陳 倩，焦方舟，張海月，張文斌，劉 揚，龔作炯

組蛋白去乙酰化酶抑制劑ACY1215對急性肝衰竭大鼠肝細胞線粒體的保護作用*

陳 倩，焦方舟，張海月，張文斌，劉 揚，龔作炯

目的探討ACY1215對急性肝衰竭大鼠肝細胞線粒體損傷的保護作用及其相關機制。方法24只SD大鼠被隨機分為對照組、模型組和ACY1215處理組。以脂多糖（LPS）聯(lián)合D-氨基半乳糖（D-Gal）注射建立急性肝衰竭大鼠模型，藥物干預組在建立急性肝衰竭組前2 h給予ACY1215（10 mg·kg-1）注射。造模48 h后處死動物，在光鏡及電鏡下觀察肝組織學變化，采用梯度離心法分離肝細胞線粒體，采用熒光酶標法測定線粒體膜通透性轉換孔（MPTP），采用ELISA法測定線粒體細胞色素C（Cytc）含量，常規(guī)測定血清ALT、AST和總膽紅素（TBil）水平。結果與模型組比，ACY1215處理組肝組織學破壞程度減輕，電鏡顯示肝細胞線粒體腫脹減輕；急性肝衰竭模型組大鼠血清 ALT、AST 和 TBIL 水平分別為（5114.1±252.6）U/L、（2909.8±31.7）U/L 和（97.6±1.4）μmol/L，均顯著高于正常組大鼠的（56.0±4.4）U/L、（130.4±12.6）U/L 和（7.4±0.7）μmol（P均 ＜0.05），但處理組 ALT、AST 和 TBIL 水平均較模型組減低，分別為（799.4±11.2）U/L、（401.0±5.6）U/L 和（28.0±1.2）μmol/L（P均 ＜0.05）；急性肝衰竭模型組大鼠MPTP相對熒光值（RFU）為（96822.0±16733.1）RFU/mgprot，較正常組大鼠的（156300.0±24043.3）RFU/mgprot顯著升高（P＜0.05），也顯著高于處理組的（127150.0±12337.6）RFU/mgprot（P＜0.05）；模型組大鼠線粒體內(nèi) Cytc為（0.17±0.03）ng/mgprot，較正常組大鼠線粒體內(nèi)的（0.39±0.10）ng/mgprot顯著減少（P＜0.05），也低于處理組的（0.32±0.06）ng/mgprot（P＜0.05）。結論ACY1215對急性肝衰竭大鼠肝臟線粒體有一定的保護作用，其作用機制可能是通過抑制肝細胞線粒體MPTP的開放，從而減少了Cytc進入到細胞質內(nèi)有關。

