劉 勇 ，劉 燕 ，楊 丹 ，梁 清 ，婁 杰

三葉草（Trifolium repens）用于土壤鎘污染的修復(fù)潛力

劉 勇1，2，3，劉 燕1*，楊 丹1，梁 清1，婁 杰1

（1.貴陽(yáng)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550005；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所環(huán)境地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550002）

通過溫室盆栽試驗(yàn)法，研究了土壤鎘（Cd）污染下三葉草對(duì)土壤Cd的富集特征及土壤Cd的凈化能力等，以期為三葉草對(duì)土壤Cd的生態(tài)修復(fù)提供依據(jù)。結(jié)果表明：三葉草具有較好的Cd耐受性，總生物量增加值介于2.0～3.7 g。隨著土壤Cd處理濃度增加，三葉草根、莖、葉中 Cd 含量分別高達(dá) 178.6、101.3、130.9 mg·kg-1，富集系數(shù)（BF）分別介于 9.7～17.9、3.0～10.1、3.1～13.1，富集能力大小總體表現(xiàn)為根>葉>莖，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）值均≥1（除T2處理），表明三葉草有較強(qiáng)的Cd富集能力，且能較好地將Cd轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部位；三葉草根、莖、葉對(duì)Cd的吸收量均隨著土壤Cd處理濃度的升高而遞增，地上部位（莖、葉）吸Cd百分率（占總吸Cd量）最高達(dá)87.2%，對(duì)土壤Cd凈化率最高達(dá)6.2%。因此得出三葉草具有作為Cd超積累植物的較好潛力，可以進(jìn)行污染區(qū)域美化改造和Cd污染修復(fù)。

Cd污染；土壤；修復(fù)潛力；三葉草

目前，重金屬污染是全球面臨的重大環(huán)境污染問題之一[1]。其中鎘（Cd）作為一種重要的重金屬材料，廣泛應(yīng)用于電鍍、冶煉、采礦、顏料以及電池等工業(yè)領(lǐng)域[2]。同時(shí)，Cd又屬于劇毒重金屬元素，在環(huán)境中活性強(qiáng)，易進(jìn)入食物鏈，可在人體肝、腎及骨骼等組織中積累從而造成嚴(yán)重?fù)p傷[3-4]。近年來(lái)隨著Cd工業(yè)發(fā)展，Cd環(huán)境污染問題備受關(guān)注[5-6]。2014年公布的全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)土壤中Cd污染的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7.0%，在無(wú)機(jī)污染物中最高[7]。土壤重金屬植物修復(fù)具有高效環(huán)保、投資較少、應(yīng)用潛力大等特點(diǎn)，是目前不斷發(fā)展研究的重金屬修復(fù)方法之一[8-9]。其中篩選出具有對(duì)重金屬元素富集能力強(qiáng)的超積累植物是研究的熱點(diǎn)[10-12]。

三葉草（Trifolium repens）為多年生草本，豆科、車軸草屬，具有抗寒耐熱、固氮能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、壽命長(zhǎng)、酸堿性土壤上均適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是常見的堤岸斜坡防護(hù)及草坪裝飾草種，具有保持水土的作用，也可以作為綠肥或優(yōu)良牧草等[13-16]。近年來(lái)研究表明，三葉草在大氣污染監(jiān)測(cè)以及重金屬環(huán)境修復(fù)等方面是理想的種質(zhì)資源[17-18]。將三葉草用于土壤Cd污染修復(fù)，可以起到環(huán)境美化、水土保持和Cd污染修復(fù)等多重作用。已有研究表明，三葉草在水培條件下對(duì)Cd脅迫具有一定耐受性，并表現(xiàn)出富集植物的特性[19]。三葉草與禾本科植物協(xié)同修復(fù)Cd的效果較好，以及AM菌對(duì)三葉草富集Cd具有明顯影響[20-21]，但將其單獨(dú)用作土壤Cd的修復(fù)研究比較少。本文以三葉草為研究對(duì)象，進(jìn)行溫室盆栽實(shí)驗(yàn)，參考國(guó)家菜地土壤環(huán)境質(zhì)量二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Cd≤0.4 mg·kg-1（GB 15618—2008），人工模擬土壤Cd污染環(huán)境，研究三葉草對(duì)土壤Cd富集特征以及土壤Cd凈化能力等，以期為土壤Cd生態(tài)修復(fù)的超積累植物篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

