王洪巖，遲 程，徐有青，李 鑫

·實驗性肝炎·

小檗堿對酒精性肝炎小鼠“腸漏”的保護(hù)作用*

王洪巖，遲 程，徐有青，李 鑫

目的探討小檗堿（BBR）對酒精性肝炎小鼠“腸漏”的保護(hù)作用。方法將40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、酒精組、BBR組和酒精聯(lián)合BBR組，飼養(yǎng)8 w。采用ELISA法檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和內(nèi)毒素（LPS）水平。常規(guī)行組織病理學(xué)和透射電鏡檢查肝組織學(xué)改變和腸上皮細(xì)胞間緊密連接（TJ）超微結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞Caco-2，采用免疫熒光法檢測經(jīng)酒精和BBR處理后的細(xì)胞間緊密連接主要結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)。結(jié)果酒精處理組小鼠血清ALT、AST和LPS水平分別為（46.5±5.9）U/L、（57.0±6.1）U/L和（0.40±0.05）ng/ml，顯著高于對照組（P＜0.01）；酒精聯(lián)合BBR組血清ALT、AST和LPS水平分別為（27.6±4.2）U/L、（31.8±4.1）U/L 和（0.24±0.03）ng/ml，均顯著低于酒精組（P＜0.05），而與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；酒精聯(lián)合BBR組肝組織細(xì)胞變性和炎細(xì)胞浸潤較酒精干預(yù)組明顯改善；電鏡下，可見酒精處理組小鼠腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)模糊、縫隙明顯增寬，酒精聯(lián)合BBR組以上改變明顯減輕；酒精處理組Caco-2細(xì)胞膜occludin分布減少、中斷，部分進(jìn)入胞漿內(nèi)，酒精聯(lián)合BBR組分布雖也減少，但仍連續(xù)，無中斷。結(jié)論小檗堿能改善慢性乙醇攝入誘導(dǎo)的細(xì)胞膜occludin減少和上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，改善“腸漏”而具有保護(hù)肝臟作用。

酒精性肝炎；小檗堿；腸漏；緊密連接；Occludin蛋白；小鼠

近年來，多項動物和臨床試驗研究均證實腸道高通透性，即“腸漏”導(dǎo)致的腸源性內(nèi)毒素血癥在酒精性肝病的發(fā)生及進(jìn)展過程中起重要作用[1，2]。到目前為止，臨床上還缺乏療效明確、安全性好和價格低廉的腸粘膜保護(hù)劑。小檗堿（berberine，BBR）具有抗炎、抑制腸上皮細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能，從理論上講有減輕“腸漏”的可能，且該藥作為治療感染性腸道疾病的常用藥物，已應(yīng)用于臨床多年，安全性好。國內(nèi)外關(guān)于小檗堿對酒精性肝炎個體“腸漏”的保護(hù)作用的研究報道仍然很少。本實驗檢測了酒精性肝炎小鼠腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白復(fù)合體（tight junction complex，TJ）和復(fù)合體主要構(gòu)成蛋白o(hù)ccludin的變化，探討了BBR對酒精性肝炎小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞、主要試劑及儀器 無特殊病原體（SPF）級雄性C57BL/6野生型小鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量24±2 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。Caco-2細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞庫。Lieber-Decarli飼料購自北京華阜康生物科技公司。BBR購自Sigma公司。檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的 ELISA 試劑盒購自美國R＆D公司，兔抗occludin單克隆抗體購自英國Abcam公司，多聚甲醛、石蠟、檸檬酸緩沖液和蘇木素等染色試劑及細(xì)胞免疫熒光試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。酶標(biāo)儀購自芬蘭Themo公司，使用北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科研究所TM-1000型透射電鏡（日本日立公司）和DMLI型倒置熒光顯微鏡（Leica公司）。

