陳育鵬+趙倩+王貴金+張水英+畢丹

摘要：目的 研究并建立連花清瘟膠囊指紋圖譜。方法 采用超高效液相色譜法（UPLC），色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 ?m，2.1 mm×100 mm），以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為239 nm，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃。結(jié)果 建立連花清瘟膠囊指紋圖譜，共標(biāo)定了32個共有峰，指認(rèn)了其中9個共有峰，分別為新綠原酸（4號峰，來源于金銀花和魚腥草）、綠原酸（6號峰，來源于連翹、金銀花和魚腥草）、隱綠原酸（8號峰，來源于金銀花和魚腥草）、異連翹酯苷A（15號峰，來源于連翹）、連翹酯苷A（20號峰，來源于連翹）、槲皮苷（23號峰，來源于魚腥草）、異綠原酸C（24號峰，來源于金銀花）、連翹苷（26號峰，來源于連翹）、甘草酸（31號峰，來源于甘草），10批連花清瘟膠囊指紋圖譜的相似度均大于0.96。結(jié)論 本研究建立的方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為控制連花清瘟膠囊的質(zhì)量提供了新方法。

關(guān)鍵詞：連花清瘟膠囊；超高效液相色譜法；指紋圖譜

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.019

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0077-04

Study on UPLC Fingerprints of Lianhua Qingwen Capsules CHEN Yu-peng1，2， ZHAO Qian1，2， WANG Gui-jin3， ZHANG Shui-ying1，2， BI Dan1，2 （1. Hebei Province Institute of Integrated Traditional and Western Medicine， Shijiazhuang 050035， China； 2. Beijing Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Beijing 102600， China； 3. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Shijiazhuang 050035， China）

Abstract： Objective To study and establish the UPLC fingerprints of Lianhua Qingwen Capsules. Methods The samples were separated with a Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column （100 mm × 2.1 mm， 1.8 ?m） by linear gradient elution. The wavelength for detection was set at 239 nm； mobile phase was set at a ?ow rate of 0.3 mL/min； the column temperature was set at 30 ℃. Results UPLC fingerprints of Lianhua Qingwen Capsules were established with 32 common peaks. 9 of 32 common peaks were identified， including neochlorogenic acid （peak No.4， source from Lonicerae Japonicae Flos and Houttuyniae Herba）， chlorogenic acid （peak No.6， source from Forsythiae Fructus， Lonicerae Japonicae Flos and Houttuyniae Herba）， cryptochlorogenic acid （peak No.8， source from Lonicerae Japonicae Flos and Houttuyniae Herba）， isoforsythiaside A （peak No.15， source from Forsythiae Fructus）， forsythoside A （peak No.20， source from Forsythiae Fructus）， quercitrin （peak No.23， source from Houttuyniae Herba）， isochlorogenic acid C （peak No.24， source from Lonicerae Japonicae Flos）， phillyrin （peak No.26， source from Forsythiae Fructus）， glycyrrhizic acid （peak No.31， source from Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）. The similarities in 10 batches of Lianhua Qingwen Capsules samples were all above 0.96. Conclusion The method is with good precision， repeatability and stability， which can be used as a new means for the quality control of Lianhua Qingwen Capsules.

Key words： Lianhua Qingwen Capsules； UPLC； fingerprints

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金（81503231）；國家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目（ZYBZH-C-HEB-12）；北京市科技計劃“十病十藥”中藥專項（Z161100001816022）endprint

通訊作者：畢丹，E-mail：bidan_2005@163.com

連花清瘟膠囊是由連翹、金銀花等13味中藥組成的復(fù)方制劑，為中藥六類新藥，有清熱解毒、宣肺泄熱作用，用于治療流行性感冒屬熱毒襲肺證[1]。藥理研究表明，連花清瘟膠囊體外抗甲型H3N2流感病毒，提高FM1株流感病毒感染小鼠平均存活時間，延長生存期，具有退熱消炎、止咳化痰功效，可迅速緩解流感癥狀；提高細(xì)胞免疫和體液免疫功能，增強機體抗病康復(fù)能力[2-8]。目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包含5個薄層鑒別和1個連翹苷含量測定項，由于中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，其作用往往是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，僅用1種成分作為含量測定指標(biāo)不能全面反映連花清瘟膠囊的內(nèi)在質(zhì)量。

