毛坤軍，張莉，周慧云，黃平

(江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，江西 上饒 334000)

斷節(jié)參抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

毛坤軍，張莉，周慧云，黃平*

(江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，江西 上饒 334000)

目的尋找斷節(jié)參中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分。方法采用體外抑制α-葡萄糖苷酶活性模型進行追蹤，用各種色譜法分離，根據(jù)理化性質(zhì)和譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu)，篩選出活性較強的單體化合物并進行酶活性抑制動力學(xué)研究。結(jié)果斷節(jié)參乙醇提取物的乙酸乙酯溶性部位具有顯著的抑制α-葡萄糖苷酶活性，從中分離出3個化合物，其中斷節(jié)參苷H和青陽參苷B兩個皂苷類化合物具有較強抑制α-葡萄糖苷酶活性，IC50分別為21.90、35.32 mg·L-1，明顯高于陽性對照藥阿卡波糖(IC50=1 017.41 mg·L-1)。酶活性抑制動力學(xué)反應(yīng)結(jié)果表明，兩個皂苷對α-葡萄糖苷酶的抑制類型均為非競爭性抑制劑。結(jié)論斷節(jié)參苷H和青陽參苷B為首次報道對α-葡萄糖苷酶有抑制活性。

斷節(jié)參；α-葡萄糖苷酶；斷節(jié)參苷H；青陽參苷B；抑制類型

斷節(jié)參系蘿藦科鵝絨藤屬植物昆明杯冠藤CynanchumwallichiiWight的根，又名對節(jié)參，青洋參，斷節(jié)參主要分布于我國四川、貴州、云南以及廣西等地。具有補肝腎、強筋骨之功效，主要用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及腎虛腰痛、病后體虛、跌打損傷[1]等?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，斷節(jié)參主要含有C21甾體皂苷、苯乙酮、甾醇等類化合物[2-3]，現(xiàn)代藥理活性研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁等藥理活性[4-6]，但未見對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究報道。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖。由于其獨特的優(yōu)勢，目前已被廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治。為進一步開發(fā)利用斷節(jié)參資源，本實驗采用體外抑制α-葡萄糖苷酶活性篩選模型，從斷節(jié)參乙醇提取物的乙酸乙酯活性部位分離得到12個化合物，其中兩個皂苷類化合物具有明顯的抑制α-葡萄糖苷酶活性。

1 主要儀器和試劑

680型自動酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；AY220電子分析天平(日本島津分析儀器公司)；雷磁PHSJ-3F型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，Costar 96孔細胞培養(yǎng)板。

對硝基苯酚(p-Nitrophenol，33920)購于上海阿拉丁有限公司；α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，SLBB7613V)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-ntrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，BCBG2931V)、阿卡波糖(acarbose，Lot16869)、DMSO均購自Sigma公司；乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇均為分析純(廣東華光科技股份有限公司)。

斷節(jié)參藥材采自云南昆明(批號：120914)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物昆明杯冠藤CynanchumwallichiiWight的根。

2 方法

2.1 提取與分離

斷節(jié)參藥材20 kg，打成粗粉，以8倍量95%乙醇回流提取2 h，重復(fù)2次，再以50%乙醇回流提取提取1次，合并提取液濾液，濃縮至無醇味，再加水混懸依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部位230 g、乙酸乙酯部位420 g、正丁醇部位480 g，剩余水部位950 g。

體外α-葡萄糖苷酶抑制活性研究發(fā)現(xiàn)，石油醚和乙酸乙酯溶性部位有較強活性。取乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜(依次以石油醚-乙酸乙酯和二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫)分離得到不同極性段，再經(jīng)過中壓制備柱色譜、ODS 柱色譜(甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫)、Sephadex LH-20柱色譜(甲醇-水)反復(fù)分離和純化。最終分離得到化合物1(128 mg)、2(79 mg)和3(37 mg)。

2.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的篩選方法

2.2.1 檢測方法 本檢測在96孔板上進行，反應(yīng)體系參照康文藝等[7]的方法，按照公式(1)計算抑制率(I)。

I(%)=[1-(A樣品-A樣品空白)/(A陰性-A空白]×100%

(1)