三葉草：2015年10月采集于校園周邊無(wú)污染綠地，選取生長(zhǎng)旺盛且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的三葉草植株。

盆栽土壤：2015年10月采集于貴陽(yáng)市某有機(jī)蔬菜基地的沙壤土，將土壤晾干、篩除異物、磨碎、過2 mm篩。少量土壤用瑪瑙研缽研磨，過200目篩，測(cè)定土壤部分理化參數(shù)：pH值為7.1，有機(jī)質(zhì)為7.6%，速效氮為 67.3 mg·kg-1，速效磷為 76.8 mg·kg-1，速效鉀為 57.2 mg·kg-1，總鎘為 0.017 mg·kg-1。表明土壤肥力較好且無(wú)Cd污染。

1.2 試驗(yàn)方法

含Cd土壤配制及植物盆栽：2015年10月采用溫室（22～26℃）盆栽土培法，將事先處理好的土壤放入15 cm×12 cm的塑料花盆中，每盆裝土1.0 kg。采用CdCl2·2.5H2O（AR），準(zhǔn)確計(jì)算和配制 Cd2+溶液，并緩慢均勻注入盆栽土（避免Cd不均勻和溶液過剩漏出花盆），充分?jǐn)嚢?，使土?Cd 濃度分別為：0、3、5、7、10 mg·kg-15 個(gè)處理水平（分別記為 T1、T2、T3、T4、T5），每個(gè)處理3次重復(fù)。模擬Cd污染土壤平衡2周后進(jìn)行三葉草移栽，確保每盆三葉草長(zhǎng)勢(shì)、株數(shù)（5株）及鮮重（稱量記錄）一致，連續(xù)培養(yǎng)45 d。定期澆水，含水率保持在75%，嚴(yán)格防止從花盆底座流出造成Cd流失。45 d后整株收獲，清洗、晾干、稱鮮重，并用剪刀將其分割為根、莖、葉，并稱鮮重，然后105℃殺青30 min，60℃烘干至恒重，稱干重，于自封袋保存?zhèn)溆?。同時(shí)，采集盆中根際土壤25 g，測(cè)定培養(yǎng)后土壤中Cd，即土壤Cd殘留量，該土壤經(jīng)風(fēng)干、研磨、過200目篩后，一并于自封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品中Cd含量測(cè)定：采用電熱板加熱，HCl-HNO3-HClO4法消解植物和土壤樣品[22]，采用島津AA-7000型石墨爐原子吸收儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用最小顯著性差異檢驗(yàn)（LSD法）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Sigmaplot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉草生物量變化及外觀特征

經(jīng)過45 d培養(yǎng)后，不同Cd處理水平下，三葉草生長(zhǎng)均良好，未出現(xiàn)明顯毒害現(xiàn)象，其生物量均有所增加（圖1A），且隨著Cd濃度升高，整株生物量增加值分別達(dá) 4.8、2.0、3.3、3.7 g 和 2.7 g（表 1），表明三葉草具有一定土壤Cd耐受性。如圖1所示，培養(yǎng)后不同Cd處理下三葉草根、莖、葉各部位鮮重、干重?zé)o明顯變化，但三葉草整株總生物量增加值均顯著低于T1組（P<0.05），表明Cd對(duì)三葉草生長(zhǎng)均有一定抑制作用。不同Cd處理下三葉草整株及根、莖、葉不同部位含水率分別介于77.4%～77.7%、63.3%～64.2%、76.9%～77.9%、82.4%～85.6%，均小于T1組，且總體上隨著Cd濃度升高而含水率逐漸降低（表1），表明Cd對(duì)三葉草內(nèi)部水分有一定影響，進(jìn)而很可能影響其生物量變化。

