馬致潔，董捷鳴，王伽伯，龐晶瑤，3*，浦仕彪

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京潞河醫(yī)院藥劑科，北京 101149；4.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650200)

基于高內(nèi)涵分析的甘草炮制雷公藤減毒作用研究△

馬致潔1，董捷鳴1，王伽伯2，龐晶瑤1，3*，浦仕彪4*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京潞河醫(yī)院藥劑科，北京 101149；4.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650200)

目的在體外L02肝細(xì)胞模型上觀察甘草炮制雷公藤的減毒效果，為研究雷公藤低毒飲片提供依據(jù)。方法采用高內(nèi)涵分析技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞存活情況，比較甘草炮制雷公藤和配伍雷公藤的減毒差異。結(jié)果雷公藤對(duì)肝細(xì)胞的損傷呈劑量依賴性，在IC50的劑量下，甘草炮制雷公藤和甘草配伍雷公藤都有顯著的減毒效果。結(jié)論采用高內(nèi)涵分析方法更加直觀、具體地反映了甘草炮制雷公藤的減毒效果，為臨床安全用藥提供參考。

雷公藤；甘草；炮制減毒；高內(nèi)涵分析

雷公藤始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、解毒殺蟲等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明雷公藤具有抗炎、殺菌、解熱鎮(zhèn)痛及多種免疫調(diào)節(jié)功能。因雷公藤毒性較大，傳統(tǒng)方法外用較多，直至1974年首次將其內(nèi)服用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并取得良好的療效。國(guó)內(nèi)外大量基礎(chǔ)研究和臨床大規(guī)模、隨機(jī)、雙盲的前瞻性試驗(yàn)均證實(shí)，雷公藤是迄今為止治療某些自身免疫性疾病療效最為確切的一味中藥[1-3]，幾乎沒(méi)有其他中藥可以替代。但常見(jiàn)的肝腎毒性嚴(yán)重制約著其臨床應(yīng)用，因此開(kāi)展雷公藤減毒新方法的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

中醫(yī)理論認(rèn)為炮制是緩解藥物毒性的有效措施之一，但雷公藤炮制方法鮮有古籍文獻(xiàn)記載，且目前常用的炮制方法減毒效果不佳。近年來(lái)對(duì)其研究主要集中在配伍減毒增效方面[4-6]，配伍甘草減毒的應(yīng)用已具有較好的實(shí)驗(yàn)和臨床基礎(chǔ)[7-9]，并且有學(xué)者對(duì)其主要成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以期達(dá)到存效減毒的目的。

如法炮制是降低中藥毒性的重要方法，加輔料是毒性中藥炮制的常用方法，液體輔料常用到的有酒、醋、蜂蜜、姜汁以及甘草汁等，其中甘草性平、味甘，具有補(bǔ)脾益氣，可調(diào)節(jié)藥性，緩急解毒，歷代醫(yī)書對(duì)甘草解毒也廣為記載和流傳。但甘草作為保肝、護(hù)肝的常用解毒中藥，卻很少見(jiàn)其應(yīng)用于具有肝毒性中藥的炮制。因此本課題組在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，擬從中藥炮制減毒的角度入手，采用甘草汁炮制雷公藤，在L02肝細(xì)胞模型上，借助高內(nèi)涵分析方法，評(píng)價(jià)甘草汁炮制雷公藤的減毒效果，為開(kāi)展雷公藤炮制減毒的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)，同時(shí)也為雷公藤的臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 材料和儀器

1.1 試劑和藥物

RPMI1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液、二甲基亞砜(DMSO)，(Gibco公司)，96孔板(Costar 3599，康寧公司)，錫箔紙，除菌濾器(25 mm，0.22 μm)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(430720，康寧公司)，Hochest 33342(H3570，生命科學(xué))，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(S11368，生命科學(xué))。

對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100018-201409)；甘草由北京友誼醫(yī)院中藥房提供(批號(hào)：SAA11；產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)；雷公藤藥材，采自福建三明，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科趙奎君主任藥師鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.F.的干燥根。

1.2 儀器

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)(ImageXpress Micro XL，Molecular Devices公司)，常規(guī)倒置顯微鏡(上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司)，恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(NAPCO公司)，TC10TM自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Bio-Rad公司)，臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，AL204微量分析天平(Mettler Toledo公司)，KQ5200E超聲提取清洗器、LGJ-18型冷凍干燥機(jī)(北京西四環(huán)科學(xué)儀器廠)，SN510C高壓蒸氣滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 雷公藤藥材提取方法 稱取600 g雷公藤生藥材，打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀。8倍體積(4800 mL)60%的乙醇水浸泡12 h后，超聲提取3次，每次45 min，過(guò)濾，合并3次濾液。濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后冷凍干燥成粉末，備用。

2.1.2 甘草配伍雷公藤制備方法 稱取已粉碎的雷公藤藥材粗顆粒600 g，生甘草片200 g，置于同一容器。6400 mL溶劑中浸泡12 h后，超聲提取3次，每次45 min，過(guò)濾，合并3次濾液。濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積后，冷凍干燥成粉末，備用。