并用Origin軟件求出相應(yīng)半數(shù)最大抑制濃度(IC50)值。同時設(shè)定陰性對照組(緩沖液+酶液+底物)、空白對照組(緩沖液)、樣品測定組(樣品+酶液+底物)、樣品對照組(樣品+緩沖液)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 根據(jù)反應(yīng)體系，用磷酸緩沖液(pH 6.8)配制1000 μmol·L-1的PNP，稀釋成 400、300、200、150、100、50、25、5、0 μmol·L-1。分別取7種不同濃度的PNP溶液各160 μL，加入0.2 moL·L-1Na2CO3溶液80 μL，混勻，在405 nm下測定A值，平行3次。以A值為縱坐標(biāo)，對硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3α-葡萄糖苷酶活力的測定 根據(jù)反應(yīng)體系：[110 μL 磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)，加入20 μL 0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶，10 μL DMSO，37 ℃恒溫15 min后加入2.5 mmoL·L-1PNPG 20 μL，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，再加入80 μL 0.2 moL·L-1Na2CO3溶液]，于405 nm波長下測定A值。

酶活力單位定義：37 ℃、pH 6.8條件下，每分鐘水解底物所產(chǎn)生1 μmoL對硝基苯酚的酶量，規(guī)定為1個酶活力單位(U)。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定型粉末(甲醇)，Liebermann-Burchard和Keller-Kiliani反應(yīng)陽性，UV光譜在220nm有最大吸收，推測其可能為甾體2-去氧糖苷類化合物。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：1.04(3H，s，19-CH3)，1.53(3H，s，18-CH3)，2.03(3H，s，21-CH3)，3.72(3H，s，3″′-OCH3)，3.79(3H，s，3″″-OCH3)，4.05(1H，brs，3α-H)，4.55(1H，dd，J=12，4.5 Hz，12α-H)，4.70(1H，d，J=9.3 Hz，1″″-H)，4.74(1H，d，J=9.3 Hz，1″′-H)，4.86(1H，d，J=8.7 Hz，1″-H)，5.28(1H，brs，6-CH)，5.56(1H，s，2′-CH)，6.81(2H，d，J=8.7 Hz，4′，6′-H)，7.72(2H，d，J=8.7 Hz，3′，7′-H)，10.26(1H，s，5′-OH)；13C-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：38.2(C-1)，28.8(C-2)，76.3(C-3)，38.0(C-4)，137.9(C-5)，118.7(C-6)，33.7(C-7)，73.0(C-8)，42.9(C-9)，36.2(C-10)，23.8(C-11)，72.1(C-12)，57.0(C-13)，88.4(C-14)，33.0(C-15)，32.9(C-16)，91.1(C-17)，10.1(C-18)，17.5(C-19)，209.1(C-20)，27.2(C-21)，163.8(C-1′)，120.4(C-2′)，131.2(C-3′，7′)，115.1(C-4′，6′)，161.7(C-5′)。此外，100.8(C-1″)、36.1(C-2″)、79.8(C-3″)、74.9(C-4″)、71.5(C-5″)、18.0(C-6″)、56.4(OCH3)；98.8(C-1″′)、35.2(C-2″′)、76.4(C-3″′)、81.7(C-4″′)、68.0(C-5″′)、17.9(C-6″′)、57.8(OCH3)；95.0(C-1″″)、37.9(C-2″″)、66.1(C-3″″)、81.9(C-4″″)、67.4(C-5″″)、18.0(C-6″″)分別為β-D-Ole、β-D-Cym、β-D-Dgt碳信號。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道的斷節(jié)參苷H基本一致，故化合物1鑒定為斷節(jié)參苷H。

