

2.5 曼氏無針烏賊Sp17組織表達(dá)特異性分析

通過real-time PCR的方法對Sj-Sp17基因在精巢、腦、儲(chǔ)精囊等共14種組織中的表達(dá)特異性進(jìn)行分析,以曼氏無針烏賊 β-actin基因(S.japonicaJN564496.1)作為內(nèi)參基因,選取肌肉中的表達(dá)量作為參照,采用 2–ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)量,并用SPSS18軟件進(jìn)行顯著性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Sj-Sp17基因在性成熟時(shí)期的精巢、儲(chǔ)精囊中均有顯著表達(dá)(P＜0.05),其次在腦、精莢以及輸精管中也有一定量的表達(dá),而在其他組織中表達(dá)量極低(圖9)。

圖2 Sj-Sp17基因cDNA全長Fig.2 The full length of Sj-Sp17 cDNA

圖3 Sp17氨基酸同源比對Fig.3 Multiple alignments of deduced amino acid sequences of Sp17

圖4 Sp17結(jié)構(gòu)域比對Fig.4 Comparison in protein domains of Sp17

圖5 基于Sp17氨基酸序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Bayesian phylogenetic tree depicting the relationship of Sp17 amino acids sequence with other species

3 討論

精子表面蛋白Sp17是一種高度保守的哺乳動(dòng)物蛋白,可能作為結(jié)合透明帶表面糖基的分子而參與到頂體反應(yīng)中,并促進(jìn)受精作用(Konget al,1995;Adoyoet al,1997)。克隆得到的1463bp的Sj-Sp17cDNA序列,對其開放閱讀框編碼的氨基酸分析發(fā)現(xiàn)沒有跨膜結(jié)構(gòu),不存在信號(hào)肽,因此 Sp17不屬于細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白。磷酸化位點(diǎn)分析表明,其氨基酸序列中存在多個(gè)潛在的發(fā)生磷酸化的位點(diǎn),蛋白質(zhì)的磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用(De Castroet al,2006),因此我們推測這些磷酸化位點(diǎn)可能是其潛在的完成生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。保守結(jié)構(gòu)域分析表明 Sj-Sp17及其同源蛋白結(jié)構(gòu)中均含有一個(gè)DD CABYR SP17結(jié)構(gòu)域以及多個(gè)IQ結(jié)構(gòu)域(Cheneyet al,1992)。DD CABYR SP17結(jié)構(gòu)域是一個(gè)同時(shí)存在于 CABYR以及 Sp17 N端的結(jié)構(gòu),它和依賴于cAMP的蛋白激酶A的R亞基(PKA RII)氨基酸序列高度相似(Frayneet al,2002),這一部分結(jié)構(gòu)是形成蛋白二聚化以及與蛋白激酶 A錨定蛋白(AKAPs)相互作用所必需的(Tayloret al,1990),并且已有實(shí)驗(yàn)證明Sp17能夠親和AKAP3 (Leaet al,2004);IQ結(jié)構(gòu)域含有保守的異亮氨酸以及谷氨酰胺殘基,屬于鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族,鈣調(diào)素結(jié)合蛋白在精子細(xì)胞中有大量的表達(dá)(Joneset al,1978),同時(shí)也被證實(shí)在例如精子發(fā)生(Moriyaet al,1993)、精子運(yùn)動(dòng)(Tash,1989)、精子獲能(Adeoya-Osiguwaet al,1996)、頂體反應(yīng)(Zaneveldet al,1991)和精卵融合(Courtotet al,1994)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,因此我們推測 Sp17作用機(jī)理與其他同家族蛋白類似(Wascoet al,1989;Manjunathet al,1993;Trejoet al,1997),即在鈣離子或者EDTA存在下結(jié)合鈣調(diào)蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用。Sp17中IQ結(jié)構(gòu)域還可能與蛋白質(zhì)磷酸化以及參與鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以調(diào)節(jié) Sp17蛋白與透明帶表面糖基的結(jié)合有關(guān)(Deloulmeet al,1997)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示Sj-Sp17氨基酸中 IQ結(jié)構(gòu)域部分含有豐富的 α-螺旋結(jié)構(gòu),鈣調(diào)蛋白在穩(wěn)定這一結(jié)構(gòu)的過程中可能起著很重要的作用(Xieet al,1994;Gerendasyet al,1995),而且螺旋結(jié)構(gòu)越豐富,此區(qū)域與鈣調(diào)蛋白的親和力也越大(閻虎生等,1991)。PEST (PEST-FIND Score=11.38)序列是一段含有豐富的脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸組成的短序列,與泛素化降解有關(guān)(Rechsteineret al,1996),Sj-Sp17氨基酸序列中317—337aa存在潛在的PEST序列,在Sp17以及其他含有鈣調(diào)蛋白結(jié)合域(IQ)的蛋白質(zhì)中均存在這樣的結(jié)構(gòu)(Barneset al,1995),實(shí)驗(yàn)證實(shí)頂體反應(yīng)開始后Sp17蛋白表達(dá)量迅速增多(Richardsonet al,1994),隨著反應(yīng)進(jìn)行,分子量較大的三聯(lián)體蛋白逐漸減少,小分子量蛋白增加,因此,該 PEST序列可能與頂體反應(yīng)中高分子量的Sp17蛋白剪切掉C端的部分序列以及鈣調(diào)素結(jié)合位點(diǎn)而最終呈現(xiàn)出小分子量的蛋白增加有關(guān)。