2.2 三葉草各部位對(duì)Cd富集特征

圖1 不同Cd處理三葉草整株及各部位生物量變化Figure 1 Biomass of different parts of Trifolium repens in different Cd concentration

表1 不同Cd處理三葉草培養(yǎng)前后整株鮮重差及各部位含水率Table 1 Biomass variation and moisture content of Trifolium repens in different Cd concentration

隨著土壤中Cd濃度的升高，三葉草根、莖、葉（均以干重計(jì)算）中Cd含量均呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì)，不同Cd處理下根中Cd含量介于29.3～178.6 mg·kg-1（P<0.05）；莖中Cd含量為9.1～101.3 mg·kg-1（P<0.05）；葉中Cd含量為9.2～130.9 mg·kg-1（P<0.05）（圖2）。當(dāng)土壤中Cd投加濃度為10 mg·kg-1時(shí)，三葉草根、莖、葉中Cd含量均超過100 mg·kg-1這一Cd超積累植物臨界含量標(biāo)準(zhǔn)[23-24]。相同Cd處理下，三葉草各部位Cd含量表現(xiàn)為根>葉>莖，表明三葉草根對(duì)Cd富集作用最強(qiáng)、葉次之，莖相對(duì)較弱。由表2可知，三葉草根、莖、葉中Cd含量高低均與土壤Cd濃度具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.971、0.936、0.928，達(dá)到極顯著水平（P<0.01），表明三葉草具有富集更多土壤Cd的可能性。綜合2.1、2.2數(shù)據(jù)，表明三葉草作為地被植物適宜在Cd污染土壤環(huán)境下生長(zhǎng)，可用于污染區(qū)域美化改造和土壤Cd污染修復(fù)。

2.3 三葉草各部位對(duì)Cd吸收量及土壤Cd殘留量、Cd凈化率

重金屬吸收量是用以評(píng)價(jià)植物修復(fù)重金屬污染土壤潛力的重要指標(biāo)之一（重金屬吸收量=植物重金屬含量×生物量）[25-26]。由表3可知，三葉草整株及不同部位對(duì)Cd的吸收量均隨著Cd濃度升高總體呈遞增趨勢(shì)。相同Cd處理下，莖吸收量最大，根次之，葉最小（除T5處理水平下根<葉），這主要與莖生物量值相對(duì)較高有關(guān)。隨著Cd濃度升高，三葉草地上部位吸Cd（占三葉草總吸Cd量）百分率分別高達(dá)68.3%、71.8%、79.3%、87.2%，呈不斷增加趨勢(shì)。通過計(jì)算三葉草對(duì)Cd凈化率和土壤Cd殘留量表明，土壤總Cd殘留量均有所減小，凈化率隨著土壤中Cd投加濃度的升高而提高，介于1.9%～6.2%（均值約4.2%），也進(jìn)一步表明三葉草具有在更高的Cd濃度土壤下富集更多Cd的潛力。

圖2 不同Cd處理三葉草各部位Cd含量Figure 2 Cd contents enriched by different parts of Trifolium repens in different Cd concentration

表2 不同Cd處理三葉草各部位Cd含量的曲線擬合模型Table 2 Accumulating models of Cd in Trifolium repens in different Cd concentration

