陳光耀，韓際奧，周東曉，高 曉，馬英杰

·肝硬化·

肝硬化患者小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)及其外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)的變化

陳光耀，韓際奧，周東曉，高 曉，馬英杰

目的探討肝硬化患者小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)（SIBO）和外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的變化。方法采用乳果糖-氫呼氣試驗(yàn)（LHBT）檢測(cè)40例肝硬化患者和16例正常人小腸細(xì)菌生長(zhǎng)情況，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)。結(jié)果肝硬化患者SIBO檢出率為42.5%（17/40），顯著高于正常人的6.3%（1/16，P＜0.01）；肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4相對(duì)表達(dá)量為（23.4±11.4），顯著高于正常人的【（14.4±5.2），P＜0.05】；17例肝硬化SIBO陽(yáng)性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)為（30.2±12.3），顯著高于23例肝硬化SIBO陰性患者【（19±8.6），P＜0.05】。結(jié)論肝硬化患者存在較高的SIBO發(fā)生率，外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)上調(diào)，SIBO可能通過(guò)與TLR4的作用在肝硬化病情進(jìn)展中發(fā)揮作用。

肝硬化；小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)；內(nèi)毒素；TOLL樣受體4

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一種重要的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），其通過(guò)識(shí)別細(xì)菌、真菌、病毒等病原體相關(guān)結(jié)構(gòu)成分（如糖類、脂類、多肽及核苷酸等），在激活先天免疫反應(yīng)中起著舉足輕重的作用[1]。目前，人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的TLRs已有十余種，而TLR4是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)亞型，其主要識(shí)別細(xì)菌內(nèi)毒素即細(xì)胞壁脂多糖（lipopolysaccaride，LPS）。研究發(fā)現(xiàn)，LPS通過(guò)調(diào)節(jié)外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)，參與肝硬化的發(fā)病及進(jìn)展[2]。近些年，肝硬化患者小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)（small intestinal bacterial overgrowth，SIBO）成為研究的熱點(diǎn)，但其是否通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)參與肝硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，目前研究還較少。本文就肝硬化患者SIBO與外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2015年11月～2016年6月鄭州市人民醫(yī)院消化科收治的乙型肝炎肝硬化患者40例，男28例，女12例；平均年齡（56.6±10.5）歲。符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除其他病毒感染及肝癌患者，排除甲狀腺疾病、糖尿病、功能性胃腸病等影響胃腸動(dòng)力的疾病患者，排除近期使用過(guò)抗生素、抑酸劑、糖皮質(zhì)激素及影響胃腸動(dòng)力藥物的患者。肝功能Child-Pugh A級(jí)12例，B級(jí)13例，C級(jí)15例。另選擇同期來(lái)本院健康體檢者16例，男10例，女6例；平均年齡（54.3±10.7）歲。受試者簽署知情同意書。肝硬化患者與健康體檢者性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 SIBO的檢測(cè) 使用氫氣檢測(cè)設(shè)備（英國(guó)Bedfont公司生產(chǎn)的EC60Gastrolyzer型）檢測(cè)，氫氣濃度以ppm表示，檢測(cè)范圍為0～500 ppm，靈敏度為1ppm，精度±5%。檢測(cè)前一晚，受試者進(jìn)食淀粉類食物，晚餐后至次日檢查前空腹約14 h。晨起排便、刷牙后，服用少許溫開(kāi)水，以恢復(fù)腸道運(yùn)動(dòng)功能。檢測(cè)前2 h和檢測(cè)過(guò)程中，受試者不進(jìn)行劇烈的活動(dòng)或吸煙。先檢測(cè)基礎(chǔ)氫氣濃度，然后給予乳果糖（杜密克，荷蘭蘇威制藥）10 g和溫開(kāi)水250 ml口服。自口服乳果糖時(shí)間點(diǎn)算起，每隔I5 min檢測(cè)1次氫氣濃度，連續(xù)檢測(cè)不少于2 h。以基礎(chǔ)值超過(guò)20 ppm或口服杜密克后呼氣氫濃度上升超過(guò)基礎(chǔ)值12 ppm為SIBO陽(yáng)性，反之為SIBO陰性。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4的檢測(cè) 抽取上述研究對(duì)象外周血2 ml，注入抗凝管，保存于4℃冰箱中。對(duì)每例研究對(duì)象分別取標(biāo)記為A和B的兩只試管。首先，在B管中加入PE標(biāo)記的鼠抗人TLR4（美國(guó)BD公司）10 μl，APC標(biāo)記的鼠抗人CD14（美國(guó) BD 公司）10 μl，再加抗凝全血 100 μ l，振蕩、混勻。在A管中分別加入PE同型對(duì)照（美國(guó)BD公司）10 μl，APC標(biāo)記的鼠抗人CD14（美國(guó)BD 公司）10 μl，抗凝血 100 μl，振蕩混勻，室溫避光孵育20 min。再在A管和B管中加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，混勻，避光10 min。離心，棄上清，加入洗滌液2 ml，再次離心，棄上清，再加入洗滌液1 ml。使用流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur），以 CD14（APC）標(biāo)記并獲取10000個(gè)CD14+單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)CellQuest軟件分析，作直方圖，用平均熒光強(qiáng)度的幾何均數(shù)（geometric mean fluorescence，GMF）表示TLR4的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIBO發(fā)生情況 在16例正常人中檢出1例（6.3%）SIBO，在40例肝硬化患者中檢出17例（42.5%）SIBO，兩組差異顯著（P＜0.01）；不同肝功能分級(jí)的肝硬化患者SIBO陽(yáng)性率不同，Child A級(jí)與Child B/C級(jí)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=4.68，P=0.03，表 1）。