圖6 Sj-Sp17跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig.6 The transmembrane region prediction of Sj-Sp17

圖7 Sj-Sp17信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果Fig.7 The signal peptide prediction of Sj-Sp17

圖8 Sj-Sp17蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 The secondary structure prediction of Sj-Sp17

通過 Sp17基因的組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn),它在雄性生殖系統(tǒng)各組織中的表達(dá)量較其它組織更高,尤其是在精巢中的表達(dá)量最高,推測它可能與精子形成過程有關(guān)。通過對Sj-Sp17氨基酸序列及同源氨基酸序列的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),它與加州雙斑蛸進(jìn)化關(guān)系最近,其次是太平洋牡蠣、海蝸牛、紫海膽以及扁形動(dòng)物門的生物,與人以及狒狒的關(guān)系最遠(yuǎn)。通過對進(jìn)化關(guān)系較近的物種 Sp17氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),同源性最高僅為44%,說明Sp17在進(jìn)化中并不保守。

圖9 Sj-Sp17基因在不同組織的表達(dá)特異性Fig.9 Distribution of Sj-Sp17 mRNA in various tissues

4 結(jié)論

本文通過 RT-PCR以及 RACE技術(shù)克隆得到了1463bp的 Sj-Sp17cDNA全長序列,并對其編碼的長度為382個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白不含信號(hào)肽以及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu),氨基酸同源性最高僅為44%,說明 Sp17在進(jìn)化中并不是很保守。進(jìn)化分析表明Sj-Sp17與加州雙斑蛸進(jìn)化關(guān)系最近。通過對預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)的分析結(jié)合前人的研究成果,我們推測Sj-Sp17可能也參與頂體反應(yīng)并促進(jìn)頂體反應(yīng)的順利進(jìn)行,而組織特異性分析也顯示Sj-Sp17在精巢以及儲(chǔ)精囊中有顯著表達(dá),因此Sj-Sp17還可能與精子的形成以及成熟有關(guān)。Sj-Sp17作為一種重要的與生殖相關(guān)的蛋白,其成功的克隆以及組織表達(dá)特異性分析對于深入研究其生理功能以及作用機(jī)理具有重要意義,并為曼氏無針烏賊的種質(zhì)保護(hù)以及育種繁殖研究提供一定的理論依據(jù)。

吳常文,董智勇,遲長鳳等,2010.曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni)繁殖習(xí)性及其產(chǎn)卵場修復(fù)的研究.海洋與湖沼,41(1):39—46

張建設(shè),夏靈敏,遲長鳳等,2011.人工養(yǎng)殖曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni)繁殖生物學(xué)特性研究.海洋與湖沼,42(1):55—59

李星頡,戴健壽,唐志躍,1986.曼氏無針烏賊懷卵量及生殖力.浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),(2):1—8