2.4 富集系數(shù)（BF）與轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）

富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是衡量植物積累重金屬能力大小的重要指標(biāo)，分別表征植物各部位對(duì)重金屬的富集能力和重金屬由地下部分（根）向地上部分（莖、葉等）的遷移能力[27]。由表4可知，不同Cd處理水平，三葉草根對(duì)Cd的BF值分別高達(dá)9.8、13.0、16.8、17.9（P<0.05），莖對(duì) Cd 的 BF 值分別達(dá) 3.0、5.9、8.9、10.1（P<0.05），葉對(duì) Cd 的 BF 值分別達(dá) 3.1、7.4、12.4、13.1（P<0.05），且Cd濃度越高，各部位對(duì)Cd的BF值遞增越明顯，BF值間均差異顯著（除Cd濃度為7 mg·kg-1和10 mg·kg-1時(shí)，葉對(duì)Cd的BF值相近）。結(jié)合前人研究[23-24]，植物地上部分對(duì)重金屬的BF值大于1是重金屬超積累植物區(qū)別于普通植物的一個(gè)重要特征，表明在土壤Cd污染下三葉草具有作為Cd超積累植物的潛力，且隨著Cd濃度增加，其積累Cd能力更強(qiáng)。不同Cd濃度下三葉草對(duì)Cd的TF值分別為0.6、1.0、1.3、1.3，除 T2處理之外，TF 值均≥1，表明 Cd污染土壤環(huán)境中，三葉草能將Cd從根較好地轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部位，且轉(zhuǎn)運(yùn)能力隨Cd濃度升高逐漸增強(qiáng)。

2.5 三葉草各部位對(duì)Cd富集的相關(guān)性

由表5可知，相同Cd處理水平下，對(duì)三葉草根、莖、葉的Cd富集特征進(jìn)行相關(guān)性分析表明，三葉草不同部位對(duì)Cd的富集特征具有極顯著相關(guān)性（P<0.01），相關(guān)系數(shù)達(dá)0.992～0.996，反映了其不同部位對(duì)Cd的富集特性存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，即隨著Cd濃度升高三葉草根、莖、葉中富集的Cd量均同時(shí)增加，土壤中Cd進(jìn)入植物后由根至莖最后至葉等的遷移性較好。

表4 不同Cd處理三葉草對(duì)Cd的BF值、TF值Table 4 The BF and TF values of Trifolium repens in different Cd concentration

3 討論

目前，Cd超積累植物篩選是土壤Cd污染修復(fù)領(lǐng)域重要的基礎(chǔ)內(nèi)容之一。Cd超積累植物的篩選標(biāo)準(zhǔn)一般如下：（1）植物對(duì)Cd的富集臨界含量達(dá)到100.0 mg·kg-1；（2）植物對(duì) Cd 富集系數(shù) BF 值大于 1；（3）植物對(duì)Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)TF值大于1。然而現(xiàn)實(shí)中同時(shí)具備上述標(biāo)準(zhǔn)的植物很少，這是Cd超積累植物發(fā)現(xiàn)較少的重要原因[28-29]。三葉草生長(zhǎng)繁衍快速、抗逆性比較強(qiáng)，且其水土保持和環(huán)境美化功能較為明顯，而自然環(huán)境中重金屬污染區(qū)往往重金屬含量高、pH值較低且大多貧瘠荒涼。本研究表明三葉草在高達(dá)10 mg·kg-1的重度Cd污染土壤環(huán)境下仍生長(zhǎng)較好或受到Cd的抑制作用較小，體現(xiàn)出其較強(qiáng)的Cd污染環(huán)境抗逆性，并且該濃度下三葉草根、莖、葉中Cd含量均大于 100 mg·kg-1，BF 值、TF 值均遠(yuǎn)大于 1，因此根據(jù)本研究結(jié)果，三葉草在土壤高濃度Cd污染下具備Cd超積累植物的篩選條件。

表5 三葉草不同部位對(duì)Cd富集的相關(guān)性Table 5 The correlation for Cd among different parts of Trifolium repens

表3 不同Cd處理三葉草各部位對(duì)Cd吸收量及土壤Cd殘留量、Cd凈化率（均以干重計(jì)算）Table 3 The Cd uptake of different parts of Trifolium repens，the residual amount and the purifying rate of Cd of the soils in different Cd concentration