急性肝衰竭；線粒體；組蛋白去乙?；种苿?ACY1215；大鼠

有研究發(fā)現(xiàn)，急性肝衰竭大鼠肝臟線粒體產(chǎn)能遠低于正常大鼠[1，2]。線粒體膜通透性轉換器（mitochondrial permeability transition，MPTP）是一種跨越線粒體內(nèi)外膜的蛋白孔道，在正常生理條件下處于關閉狀態(tài)。各種藥物、氧化刺激、Ca+和pH值的變化可通過一定的途徑使得MPTP開放，導致細胞色素C（Cytochrome C，Cytc）和細胞因子從線粒體漏入到胞質，從而損害肝細胞線粒體氧化磷酸化和能量代謝過程。肝細胞線粒體的損傷會進一步導致肝細胞呼吸功能受損，能量代謝失衡，最終導致細胞凋亡或壞死[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物去乙?；M蛋白酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑對急性肝衰竭大鼠肝細胞有保護作用[6，7]，但目前尚缺乏相關文獻證實該類藥物對肝細胞線粒體是否具有一定的保護作用。本研究觀察了選擇性VI類HDAC抑制劑ACY1215對急性肝衰竭大鼠的保護作用及對肝細胞線粒體的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗器材、藥物與主要試劑 VICTOR3 1420型酶標儀購自芬蘭PerkinElmer公司；HT7700電子顯微鏡購自日本HITACHI公司；脂多糖（LPS）和D-氨基半乳糖（D-Gal）均購自美國Sigma-Aldrich公司；ACY1215購自美國Selleck公司；組織線粒體分離試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒購自武漢碧云天生物技術公司；GENMED純化MPTP熒光檢測試劑盒購自上海杰美基因公司；檢測大鼠CYTC-C酶聯(lián)免疫試劑盒購自南京建成生物工程研究所；10%中性福爾馬林購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 急性肝衰竭大鼠模型的制備 取健康雄性SPF級SD大鼠24只，體質量（200～230）g，購自武漢大學動物實驗中心。將大鼠隨機分為正常組、模型組和ACY1215干預組，每組8只。實驗前，所有大鼠適應喂養(yǎng)5 d。在干預組動物，在制備急性肝衰竭模型前 2 h，給予 ACY1215 10 mg·kg-1腹腔注射；在正常組大鼠，給予等量的生理鹽水注射；在急性肝衰竭模型組，給予 D-Gal 400 mg·kg-1和 LPS 100 μg·kg-1腹腔注射。在造模后48 h，處死所有大鼠，收集每只大鼠血液和0.3×0.4×0.4 cm大鼠肝組織，固定于10% 中性甲醛溶液中，石蠟常規(guī)包埋，切片后行HE染色，光鏡下觀察。同時取約1 mm3大小的肝組織，置于2.5%戊二醛內(nèi)固定30 min，行電鏡標本制作，電鏡下觀察肝細胞線粒體形態(tài)變化。

1.3 血清生化指標檢測 常規(guī)進行。

1.4 肝細胞線粒體的制備 取新鮮肝組織100 mg，PBS洗滌，加入預冷的線粒體分離試劑A液100 μl，冰浴上勻漿10次。在4℃ 600 g離心5 min，取上清液，11000 g再次離心10 min，得到的沉淀即為線粒體標本。

1.5 肝細胞線粒體MPTP相對熒光值（relative fluorescence unit，RFU）測定 采用熒光酶標儀檢測鈣黃綠素-AM，后者又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素-乙酰氧基甲基酯（[bis（bis-carboxymethy amino methyl fluorescein）-acetoxymeyhyl ester]，易進入到細胞的線粒體內(nèi)，后者可被線粒體內(nèi)的內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生具有熒光性強的鈣黃綠素，被線粒體俘獲。當MPTP處于開放狀態(tài)時，鈣黃綠素釋放出線粒體外，再通過離心處理，熒光強度會減弱。故線粒體內(nèi)鈣黃綠素熒光的變化代表了MPTP的開放狀態(tài)。具體的實驗步驟按照GENMED純化線粒體膜通道孔熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書進行。同時，每組對應的線粒體標本進行BCA蛋白定量，以校準單位線粒體蛋白濃度下MPTP開放情況。

1.6 肝細胞線粒體Cytc測定 在提取純化線粒體后，在100 mg肝組織分離得到的線粒體樣品中加入臨用前添加了PMSF（終濃度1 mmol/L）的線粒體裂解液200 μl，裂解線粒體，采用ELISA法測定。1.7統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，采用 Pearson相關分析。顯著性差異取α=0.05，即以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理學變化 正常組大鼠肝小葉結構清楚，肝細胞排列整齊，肝細胞周圍無炎性細胞浸潤；急性肝衰竭大鼠肝小葉結構模糊，肝細胞大塊壞死，周圍可見炎性細胞浸潤；ACY1215干預組大鼠肝小葉結構較清晰，較急性肝衰竭模型組肝細胞壞死明顯減輕，且炎性細胞浸潤亦明顯減少（圖1）。

圖1 各組肝組織學表現(xiàn)（HE，200×）

2.2 各組大鼠肝組織超微結構的改變 正常組大鼠肝細胞線粒體內(nèi)外膜完整，線粒體嵴結構清晰，連續(xù)性完整；急性肝衰竭大鼠肝細胞線粒體腫脹明顯，內(nèi)外膜連續(xù)性明顯被破壞，線粒體嵴斷裂且結構模糊；ACY1215干預組大鼠肝細胞線粒體腫脹較急性肝衰竭大鼠明顯減輕，內(nèi)外膜連續(xù)性較完整，線粒體嵴斷裂明顯減少，結構較清晰（圖2）。