表1 肝硬化與正常人SIBO發(fā)生率（%）比較

2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)水平變化 肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4水平顯著高于正常人（P＜0.05）；肝硬化伴SIBO陽(yáng)性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4水平顯著高于SIBO陰性組（P＜0.05）；肝硬化SIBO陰性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4水平與正常人比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表 2、圖 1～3）。

表2 肝硬化與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)水平（±s）比較

表2 肝硬化與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)水平（±s）比較

與正常人比，①P＜0.05；與肝硬化SIBO陰性患者比，②P＜0.05

例數(shù) TLR4（GMF）肝硬化 40 23.4±11.4①SIBO 陽(yáng)性 17 30.2±12.3②SIBO陰性 23 19±8.6正常人 16 14.4±5.2

圖1 正常人單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)

圖2 肝硬化SIBO陰性患者單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)

圖3 肝硬化SIBO陽(yáng)性患者單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)

3 討論

小腸在正常狀態(tài)下是一種相對(duì)無(wú)菌的狀態(tài)。但是，由于肝臟和胃腸道之間的各種病理生理環(huán)境的存在，肝硬化患者暴露于腸道生態(tài)失衡的風(fēng)險(xiǎn)較高。肝硬化患者腸蠕動(dòng)減弱、胃液pH值升高、膽汁酸分泌減少等可能引起腸道菌群失調(diào)，結(jié)腸的細(xì)菌移向小腸，引起SIBO[4，5]。雖然空腸提取液培養(yǎng)被認(rèn)為是診斷SIBO的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但這種技術(shù)需要腸插管，患者耐受性差，并且部分菌種在實(shí)驗(yàn)室條件下無(wú)法培養(yǎng)。乳果糖氫呼氣試驗(yàn)（lactulose hydrogen breath test，LHBT）、葡萄糖氫呼氣試驗(yàn)（glucose hydrogen breath test，GHBT）是相對(duì)無(wú)創(chuàng)的，成本較低。但是，由于葡萄糖幾乎都在小腸近段被吸收，所以GHBT難以檢測(cè)出小腸遠(yuǎn)端的細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)[6]，具有一定的局限性，而LHBT已在肝硬化患者SIBO的診斷中得到廣泛的應(yīng)用[7]。魏新朋等[8]用LHBT得出肝硬化伴SIBO的發(fā)生率為46.8%，Pande CA et al[9]發(fā)現(xiàn)肝硬化患者SIBO患病率可達(dá)49%。本研究通過(guò)對(duì)40例肝硬化患者和16例正常人進(jìn)行LHBT檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者SIBO陽(yáng)性率為42.5%，與國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)相近，提示肝硬化患者具有較高的小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，且隨著肝功能損傷程度加重，SIBO發(fā)生率升高。

肝硬化患者易發(fā)生SIBO，并且已經(jīng)有文獻(xiàn)表明SIBO 可導(dǎo)致或加重肝硬化患者內(nèi)毒素血癥[10，11]，可能是肝硬化伴SIBO陽(yáng)性時(shí)，腸道中大量有害的革蘭氏陰性菌繁殖、裂解，釋放大量?jī)?nèi)毒素，同時(shí)患者存在免疫功能低下，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)解毒能力下降，以及腸道通透性增加等，造成內(nèi)毒素易位至體循環(huán)，導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥[12]。在內(nèi)毒素血癥形成以后，LPS通過(guò)引起肝細(xì)胞能量生成受阻，產(chǎn)生氧自由基而直接損傷肝細(xì)胞[13]。另外，作為L(zhǎng)PS天然配體的TLR4，其在單個(gè)核細(xì)胞等非特異性免疫細(xì)胞大量表達(dá)。肝硬化時(shí)外周血TLR4水平可分為上調(diào)和下調(diào)兩種情況。當(dāng)存在持續(xù)的HBV感染時(shí)，可以抑制TLR4的表達(dá)及其功能發(fā)揮，引起TLR4表達(dá)下調(diào)[14]，而當(dāng)受外源性配體LPS刺激時(shí)，TLR4被激活，且其表達(dá)隨LPS的提高而上調(diào)。LPS通過(guò)共同受體CD14和MD-2作用于外周血單個(gè)核細(xì)胞表面的TLR4，經(jīng)MyD88依賴性信號(hào)途徑和MyD88非依賴性信號(hào)途徑，刺激啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活，造成不同的促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，如 TNF-α、IL-6和 IL-1β 等[15]，形成“第二次打擊”[16]，再次引起肝細(xì)胞損傷。