另外，研究表明植物對(duì)重金屬的富集特征同時(shí)與植物種類、重金屬元素價(jià)態(tài)、物質(zhì)結(jié)構(gòu)及其環(huán)境中類元素共存離子濃度以及溶解度等均有關(guān)[29]。同時(shí)，Liu 等[30]、Tang 等[31]、任珺等[32]研究表明環(huán)境中重金屬濃度的高低是影響植物中重金屬富集量的主要因素，即部分植物富集重金屬量要達(dá)到臨界值，其生長(zhǎng)環(huán)境中重金屬濃度需達(dá)到一定量。本研究中三葉草根、莖、葉中Cd含量與土壤Cd濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性，表明其具有富集更多土壤中Cd的潛力，也反映了其生長(zhǎng)環(huán)境介質(zhì)內(nèi)Cd濃度是影響三葉草中Cd富集量的重要因素。本研究中三葉草對(duì)Cd的BF值遠(yuǎn)高于同樣Cd濃度下楊艷等[33]對(duì)頭花蓼、王友保等[34]對(duì)吊蘭、牛之欣等[35]對(duì)紫花苜蓿等的相關(guān)研究，表明三葉草在富集土壤Cd中具有較大優(yōu)勢(shì)。三葉草雖整株生物量相對(duì)較小，使得其存在一定修復(fù)局限性，但其繁殖能力強(qiáng)且地上部分吸Cd量占總吸Cd量的68.3%～87.2%，高于楊艷等[33]對(duì)蓼科植物頭花蓼富集Cd的相關(guān)研究（59.3%～65.1%），略低于蘇德純等[36]對(duì)Cd的超積累植物印度芥菜的相關(guān)研究（≥87.0%），表明三葉草在原位Cd修復(fù)的后續(xù)（如收割等）處理等過程也存在優(yōu)勢(shì)。三葉草的Cd凈化率均值約為4.2%，甚至略高于印度芥菜、油菜溪口花籽對(duì)Cd的凈化率值（分別為2.5%～3.3%、3.5%～3.9%），表明其在實(shí)踐中具有一定應(yīng)用潛力[36]。

4 結(jié)論與展望

4.1 結(jié)論

（1）三葉草總生物量隨著Cd濃度升高，其增加量介于2.0～3.7 g（略低于對(duì)照組），表明三葉草具有Cd耐受性，但同時(shí)Cd對(duì)其生長(zhǎng)有輕微抑制作用。不同部位含水率均隨著Cd濃度升高而逐漸降低，表明Cd對(duì)三葉草內(nèi)部水分產(chǎn)生影響，進(jìn)而很可能影響其生物量變化。

（2）三葉草根、莖、葉均對(duì)Cd有較好富集性，均隨著Cd濃度升高而富集作用更強(qiáng)，分別高達(dá)178.6、101.3、130.9 mg·kg-1，其 BF 值分別介于 9.7～17.9、3.0～10.1、3.1～13.1，富集能力大小表現(xiàn)為根>葉>莖。三葉草對(duì)Cd的TF值均≥1（除T2處理），表明三葉草能較好地將Cd轉(zhuǎn)移至地上部位，且轉(zhuǎn)移能力隨Cd濃度升高逐漸增強(qiáng)。

（3）三葉草整株及根、莖、葉各部位對(duì)盆栽土Cd吸收量均隨著Cd濃度增加而遞增，其中地上部位（莖、葉）吸Cd百分率最高達(dá)87.2%。三葉草對(duì)Cd凈化率隨著Cd處理水平增加而提高，凈化率最高達(dá)6.2%。

綜上，三葉草具有作為超積累植物的較好潛力，可以作為良好的備選種質(zhì)資源，同時(shí)可兼具Cd污染區(qū)域環(huán)境美化改造和污染修復(fù)。