圖2 各組大鼠肝組織超微結構的變化（1000×）

2.3 各組大鼠肝功能指標的變化 急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST和TBIL水平較正常組大鼠顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ACY1215 干預組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平較模型組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 1）。

表1 三組大鼠血清肝功能指標（±s）比較

表1 三組大鼠血清肝功能指標（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L）正常組 8 56.0±4.4 130.4±12.6 7.4±0.7模型組 8 5114.1±252.6① 2909.8±31.7① 97.6±1.4①干預組 8 799.4±11.2①② 401.0±5.6①② 28.0±1.2①②

表2 三組大鼠肝組織線粒體蛋白濃度和線粒體MPTP開放情況（±s）比較

表2 三組大鼠肝組織線粒體蛋白濃度和線粒體MPTP開放情況（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只數(shù) MPTP（RFU） 線粒體蛋白（mg/ml） MPTP校準（RFU/mgprot）正常組 8 796510.0±52067.5 5.2±0.5 156300.0±24043.3模型組 8 348580.0±55815.5① 3.6±0.5 96822.0±16733.1①干預組 8 551330.0±88355.3①② 4.3±0.4 127150.0±12337.6①②

2.4 各組大鼠肝組織線粒體蛋白濃度和線粒體MPTP開放情況比較 采用熒光酶標儀檢測肝臟線粒體MPTP RFU值，其值越低，表示MPTP開放程度越高。急性肝衰竭大鼠MPTP水平較正常組大鼠顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與急性肝衰竭模型組比，ACY1215干預組大鼠MPTP水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但仍低于正常組大鼠，差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 2）。

2.5 三組大鼠肝臟線粒體蛋白濃度和線粒體內(nèi)Cytc濃度比較 急性肝衰竭大鼠肝臟線粒體內(nèi)Cytc水平較正常大鼠顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與急性肝衰竭模型組比，ACY1215干預組大鼠肝臟線粒體內(nèi)Cytc含量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 3）。2.6 MPTP開放情況與線粒體內(nèi)Cytc含量相關性分析 線粒體內(nèi)的Cytc濃度變化與MPTP的開放程度呈負相關（r=0.603，P＜0.05），表明隨著線粒體MPTP開放增加，線粒體內(nèi)Cytc含量隨之減少。

表3 三組大鼠肝臟線粒體蛋白濃度和線粒體內(nèi)Cytc濃度（±s）比較

表3 三組大鼠肝臟線粒體蛋白濃度和線粒體內(nèi)Cytc濃度（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只數(shù) Cytc濃度（ng/ml） 線粒體蛋白（mg/ml） Cytc濃度校準（ng/mgprot）正常組 8 3.59±0.41 9.65±2.68 0.39±0.10模型組 8 1.05±0.29① 6.35±0.89 0.17±0.03①干預組 8 2.78±0.31①② 8.71±1.06 0.32±0.06②

3 討論

組蛋白去乙?；敢种苿┳鳛橐环N新興的抗腫瘤藥物，在該研究領域已取得顯著效果，特別是對多發(fā)性骨髓瘤、肺癌和肝癌等的治療方面[8～13]。早先有研究探討HDAC抑制劑TSA和MS-275對急性肝衰竭大鼠或小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)該類藥物可通過抑制相關炎癥因子的釋放等途徑，達到改善肝臟功能和組織學的改變。本實驗發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿〢CY1215對肝細胞具有保護作用，在形態(tài)學上觀察的表現(xiàn)比較明顯。電鏡觀察也證實對肝細胞的亞超微結構線粒體也可起到一定的保護作用。ACY1215干預的大鼠肝細胞線粒體腫脹情況及線粒體嵴損傷較急性肝衰竭組明顯減輕，并且在一定程度上保護內(nèi)外膜的完整性。作為線粒體功能障礙標志之一，伴隨著Cytc釋放入胞質，經(jīng)過一系列途徑激活Caspase-3，激活Caspase蛋白酶系統(tǒng)，已經(jīng)成為一種經(jīng)典的經(jīng)線粒體凋亡途徑[14，15]。Cytc作為線粒體呼吸鏈中不可缺少的電子傳遞體，其缺乏將影響線粒體能量的合成[16]。此外，在線粒體形態(tài)學改變的研究中，有報道稱MPTP狀態(tài)改變這一作用可使線粒體失極性以及氧化磷酸化解耦聯(lián)而表現(xiàn)為極度腫脹[17]。武磊[18]等在研究HDAC抑制劑對大鼠應激性心肌損傷的保護作用時，發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑TSA可以抑制以線粒體介導的細胞凋亡為特征的線粒體損傷[19，20]。