化合物2：白色無定型粉末(甲醇)，Liebermann-Burchard和Keller-Kiliani反應(yīng)陽性，UV光譜在220nm有最大吸收，推測其可能為甾體2-去氧糖苷類化合物。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：0.99，1.02(6H，d，J=6.9 Hz，5′，6′-CH3)，1.04(3H，s，19-CH3)，1.40(3H，s，18-CH3)，2.03(3H，s，7′-CH3)，2.09(3H，s，21-CH3)，3.31(3H，s，3″-OCH3)，3.33(3H，s，3′″-OCH3)，3.34(3H，s，3″″-OCH3)，3.69(1H，m，3α-H)，4.33(1H，dd，J=11.7，4.5 Hz，12α-H)，4.52(1H，d，J=9.3 Hz，1″″-H)，4.67(1H，d，J=9.0 Hz，1″′-H)，4.76(1H，d，J=8.7 Hz，1″-H)，5.27(1H，brs，6-CH)，5.43(1H，s，2′-CH)；13C-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：38.6(C-1)，28.7(C-2)，75.0(C-3)，37.0(C-4)，137.9(C-5)，118.7(C-6)，33.7(C-7)，73.0(C-8)，43.0(C-9)，36.2(C-10)，23.7(C-11)，71.4(C-12)，56.6(C-13)，88.3(C-14)，33.0(C-15)，31.6(C-16)，90.9(C-17)，9.9(C-18)，17.5(C-19)，208.7(C-20)，26.8(C-21)，164.6(C-1′)，113.0(C-2′)，164.5(C-3′)，36.2(C-4′)，20.5(C-5′)20.7(C-6′)15.9(C-7′)。此外，100.8(C-1″)、35.5(C-2″)、79.8(C-3″)、75.0(C-4″)、71.5(C-5″)、17.9(C-6″)、56.4(OCH3)；99.3(C-1″′)、35.5(C-2″′)、76.6(C-3″′)、81.8(C-4″′)、67.8(C-5″′)、17.9(C-6″′)、56.4(OCH3)；95.0(C-1″″)、37.9(C-2″″)、76.5(C-3″″)、82.0(C-4″″)、67.9(C-5″″)、18.0(C-6″″)、57.8(OCH3)分別為β-D-Ole、β-D-Cym、β-D-Cym碳信號。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道的青陽參苷B基本一致，故化合物2鑒定為青陽參苷B。

化合物3：白色針狀結(jié)晶，mp 215～220 ℃，1H-NMR(C5D5N，300 MHz)δ：1.46(3H，s，19-CH3)，2.00(3H，s，18-CH3)，2.64(3H，s，21-CH3)，3.88～3.99(2H，m，3α和12α-H)，5.38(1H，brs，6-H);13C-NMR(C5D5N，300 MHz)δ：39.3(C-1)，32.1(C-2)，71.6(C-3)，43.5(C-4)，140.4(C-5)，118.8(C-6)，34.3(C-7)，74.4(C-8)，45.0(C-9)，37.4(C-10)，29.5(C-11)，69.0(C-12)，60.5(C-13)，89.3(C-14)，35.1(C-15)，32.8(C-16)，92.6(C-17)，9.4(C-18)，18.6(C-19)，209.6(C-20)，27.9(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻[2]報道的去酰基蘿藦苷元基本一致，故鑒定化合物3為去酰基蘿藦苷元。

3.2 提取部位對α-葡萄糖苷酶活性抑制成分的篩選

斷節(jié)參提取物不同極性部位及陽性藥阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用見圖1，石油醚、乙酸乙酯、總皂苷部位的抑制活性較好，其抑制率明顯高于其他部位以及陽性對照藥，所以可采用活性追蹤方式對乙酸乙酯部位繼續(xù)分離。

注：各提取物初篩質(zhì)量濃度均為1.5 g·L-1。圖1 不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較

3.3 對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用化合物的篩選

對分離得到的化合物進行初步α-葡萄糖苷酶活性抑制篩選，結(jié)果見表1。皂苷類化合物具有明顯的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，而苷元對α-葡萄糖苷酶活性基本沒有抑制作用。