1.2 酒精性肝炎小鼠模型的建立 將40只小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、酒精組、BBR組和酒精聯(lián)合BBR組，每組10只，分別給予Lieber-DeCarli無酒精液體飼料、含5%酒精的Lieber-DeCarli液體飼料、小檗堿 25 mg·kg-1·d-1灌胃和酒精飼料中加入BBR喂養(yǎng)，連續(xù)8 w。在SPF級動物實驗室，飼養(yǎng)條件為室溫24±2℃、濕度40%～70%，人工日夜循環(huán)照明（照明時間為8:00 am～5:00 pm）。小鼠經(jīng) 2%戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟采血，在真空管（美國BD公司）中充分混勻，3000 r/m離心 5 min，-20℃保存。取肝組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。取結(jié)腸組織，經(jīng)2.5%戊二醛固定2 h，4℃；PBS緩沖液沖洗，10 min×3次；1%鋨酸固定2 h，4℃；雙蒸水沖洗，10 min×3次；50%、70%、90%酒精梯度脫水，各10 min，100%、100%酒精各 15 min。環(huán)氧丙烷置換 2 次，各 15 min，環(huán)氧丙烷：樹脂（1：1）室溫1 h，環(huán)氧丙烷：樹脂（1：4）室溫 1 h，純樹脂浸透室溫2 h。純樹脂包埋（EPON812）聚合35℃，16 h；45℃，8 h；55℃，14 h；60℃，48 h。修塊后半薄切片，天青-美蘭染色，光鏡下定位觀察。超薄切片，醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察、照相。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞Occludin表達(dá)檢測 取20～30代Caco-2細(xì)胞，用含有10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺、1 g/L丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)液，加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素常規(guī)培養(yǎng)。每7 d按1∶2傳代，傳代7 d后待細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)，分為4組，即對照組（磷酸鹽緩沖液）、乙醇組、BBR組和酒精聯(lián)合BBR組，分別給予以下四種條件培養(yǎng)48 h：磷酸鹽緩沖液、加入100 mmol/L酒精、BBR 2 μg/ml、BBR 2 μg/ml加入 100 mmol/L酒精。實驗重復(fù)3次。制備Caco-2細(xì)胞爬片，模擬腸上皮屏障：將玻片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔底，將Caco-2細(xì)胞懸液滴加到爬片上，混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞連接形成后用于后續(xù)實驗。將處理好的細(xì)胞爬片取出，用PBS緩沖液洗3次，×5 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液洗 3次，×5 min；0.3%Triton X100破膜15 min，PBS緩沖液洗3次，×5 min；3%BSA封閉液封閉；將BSA吸干，將經(jīng)PBS緩沖液稀釋的兔抗occludin（1:200）滴加到爬片上，放入濕盒，4℃冰箱過夜；次日，經(jīng)PBS緩沖液洗3次，×5 min，將FITC熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG用PBS緩沖液稀釋后滴加到爬片上，避光室溫孵育1 h，PBS緩沖液洗3次，×5min；最后，用含有DAPI的封片劑封片，避光4℃保存，在熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.4 血清ALT、AST和LPS測定 采用相關(guān)試劑盒檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，計量資料以（±s）表示，采用成組資料的t檢驗，多組間比較采用LSD法單因素方差分析，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酒精性肝炎小鼠模型的建立情況 在動物造模8 w末，對照組、酒精組、BBR組和酒精聯(lián)合BBR組小鼠體質(zhì)量分別為 （24.7±1.7）g、（28.0±1.9）g、（27.5±1.7）g、（26.9±1.6）g。對照組和 BBR 組小鼠靈活好動，皮毛整潔，體質(zhì)量逐漸增加；乙醇組小鼠皮毛凌亂，無光澤，體質(zhì)量增加緩慢，易激惹；酒精聯(lián)合BBR組動物毛發(fā)、體質(zhì)量和易激惹行為較酒精組改善。

2.2 血清學(xué)指標(biāo)比較 在8 w末，酒精組小鼠血清ALT、AST和LPS水平比對照組顯著升高（P＜0.01），BBR組與對照組小鼠血清學(xué)指標(biāo)無明顯差別，酒精聯(lián)合BBR組血清ALT和LPS水平與對照組無顯著性差別，血清ALT、AST和LPS水平較酒精組顯著降低（P＜0.05，表 1）。

表1 各組小鼠血清ALT、AST和LPS水平（±s）比較

表1 各組小鼠血清ALT、AST和LPS水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與酒精組比，②P＜0.05

只數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） LPS（ng/ml）對照組 10 22.9±2.4 24.3±3.3 0.21±0.03酒精組 10 46.5±5.9① 57.0±6.1① 0.40±0.05①BBR 組 10 21.0±2.7 25.2±3.6 0.20±0.04酒精聯(lián)合BBR 10 27.6±4.2② 31.8±4.1② 0.24±0.03②

2.3 肝組織學(xué)表現(xiàn)情況 酒精組動物肝組織內(nèi)可見肝細(xì)胞索排列紊亂，細(xì)胞脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤，可見細(xì)胞氣球樣變；對照組和BBR組動物肝組織肝小葉形態(tài)正常；酒精聯(lián)合BBR組動物肝組織可見部分肝細(xì)胞脂肪變性及少量炎細(xì)胞浸潤，但未見細(xì)胞氣球樣變，肝細(xì)胞排列尚整齊，其肝細(xì)胞變性及炎細(xì)胞浸潤程度較酒精組明顯改善（圖1）。