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（收稿：2017-03-20）

（本文編輯：陳從新）

Protective effect of histone deacetylase inhibitor ACY1215 on hepatocyte mitochondria in rats with acute hepatic failure

Chen Qian，Jiao Fangzhou，Zhang Haiyue，et al.Department of Infectious Disease，Renmin Hospital，Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei Province，China

ObjectiveTo investigate the protective mechanism of histone deacetylase inhibitor ACY1215 on liver mitochondrial damage in rats with acute hepatic failure（AHF）.Methods24 male SD rats were randomly divided into control group，model group and ACY1215-intervened group.Lipopolysaccharide （LPS） and D-galactosamine（D-Gal）were used to establish acute liver failure model in rats.The ACY1215 （10 mg·kg-1）was given 2 hours before the establishment of acute liver failure.Serum and liver samples of rats were obtained at end of 48 hours after AHF induction.The liver histological changes were observed by light and electron microscopy，and the mitochondria of hepatocytes were separated by gradient centrifugation.The relative fluorescence（RFU） of mitochondrialmembrane permeability transition porosity （MPTP） was tested by fluorescence spectrometry.The content of cytochrome C（Cytc）in mitochondria supernatants was determined by ELISA.The contents of serum ALT，AST and total bilirubin were detected by routine biochemical method.ResultsCompared with in the model group，the degree of liver histological damage was reduced in the ACY1215-intervened group，and the mitochondrial swelling of the hepatocytes was improved；serum ALT[（5114.1±252.6） U/L vs.（56.0±4.4）U/L]，AST[（2909.8±31.7）U/L vs.（130.4±12.6） U/L]and total bilirubin levels[（97.6±1.4） μmol/L vs. （7.4±0.7） μmol/L]in the model group were significantly higher than those in the control group（P<0.05），while they[（799.4±11.2）U/L，（401.0±5.6）U/L and （28.0±1.2）μmol/L，respectively]in the ACY1215-intervened group significantly decreases as compared to those in the model group （P<0.05）；the MPTP in acute liver failure model group was significantly higher than that in the normal control group[（968220.0±16733.1）RFU/mgprot vs.（156300.0±24043.3）RFU/mgprot，P<0.05）]，and also higher than in the ACY1215-intervened group[（127150.0±12337.6） RFU/mgprot，P<0.05]；the mitochondrial Cytc level in the model group was significantly lower than that in the control group [（0.17±0.03）ng/mgprot vs. （0.39±0.10）ng/mgprot，P<0.05]，and also lower than that in the ACY1215-intervened group[（0.32 ±0.06） ng/mgprot，P<0.05].ConclusionACY1215 has a protective effect on liver mitochondria in rats with acute hepatic failure，and the mechanism might be the inhibition of opening of mitochondrial MPTP in the livers and reduction of translocation of Cytc into the cytoplasm.

Acute hepatic failure；Mitochondria；Histone deacetylase inhibitor ACY1215；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.009

國家自然科學基金資助項目（編號：81371789)

430060武漢市 武漢大學人民醫(yī)院感染病科

陳倩，女，22歲，碩士研究生。主要從事病毒性肝炎防治研究。E-mail:1252191988@qq.com

龔作炯，E-mail：zjgong@163.com