表1 單體化合物體外抑制α-葡萄糖苷酶活性

3.4 活性化合物IC50實驗

不同質(zhì)量濃度(200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1)下斷節(jié)參苷H和青陽參苷B抑制α-葡萄糖苷酶活性見圖2。根據(jù)圖2并用Origin軟件得斷節(jié)參苷H和青陽參苷B的IC50分別為21.90、35.32 mg·L-1，遠小于陽性對照藥阿卡波糖的IC50值(IC50=1 017.41 mg·L-1)，且兩個化合物對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均與濃度呈正量效關(guān)系。

3.5 受試化合物抑制類型的確定

化合物1和2分別取適宜的兩個不同質(zhì)量濃度，PNPG取4個不同質(zhì)量濃度，分別測定反應(yīng)速度。按Lineweave-Burk作圖法，以1/[S](L·mmol-1)為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，分別繪制兩個化合物的抑制作用動力學(xué)曲線(見圖3和4)。圖3和4顯示化合物1和2對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均屬于非競爭性抑制劑，反應(yīng)速度Vmax隨受試化合物濃度增大而減小，米氏常數(shù)Km值保持不變。

圖2 受試化合物不同質(zhì)量濃度下對α-葡萄糖苷酶抑制曲線

圖3 化合物1的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線

圖4 化合物2的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線

4 討論

近年來，鑒于皂苷類化合物毒副作用小、作用溫和、性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點[7]，其降血糖作用研究進展迅速，如苦瓜皂苷、大豆皂苷、人參皂苷等三萜皂苷以及藠頭皂苷、玉竹皂苷、三七皂苷等甾體皂苷均具有顯著的降血糖作用[8-10]。C21甾體皂苷是斷節(jié)參中主要化學(xué)成分，其是否有降血糖功效筆者未見相關(guān)文獻報道，本實驗首次利用體外抑制α-糖苷酶活性篩選模型對斷節(jié)參提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性進行了初步篩選，結(jié)果表明乙酸乙酯部分有較高的抑制活性，采用活性追蹤方法從斷節(jié)參中分離得到12個以皂苷和二苯酮類為主的活性化合物，并對其進行體外抑制α-葡萄糖苷酶活性篩選，結(jié)果表明皂苷類化合物具有顯著活性，而皂苷苷元及二苯酮基本沒有活性。

為了驗證實驗結(jié)果，本實驗還通過D-101大孔樹脂富集得到總皂苷部位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同等質(zhì)量濃度下其抑制α-葡萄糖苷酶活性又明顯高于乙酸乙酯部位，進一步證明了斷節(jié)參降血糖主要活性成分是皂苷類成分。本課題組將繼續(xù)對乙酸乙酯部位進行分離，以期得到更多皂苷類化合物，為皂苷類化合物降血糖作用機制、構(gòu)效關(guān)系以及體內(nèi)降血糖效果的研究奠定基礎(chǔ)。

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StudyonActiveComponentInhibitingα-GlucosidaseInhibitofromCynanchumwallichii

MAOKunjun，ZHANGLi，ZHOUHuiyun，HUANGPing*

(Departmentofpharmacy，JiangxiMedicalCollege，Shangrao334000，China)

Objective：To findα-glucosidase inhibitors fromCynanchumwallichii.MethodsThe α-glucosidase inhibitor was isolated and purified by the bioactivity-guided methodinvitro，which was used to analyze the inhibitory activity against α-glucosidase.The inhibitory kinetic of the isolations was also investigated.ResultsThe ethyl acetate extract ofCynanchumwallichiishowed strong inhibitory activity and three compounds were isolated and identified，only wallicoside H(IC50=21.90 mg·L-1)and otophylloside B showed strong inhibitory activity(IC50=35.32 mg·L-1)which was higher than that of acarbose(IC50=1 017.41 mg·L-1).Both of them showed noncompetitive type on α-glucosidase.ConclusionIt was reported that wallicoside H and otophylloside B have α-glucosidase Inhibitors active for the first time.

Cynanchumwallichii；α-glucosidase；wallicoside H；otophylloside B；inhibition type

*

黃平，講師，研究方向：藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究；E-mail：737259639@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.009

2017-03-06)