LPS參與TLR4介導(dǎo)的肝臟炎癥-纖維化/肝硬化的形成過(guò)程[17]，并且TLR4的表達(dá)與肝硬化患者LPS水平密切相關(guān)。SIBO與TLR4在肝硬化發(fā)病和進(jìn)展中的關(guān)系尚不明確，我們就肝硬化患者SIBO與外周血TLR4表達(dá)關(guān)系展開(kāi)研究。與正常人比較，我們發(fā)現(xiàn)肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)增加，且肝硬化SIBO陽(yáng)性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)水平高于肝硬化SIBO陰性患者，提示肝硬化患者TLR4的表達(dá)與SIBO密切相關(guān)。SIBO是造成肝硬化患者內(nèi)毒素血癥的重要因素。當(dāng)肝硬化伴SIBO陽(yáng)性時(shí)，可能引起或加重肝硬化患者的腸源性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素進(jìn)入血液增加，LPS導(dǎo)致外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)其的應(yīng)激和敏感度增加，從而引起TLR4表達(dá)的升高，以此來(lái)識(shí)別大量LPS。Steib et al[18]已證實(shí)TLR4受LPS刺激后表達(dá)增加，從而提高其對(duì)LPS的敏感性。高表達(dá)的TLR4識(shí)別LPS后，激活下游信號(hào)途徑，誘導(dǎo)包括IL-6在內(nèi)的大量炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及釋放，又反過(guò)來(lái)刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)上調(diào)，兩者相互影響[19]，從而加速機(jī)體清除內(nèi)毒素分子，減輕內(nèi)毒素血癥。Kapild et al[20]發(fā)現(xiàn)NASH相關(guān)肝硬化患者SIBO發(fā)病率較高，且合并SIBO的患者內(nèi)毒素水平、TLR4表達(dá)顯著升高。楊少奇等[21]發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4的表達(dá)明顯高于正常人，并且內(nèi)毒素水平與TLR 4的表達(dá)成正相關(guān)。Manigol et al[22]也證實(shí)了肝硬化患者體內(nèi)高水平的內(nèi)毒素和IL-6可引起TLR4表達(dá)上調(diào)。而腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)和移位，又容易導(dǎo)致反復(fù)革蘭氏陰性菌感染，使機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素產(chǎn)生耐受[23]，也可能是少數(shù)肝硬化伴SIBO陽(yáng)性患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)無(wú)明顯升高的原因。另外，不排除與TLR4基因多態(tài)性[24]有關(guān)。具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步探討。

本研究將SIBO、LPS和TLR4與肝硬化的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系起來(lái)，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者具有較高的小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)和外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4的過(guò)度表達(dá)，且SIBO與LPS的配體TLR4上調(diào)相關(guān)。SIBO可能通過(guò)與TLR4的作用，促進(jìn)和加重肝硬化的發(fā)生和發(fā)展。因此，開(kāi)啟針對(duì)微生物群或致病途徑的新型干預(yù)，如調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，減少內(nèi)毒素經(jīng)腸道菌叢的釋放和吸收，抑制TLR4信號(hào)傳導(dǎo)等，具有重要的臨床意義。

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（收稿：2017-01-05）

（本文編輯：陳從新）

Smallintestinalbacterialovergrowth and TLR4 expression on the surface ofperipheralblood mononuclearcellsin patientswith liver cirrhosis

Chen Guangyao，Han Ji’ao，Zhou Dongxiao，etal.DepartmentofGastroenterology，Digestive Disease Institute，People's Hospital，Affiliated to Xinxiang Medical College，Zhengzhou 450003，China

Objective To explore the prevalence of small intestinal bacterial overgrowth（SIBO）and the changes of Toll-like receptor 4（TLR-4）expression on the surface of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in patients with liver cirrhosis.MethodsSIBO was detected by lactulose hydrogen breath test and TLR-4 expression was assayed by flow cytometry in 40 cirrhotics and 16 healthy persons.ResultsThe prevalence of SIBO in patients with liver cirrhosis was 42.5%，significantly higher than 6.3%in healthy people（P<0.01）；the expression of TLR4 on the surface of PBMCs in patients with cirrhosis was（23.4±11.4），significantly higher than[（14.4 ±5.2），P<0.05]in the control；the expression of TLR4 in 17 cirrhotic patients with SIBO-positive was（30.2±12.3），significantly higher than[（19±8.6），P<0.05]in 23 with SIBO-negative.Conclusions The patients with liver cirrhosis have a high incidence of small intestinal bacterial overgrowth，and the expression of TLR4 on PBMCs increases，which might play an important role in the development of cirrhosis.

Liver cirrhosis；Small intestinal bacteria overgrowth；Endotoxin；Toll-like receptor 4

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.022

450003鄭州市 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬鄭州人民醫(yī)院消化科/鄭州市消化疾病研究所

陳光耀，男，26歲，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2015級(jí)碩士研究生。主要從事腸道微生態(tài)與消化道疾病防治研究 。E-mail:123053586@qq.com

馬英杰，E-mail:mayingjie19@sina.com