閻虎生,何炳林,1991.多肽的α螺旋結(jié)構(gòu)對多肽與鈣調(diào)蛋白親合力的影響.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),7(2):147—152

Adeoya-Osiguwa S A,Fraser L R,1996.Evidence for Ca2+-dependent ATPase activity,stimulated by decapacitation factor and calmodulin,in mouse sperm.Molecular Reproduction &Development,44(1):111—120

Adoyo P A,Lea I A,Richardson R Tet al,1997.Sequence and characterization of the sperm protein Sp17 from the baboon.Molecular Reproduction and Development,47(1):66—71

Barnes J A,Gomes A V,1995.Pest sequences in calmodulin-binding proteins.Molecular and Cellular Biochemistry,149—150(1):17—27

Bendtsen J D,Nielsen H,Von Heijne Get al,2004.Improved prediction of signal peptides:SignalP 3.0.Journal of Molecular Biology,340(4):783—795

Cheney R E,Mooseker M S,1992.Unconventional myosins.Current Opinion in Cell Biology,4(1):27—35

Courtot A M J,Feinberg J M,Schoevaert D Aet al,1994.Calmodulin during human sperm incorporation into hamster oocyte:an immunogold electron microscope study.Molecular Reproduction and Development,38(2):170—177

De Castro E,Sigrist C J A,Gattiker Aet al,2006.Scanprosite:detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins.Nucleic Acids Research,34(S2):W362—W365

De Jong A,Buchli R,Robbins D,2002.Characterization of sperm protein 17 in human somatic and neoplastic tissue.Cancer Letters,186(2):201—209

Deloulme J C,Prichard L,Delattre Oet al,1997.The prooncoprotein EWS binds calmodulin and is phosphorylated by protein kinase C through an IQ domain.Journal of Biological Chemistry,272(43):27369—27377

Frayne J,Hall L,2002.A re-evaluation of sperm protein 17(Sp17)indicates a regulatory role in an A-kinase anchoring protein complex,rather than a unique role in sperm-zona pellucida binding.Reproduction,124(6):767—774

Gasteiger E,Gattiker A,Hoogland Cet al,2003.Expasy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.Nucleic Acids Research,31(13):3784—3788

Geourjon C,Deléage G,Roux B,1991.Antheprot:an interactive graphics software for analyzing protein structures from sequences.Journal of Molecular Graphics,9(3):188—190

Gerendasy D D,Herron S R,Jennings P Aet al,1995.Calmodulin stabilizes an amphiphilic α-helix within Rc3/Neurogranin and Gap-43/Neuromodulin only when Ca2+is absent.Journal of Biological Chemistry,270(12):6741—6750

Grizzi F,Chiriva-internati M,Franceschini Bet al,2004.Sperm protein 17 is expressed in human somatic ciliated epithelia.Journal of Histochemistry and Cytochemistry,52(4):549—554

Jones H P,Bradford M M,McRorie R Aet al,1978.High levels of a calcium-dependent modulator protein in spermatozoa and its similarity to brain modulator protein.Biochemical and Biophysical Research Communications,82(4):1264—1272

Kong M,Richardson R T,Widgren E Eet al,1995.Sequence and localization of the mouse sperm autoantigenic protein,Sp17.Biology of Reproduction,53(3):579—590

Lea I A,Adoyo P,O'Rand M G,1997.Autoimmunogenicity of the human sperm protein Sp17 in vasectomized men and identification of linear B cell epitopes.Fertility and Sterility,67(2):355—361

Lea I A,Widgren E E,O'Rand M G,2004.Association of sperm protein 17 with a-kinase anchoring protein 3 in flagella.Reproductive Biology and Endocrinology,2:57

Manjunath P,Chandonnet L,Baillargeon Let al,1993.Calmodulin-binding proteins in bovine semen.Journal of the Society for Reproduction and Fertility,97(1):75—81

Moriya M,Katagiri C,Yagi K,1993.Immuno-electron microscopic localization of calmodulin and calmodulin-binding proteins in the mouse germ cells during spermatogenesis and maturation.Cell and Tissue Research,271(3):441—451