圖1 四組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，40×）

圖2 四組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)的變化（6000×）

2.4 結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)的變化 酒精組動物結(jié)腸上皮細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)模糊，縫隙明顯增寬；對照組和BBR組動物結(jié)腸上皮細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)清晰，縫隙緊密；酒精聯(lián)合BBR組TJ略模糊，縫隙稍寬，但增寬程度較酒精組明顯減輕（圖2）。

2.5 Caco-2細(xì)胞Occludin表達(dá)情況 經(jīng)免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，可見對照組和BBR組Caco-2細(xì)胞Occludin綠色熒光呈線性分布，清晰連續(xù)無中斷；酒精組Occludin綠色熒光分布紊亂，堆積成點片狀，部分從細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿內(nèi)；酒精聯(lián)合BBR組綠色熒光可見點狀堆積，部分進(jìn)入細(xì)胞胞漿內(nèi)，但TJ處綠色熒光分布連續(xù)無中斷（圖 3）。

圖3 四組Caco-2細(xì)胞緊密連接處Occludin表達(dá)情況 Occludin蛋白呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光

3 討論

本研究采用Liber-Decarli喂養(yǎng)方法構(gòu)建酒精性肝炎小鼠模型，造模8周后，酒精組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯升高，肝組織符合酒精性肝炎表現(xiàn)，說明模型構(gòu)建成功。

酒精性肝病發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，慢性酒精攝入是發(fā)病基礎(chǔ)，乙醇代謝產(chǎn)物對肝細(xì)胞的直接損傷、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、營養(yǎng)失調(diào)、鐵沉積、鋅缺乏等因素均參與了其發(fā)病過程[3-6]。近年來，國內(nèi)外研究均顯示：腸上皮細(xì)胞間高通透性導(dǎo)致的“腸漏”可使腸道LPS經(jīng)血入門靜脈到達(dá)肝臟，進(jìn)而引起肝臟炎性表現(xiàn)[7,8]。腸上皮屏障是由腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接組成的，而Occludin蛋白定位于腸上皮細(xì)胞膜表面，是細(xì)胞間TJ的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其結(jié)構(gòu)破壞或構(gòu)型改變均可導(dǎo)致其在細(xì)胞膜分布減少。有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中，Occludin缺乏可引起酒精相關(guān)性腸道屏障功能失調(diào)及肝臟受損[9]。我們既往研究已發(fā)現(xiàn)慢性乙醇刺激誘發(fā)了腸上皮細(xì)胞TLR4大量表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞間TJ主要構(gòu)成蛋白o(hù)ccludin構(gòu)型改變，在細(xì)胞膜分布減少，細(xì)胞間通透性增加[10，11]。本研究亦發(fā)現(xiàn)酒精處理組動物血清LPS水平顯著高于對照組。掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠腸上皮細(xì)胞間TJ被破壞，邊界不清、寬度增加。為進(jìn)一步觀察TJ處Occludin的表達(dá)情況，我們在Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)基中加入低濃度酒精共培養(yǎng)48小時，結(jié)果見Occludin綠色熒光分布紊亂、細(xì)胞間分布減少，部分進(jìn)入胞漿內(nèi)，說明慢性酒精刺激通過減少Occludin的表達(dá)，破壞細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞間通透性增加。

BBR又名黃連素，是從植物黃連的根莖中提取出的主要成分，是一種異喹啉類生物堿[12，13]。從上世紀(jì)初，BBR被分離純化以后，在臨床廣泛應(yīng)用于治療感染性腹瀉、細(xì)菌性痢疾等感染性腸道疾病。近期研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎、調(diào)脂和抗腫瘤作用而對炎癥性腸病、非酒精性脂肪性肝病和結(jié)直腸癌等均有保護(hù)作用[14-16]。長期臨床應(yīng)用實踐表明，BBR是一種無細(xì)胞毒、無致突變作用的藥物，具有不良反應(yīng)小、價格低廉等優(yōu)點。