2.1.3 甘草汁炮制雷公藤制備方法 稱取雷公藤生藥材600 g(打粉機(jī)打碎成粗顆粒狀)及生甘草飲片200 g。

2.1.3.1 甘草汁制備方法 8倍體積的純凈水(1600 mL)浸泡甘草飲片30 min，煎煮20 min，煎煮液濾出，相同步驟重復(fù)煎煮兩次后合并濾液，濃縮至合適體積(約200 mL需能完全浸泡雷公藤)，備用。

2.1.3.2 甘草汁炮制雷公藤方法 用上述所得甘草汁浸泡雷公藤30 min，待甘草汁基本被雷公藤藥材吸盡；于恒溫100 ℃炒10 min至雷公藤藥材表面不粘手，得雷公藤炮制品。

2.1.3.3 雷公藤炮制樣品的提取方法 取上述制得的雷公藤炮制品，按照2.1.1項(xiàng)下雷公藤藥材提取制備方法，制得雷公藤炮制品的供試樣品。

2.2 正常人肝L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法

正常人肝L02細(xì)胞，在含有10%的胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素、100 μg·mL-1的鏈霉素的培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行。細(xì)胞均勻接種在96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，鋪板24 h后給藥(由于雷公藤提取物不易溶于水，每孔細(xì)胞加入0.1%的DMSO助溶)，待給藥24 h后進(jìn)行熒光染色。本實(shí)驗(yàn)采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法，用濃度為1 μmol·L-1的SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(Abs/Em：547/570 nm)標(biāo)記死細(xì)胞的細(xì)胞核顯橙色，用質(zhì)量濃度為1 μg·mL的Hochest 33342(Ex/Em：350/461 nm)標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核顯藍(lán)色，于37 ℃避光孵育15 min后，由高內(nèi)涵儀器直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并分析各孔的細(xì)胞存活情況。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

用ImageXpress Micro XL高內(nèi)涵軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以GraphPad Prism 5.0、OriginPro 8.5、IBM SPSS Statistics 20軟件處理，所有數(shù)據(jù)均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 雷公藤提取物對(duì)正常人肝L02細(xì)胞的毒性分析及其IC50值

本實(shí)驗(yàn)設(shè)10個(gè)質(zhì)量濃度梯度(C1～C10)，分別為12、9、6、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg·mL-1，最高質(zhì)量濃度為12 mg·mL-1，用ImageXpress Micro XL高內(nèi)涵儀器，采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法(Hochest 33342標(biāo)記所有的細(xì)胞，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain標(biāo)記死細(xì)胞)，以每孔活細(xì)胞的百分比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用GraphPad Prism 5.0軟件處理，結(jié)果lgIC50值為-0.127 3，計(jì)算IC50值為0.746 mg·mL-1(約0.75 mg·mL-1)，見(jiàn)圖1。

圖1 雷公藤提取物作用于肝L02細(xì)胞的IC50值

3.2 雷公藤配伍甘草對(duì)肝細(xì)胞減毒作用的比例篩選

為進(jìn)一步篩選甘草減弱雷公藤對(duì)肝細(xì)胞毒性作用的適宜配比，本實(shí)驗(yàn)采用0.75 mg·mL-1雷公藤與不同質(zhì)量濃度(0.25、0.125、0.083 mg·mL-1)的甘草進(jìn)行配伍，雷公藤與甘草的比例分別是3∶1，6∶1，9∶1，比較雷公藤單用(0.75 mg·mL-1)及與甘草不同配伍比例(3∶1，6∶1，9∶1)對(duì)細(xì)胞的抑制效果。圖2結(jié)果顯示，3∶1與6∶1的比例在肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)上都能達(dá)到有效的減毒效果。但考慮到甘草在體內(nèi)的首過(guò)效應(yīng)等問(wèn)題，為保證體內(nèi)減毒效果，故選擇較大的甘草的比例[雷公藤-甘草(3∶1)]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

注：*P<0.05,下同。圖2 雷公藤與甘草不同配伍比例樣品的細(xì)胞抑制率

3.3 高內(nèi)涵分析方法評(píng)價(jià)雷公藤不同樣品作用于肝細(xì)胞的毒性情況

實(shí)驗(yàn)取雷公藤對(duì)肝細(xì)胞毒性的IC50值為0.75 mg·mL-1，對(duì)乙酰氨基酚3 mg·mL-1作為肝細(xì)胞毒性的陽(yáng)性對(duì)照，甘草與雷公藤的配伍比例為1∶3，甘草炮制雷公藤用藥比例為1∶3，分析比較雷公藤單用、甘草炮制雷公藤、雷公藤配伍甘草作用于細(xì)胞的毒性差異。