Rechsteiner M,Rogers S W,1996.PEST sequences and regulation by proteolysis.Trends in Biochemical Sciences,21(7):267—271

Richardson R T,Yamasaki N,O’Rand M G,1994.Sequence of a rabbit sperm zona pellucida binding protein and localization during the acrosome reaction.Developmental Biology,165(2):688—701

Ronquist F,Huelsenbeck J P,2003.Mrbayes 3:Bayesian phylogenetic inference under mixed models.Bioinformatics,19(12):1572—1574

Tash J S,1989.Protein phosphorylation:the second messenger signal transducer of flagellar motility.Cell Motility and the Cytoskeleton,14(3):332—339

Taylor S S,Buechler J A,Yonemoto W,1990.Camp-dependent protein kinase:framework for a diverse family of regulatory enzymes.Annual Review of Biochemistry,59(1):971—1005

Thompson J D,Gibson T J,Plewniak Fet al,1997.The Clustal_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Research,25(24):4876—4882

Trejo R,Delhumeau G,1997.Calmodulin content,Ca2+-dependent calmodulin binding proteins,and testis growth:identification of Ca2+-dependent calmodulin binding proteins in primary spermatocytes.Molecular Reproduction&Development,48(1):127—136

Wasco W M,Kincaid R L,Orr G A,1989.Identification and characterization of calmodulin-binding proteins in mammalian sperm flagella.Journal of Biological Chemistry,264(9):5104—5111

Xie X,Harrison D H,Schlichting Iet al,1994.Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8 ? resolution.Nature,368(6469):306—312

Zaneveld L J,De Jonge C J,Anderson R Aet al,1991.Human sperm capacitation and the acrosome reaction.Human Reproduction,6(9):1265—1274

MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF SPERM SURFACE PROTEIN 17 (SP17)GENE INSEPIELLA JAPONICA

ZHOU Lin1, LI Ying1, Lü Zhen-Ming1, SHI Hui-Lai2, WU Chang-Wen1, CHI Chang-Feng1
(1.National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture,National and Provincial Joint Laboratory of Exploration and Utilization of Marine Aquatic Genetic Resources,School of Marine Science and Technology,Zhejiang Ocean University,Zhoushan316022,China;2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang,Zhoushan316021,China)

Sperm surface protein 17 (Sp17)is a key molecular in fertilization process.A 1463bp full-length cDNA of Sp17 gene fromSepiella japonicadescribed as Sj-Sp17 was obtained with RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends(RACE)techniques.Sp17 consists of a 92bp 5′ untranslated region (UTR)and a 222bp 3′ UTR.The predicted open reading frame (ORF)is 1149bp,the molecular weight of deduced protein is 42.0548kDa,and itspIis 4.66.Sj-Sp17 is hydrophilic,has no signal peptide sequence and transmembrane regions,but contains rich spiral structures (54%).The deduced amino acid sequence that is aligned with other species Sp17 shows low similarity (＜44%),indicating that the structure of Sj-Sp17 is not conserved.Phylogenetic analysis based on Sp17 demonstrates thatS.japonicais closely related withOctopus bimaculoides.Sj-Sp17 gene was mainly expressed in reproductive system by real-time PCR analysis,and had significant expression especially in testis and seminal vesicle.We believe that cloning and analysis on tissue-specific expression of Sj-Sp17 gene would be of great significance for understanding its cellular localization and biological function.

Sepiella japonica;Sp17;cDNA;bioinformatics;real-time PCR

Q789;Q955

10.11693/hyhz20170300060

* 科技部港澳臺(tái)科技合作專項(xiàng),2014DFT30120號(hào);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目,LY15C190010號(hào);舟山市科技專項(xiàng),2016C41016號(hào);浙江省科研院所專項(xiàng),2015F50055號(hào);浙江海洋大學(xué)“海洋科學(xué)”省重中之重學(xué)科開放課題,20160116號(hào)。周 林,碩士研究生,E-mail:1527074150@qq.com

① 通訊作者:遲長鳳,博士,教授,E-mail:chicf@zjou.edu.cn

2017-03-17,收修改稿日期:2017-04-15