BBR的抗炎、抑制腸道腺體分泌的藥理作用已很明確。最新的動物研究結(jié)果顯示，小檗堿經(jīng)口服吸收，能緩解腸粘膜炎性反應(yīng)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的腸上皮細(xì)胞凋亡，從而減輕放療、短期內(nèi)酗酒和葡聚糖硫酸鈉引起的腸黏膜損傷[17，18]。Chu M et al[19]還發(fā)現(xiàn)BBR作為LPS的拮抗劑能阻斷LPS/TLR4信號通路。為了研究BBR對慢性飲酒相關(guān)性“腸漏”是否有保護(hù)作用，本實驗檢測了BBR對酒精性肝炎小鼠腸上皮細(xì)胞間TJ、Occludin和肝臟形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒精聯(lián)合BBR組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變明顯改善。酒精聯(lián)合BBR組小鼠血清LPS水平較酒精組降低，提示BBR能改善腸道通透性。在電鏡下，可見酒精聯(lián)合BBR組小腸粘膜緊密連接較對照組略顯松散，寬度增加，但損傷程度較酒精組明顯減輕。酒精處理Caco-2細(xì)胞經(jīng)加入BBR共培養(yǎng)后，細(xì)胞膜表面Occludin表達(dá)較單純酒精組增加。以上結(jié)果提示小檗堿可通過增加TJ主要結(jié)構(gòu)蛋白Occludin的表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞間緊密連接，從而改善慢性酒精攝入引起的腸上皮細(xì)胞間高通透性。

綜上所述，酒精性肝炎伴發(fā)“腸漏”和LPS血癥。慢性乙醇刺激減弱了腸上皮細(xì)胞Occludin蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而導(dǎo)致“腸漏”。BBR通過增加細(xì)胞膜Occludin表達(dá)穩(wěn)定TJ結(jié)構(gòu)，起到保護(hù)腸粘膜屏障、減輕肝損傷的作用。有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿口服生物利用度低[20]，因此，如何提高其吸收，以便用于酒精性肝病患者肝腸損害的預(yù)防或治療。

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（收稿：2016-11-30）

（本文編輯：陳從新）

Protective effect of berberine on intestinal leak in mice with alcoholic hepatitis

Wang Hongyan，Chi Cheng，Xu Youqing，et al.Medical Examination Center，Second Affiliated Hospital，Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang Province，China

Alcoholic hepatitis；Berberine；Intestinal leak；Tight junction；Occludin；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.007

北京市自然科學(xué)基金資助項目(編號：7154194）；國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81570536）

150086哈爾濱市 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心（王洪巖）；北京市首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科（李鑫，遲程，徐有青）

王洪巖,女，31歲，醫(yī)學(xué)博士，住院醫(yī)師。主要從事酒精性肝病的防治研究。E-mail:xinglin_freedom@126.com

李鑫，E-mail:lixinqingzhou@163.com

【Abstrat】ObjectiveTo explore the protective effect of berberine on intestinal leak in mice with alcoholic hepatitis.MethodsForty male C57BL/6 mice were randomly divided into control，alcohol，berberine and alcohol plus berberine group with 10 animals in each.Mice were fed with alcohol or vehicle for 8 weeks and all were sacrificed.Serum alanine aminotransferas （ALT），aspartate aminotransferase（AST） and lipopolysaccharide（LPS）were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The pathologic changes of liver tissues were assessed by HE staining，and the ultrastructures of tight junction （TJ） complex was observed by transmission electron microscope. In vitro，occludin，the main structural protein of intercellular TJ，was detected by immunofluorescence in intestinal epithelial Caco-2 cells，which were cultured with ethanol（EtOH），BBR and EtOH plus BBR respectively.ResultsSerum ALT，AST and LPS levels in alcohol group were（46.5±5.9）U/L，（57.0±6.1）U/L and（0.40±0.05）ng/ml，respectively，significantly higher than those in control group （P<0.01）；There was no significant difference between alcohol plus BBR group and control group；Serum ALT，AST and LPS levels in alcohol plus BBR group were （27.6±4.2） U/L，（31.8±4.1） U/L and （0.24±0.03） ng/ml，respectively，significantly lower than those in alcohol group （P<0.05）；The histopathologic examination of liver tissues showed alcoholic hepatitis in alcohol group，and it was alleviated as respect to steatosis and inflammatory cell infiltration in alcohol plus BBR group；Electron micrographs showed that the TJ structures between intestinal epithelial cells were fuzzy and the gaps were expanded obviously in alcohol group，and all of these were improved obviously in alcohol plus BBR group；Immunofluorescence indicated thatthe occludin on Caco-2 cellmembraneswere decreased，interrupted and partly entered into cytoplasm in alcohol group，while in alcohol plus BBR group，the distribution of occludin was decreased，though，butwas continuous.ConclusionBerberine improves the decrease in occludin expression on cell membranes and the disruption of TJ structures between intestinal epithelial cells induced by chronic ethanol intake and alleviates intestinal leak.