4.2 展望

（1）本研究參考國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（Cd≤0.4 mg·kg-1）（GB 15618—2008），進(jìn)行 Cd 污染模擬，尚未得出三葉草根、莖、葉不同部位對(duì)Cd的富集臨界值等，下一步工作可模擬更高Cd污染環(huán)境研究三葉草生理指標(biāo)變化以及對(duì)Cd富集特征。

（2）土壤Cd以不同形態(tài)存在，其中有效態(tài)Cd通常對(duì)環(huán)境危害性較大，且能被植物等吸收利用。同時(shí)，土壤Cd形態(tài)與土壤pH值存在一定關(guān)系，因此對(duì)土壤Cd形態(tài)進(jìn)行分級(jí)提取，以及Cd形態(tài)之間轉(zhuǎn)化與土壤pH值等參數(shù)的關(guān)系應(yīng)做更為系統(tǒng)研究。

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Remediation potential of Trifolium repens used in cadmium-contaminated soils

LIU Yong1,2,3,LIU Yan1*,YANG Dan1,LIANG Qing1,LOU Jie1
（1.School of Biological and Environmental Engineering,Guiyang University,Guiyang 550005,China;2.University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China;3.State Key Laboratory of Environmental Geochemistry,Institute of Geochemistry Chinese Academy of Sciences,Guiyang 550002,China）

In this study,the enrichment characteristics and purification capacity of Trifolium repens for cadmium in soil were investigated in order to provide a reference for ecological restoration of cadmium.The results showed that the added value of T.repens biomass reached 2.0～3.7 g,indicating that T.repens could have a high tolerance for cadmium.Cadmium accumulation in the roots,stems,and leaves of T.repens reached 178.6,101.3 mg·kg-1,and 130.9 mg·kg-1,respectively,as the concentration of cadmium increased.The bioaccumulation factor values of the roots,stems,and leaves were 9.7～17.9,3.0～10.1,and 3.1～13.1,respectively,and the ability of cadmium to accumulate in different parts of T.repens was decreased in the order of roots>leaves>stems.The translocation factor values for cadmium in T.repens were all greater than 1 （except T2 treatment）.These data indicated that T.repens could have a strong capacity for cadmium enrichment and could easily transport cadmium into the soil.The amount of cadmium uptake of T.repens increased diversely with the different cadmium treatments in soils;in particular,the cadmium uptake of the aboveground parts（stems and leaves）of T.repens reached 87.2%,and the purifying rate of cadmium in soils was as high as 6.2%.Based on these findings,T.repens was found to have promising applications in beautifying surroundings and repairing cadmium-contaminated soils.

cadmium pollution;soil;remediation potential;Trifolium repens

X53

A

1672-2043（2017）11-2226-07

10.11654/jaes.2017-0518

劉 勇，劉 燕，楊 丹，等.三葉草（Trifolium repens）用于土壤鎘污染的修復(fù)潛力[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（11）：2226-2232.

LIU Yong,LIU Yan,YANG Dan,et al.Remediation potential of Trifolium repens used in cadmium-contaminated soils[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）:2226-2232.

2017－04－10 錄用日期：2017－06－21

劉 勇（1987—），男，甘肅平?jīng)鋈?，講師，從事環(huán)境生態(tài)與污染防治研究。E-mail：lyong821mmm@163.com

* 通信作者：劉 燕 E－mail：gyly68＠sina．com

貴州省科學(xué)技術(shù)廳自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項(xiàng)目（黔科合LH字[2014]7168號(hào)，LKG[2013]23號(hào)）；貴州省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重大項(xiàng)目（黔科合J重大字[2015]2001號(hào)）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃平臺(tái)項(xiàng)目（201510976051）

Project supported：The Joint Funds of the Natural Science Foundation of Science and Technology Department of Guizhou Province，China（LH[2014]7168，LKG[2013]23）；Project Supported by the Major Program for the Applied Basic Research of Guizhou Province，China（[2015]2001）；The Project of National Students′Platform for Innovation and Entrepreneurship Training Program（201510976051）