配制高質(zhì)量濃度的雷公藤溶液，稀釋為0.75 mg·mL-1(含0.1%的DMSO)，配制含等濃度雷公藤的甘草汁炮制品(雷公藤炮品)和雷公藤配伍甘草的樣品(雷公藤配品)，稀釋的終濃度樣品同樣含有0.1%的DMSO，陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照也加入0.1%的DMSO。將各樣品均勻加入到預(yù)先種好的細(xì)胞中，復(fù)6孔，24 h后染色分析。用ImageXpress Micro XL高內(nèi)涵儀器分析，采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法(Hochest 33342標(biāo)記所有細(xì)胞顯藍(lán)色，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain標(biāo)記死細(xì)胞顯橙色)，以細(xì)胞抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用OriginPro 8.5軟件作圖。

圖3 高內(nèi)涵染色技術(shù)分析雷公藤不同樣品對(duì)肝細(xì)胞的作用

從圖3細(xì)胞核染色情況來(lái)看，陽(yáng)性對(duì)照組與雷公藤組的細(xì)胞毒性作用較大，死細(xì)胞數(shù)目較多，而雷公藤炮制品與配品的死細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較少，細(xì)胞毒性較小。由圖4的細(xì)胞抑制率更能準(zhǔn)確反映出對(duì)乙酰氨基酚和雷公藤對(duì)細(xì)胞的毒性作用之大，同時(shí)反映出甘草炮制雷公藤可有效減低肝細(xì)胞的毒性，其減毒效果與雷公藤配伍甘草相當(dāng)，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 雷公藤不同樣品的細(xì)胞抑制率

4 討論

研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞水平上，甘草汁炮制雷公藤與雷公藤配伍甘草兩種方法都能有效降低雷公藤對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，且甘草汁炮制的雷公藤更便于臨床應(yīng)用，為以后開(kāi)發(fā)雷公藤的低毒飲片奠定基礎(chǔ)。

本研究選擇人正常肝細(xì)胞系L02細(xì)胞，結(jié)合高內(nèi)涵分析技術(shù)評(píng)價(jià)甘草炮制雷公藤的減毒效果。高內(nèi)涵分析技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新藥篩選技術(shù)，該技術(shù)在保留了高通量能力的基礎(chǔ)上，不再是在分子水平針對(duì)某種單一靶標(biāo)進(jìn)行的篩選，而是在細(xì)胞水平針對(duì)生物體內(nèi)多系統(tǒng)、多途徑、多種靶標(biāo)進(jìn)行的實(shí)施動(dòng)態(tài)篩選，提供了細(xì)胞水平全方位的檢測(cè)平臺(tái)，為藥物毒理學(xué)研究提供了高效的使用工具[10]。

并且該技術(shù)已廣泛用于新藥研發(fā)的早期篩選、毒性評(píng)價(jià)及毒性機(jī)制的研究等方面[11]。本實(shí)驗(yàn)利用其高通量、直觀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)，嘗試對(duì)甘草炮制雷公藤減毒作用進(jìn)行早期評(píng)估，研究結(jié)果顯示甘草炮制雷公藤能有效降低雷公藤對(duì)肝細(xì)胞的毒性，為后續(xù)深入研究提供參考。后期課題組將在此基礎(chǔ)上開(kāi)展甘草炮制雷公藤減毒的體內(nèi)效果評(píng)價(jià)及機(jī)制研究，為雷公藤的臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

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CompatibilityAttenuatedResearchofGlycyrrhizaConcoctedTripterygiumwilfordiiBasedonHighContentAnalysis

MAZhijie1，DONGJieming1，WANGJiabo2，PANGJingyao1，3*，PUShibiao4*

(1.BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.ChinaMilitaryInstituteofChineseMedicine，302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.DepartmentofPharmacy，BeijingLuheHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing101149，China；4.TraditionalChineseMedicineCollegeYunnanUniversityofTCM，Kunming650200，China)

Objective：To observe the compatibility attenuated effect ofGlycyrrhizaconcoctedTripterygiumwilfordiion L02 hepatocyte modelinvitro，and provide the basis for the study ofT.wilfordiilow toxicity decoction pieces.MethodsThe effects of concocted attenuating and compatibility attenuated ofGlycyrrhizaandT.wilfordiiwere compared by using High Content Analysis technology.ResultsA dose dependent relation existed betweenT.wilfordiiand hepatic cells injury，that bothGlycyrrhizaconcoctedT.wilfordiiandGlycyrrhizacompatibilityT.wilfordiihad a significant attenuated effect under the dose of IC50.ConclusionConcocting attenuated effect ofGlycyrrhizaandTripterygiumwilfordiiwas specifically reflected through High Content Analysis technology，the results provide reference for clinical safe drug use.

Tripterygiumwilfordii；Glycyrrhiza；concocting attenuated；High Content Analysis

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)(首發(fā)2016-4-2024)；北京市醫(yī)院管理局“青苗”人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(QMI20160106)；北京友誼醫(yī)院院?jiǎn)?dòng)項(xiàng)目(YYDQKT2014-20)

*

龐晶瑤，臨床藥師，研究方向：中藥藥理，E-mail: pjy101411@163.com；浦仕彪,博士，副教授，研究方向：肝病的中醫(yī)診療研究，E-mail: pushi511@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.013

2017-01-12)