中藥指紋圖譜技術(shù)作為一種從整體上控制質(zhì)量的手段，已被國內(nèi)外廣泛認(rèn)可，許多現(xiàn)代色譜、光譜分析技術(shù)在中藥指紋圖譜測定中都有應(yīng)用，HPLC指紋圖譜是目前應(yīng)用最多的一類，其具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點，如運用二極管陣列檢測器，可得到三維圖譜，因而適合分析成分比較復(fù)雜、紫外光區(qū)有吸收的藥物，尤其適用于成分差別較細(xì)微的單味藥材及成分較為復(fù)雜的復(fù)方制劑[9-15]。與HPLC相比，超高效液相色譜（UPLC）具有分離度高、靈敏度高、分析時間短的特性，近幾年廣泛應(yīng)用于中藥指紋圖譜的研究[16]。本試驗采用UPLC建立連花清瘟膠囊的指紋圖譜，作為連花清瘟膠囊質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與試藥

美國Waters UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀（PDA檢測器，Empower 3.0色譜工作站），KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（Millipore Bedford，MA，美國），瑞士METTLER TOLEDO AL 204型電子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO AB 135-S型電子分析天平，上海精科JA2603B電子天平。

連翹苷（中國食品藥品檢定研究院，批號110821- 201213，純度95.3%），連翹酯苷A（中國食品藥品檢定研究院，批號111810-201304，純度94.3%），新綠原酸（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號13112712，純度≥98%），綠原酸（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201314，純度96.6%），隱綠原酸（上海源葉生物科技有限公司，批號ZF0226BA14，純度≥98%），異連翹酯苷A（上海源葉生物科技有限公司，批號YA0817HB14，純度≥98%），異綠原酸C（中國食品藥品檢定研究院，批號111894-201102，純度94.1%），槲皮苷（HWI ANALYTIK GMBH pharma solutions，批號HWI01112，純度91.7%），甘草酸銨（Council of Europe-EDQM，批號1.1，純度≥98%），甲醇（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號2014年1月13日），磷酸（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號2014年3月26日），甲醇（色譜純，美國Fisher公司，批號124875），乙腈（色譜純，美國Fisher公司，批號106246），連花清瘟膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號B1507010、B1507002、B1507005、B1507007、B1507008、B1507013、B1507014、B1507015、B1507017、B1507020）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（1.8 ?m，2.1 mm×100 mm），以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫（流動相B為甲醇，流動相C為乙腈，流動相D為0.1%磷酸溶液），見表1。檢測波長為239 nm，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量2 ?L。

2.2 對照品溶液的制備

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、連翹苷、異綠原酸C、槲皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL分別含新綠原酸18.4 ?g、綠原酸27.2 ?g、隱綠原酸21.2 ?g、異連翹酯苷A 27.2 ?g、連翹酯苷A 21.6 ?g、連翹苷16.0 ?g、異綠原酸C 14.4 ?g、槲皮苷9.0 ?g、甘草酸銨24.4 ?g的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取連花清瘟膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 藥材提取溶液的制備

取連花清瘟膠囊原藥材各0.5 g，加50%甲醇25 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，取適量溶液，過濾，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取同一批連花清瘟膠囊（批號B1507010）內(nèi)容物，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，直觀觀察各指紋圖譜的全貌無明顯變化，各主要色譜峰峰面積的RSD均小于5%，表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，直觀觀察各指紋圖譜的全貌無明顯變化，測定各主要色譜峰峰面積的RSD均小于5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批連花清瘟膠囊（批號B1507010）內(nèi)容物6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀檢測，直觀觀察各指紋圖譜的全貌無明顯變化，測定各主要色譜峰峰面積的RSD均小于5%，表明方法重復(fù)性較好。endprint

2.6 指紋圖譜的建立及共有峰的鑒定

取10批連花清瘟膠囊樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，得到10批連花清瘟膠囊的指紋圖譜（見圖1），并采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件對10批樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，以S1為參照指紋圖譜，采用中位數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進(jìn)行多點校正和自動匹配，確定共有峰32個。分別取供試品溶液、對照品溶液和藥材提取溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，將對照品溶液色譜峰的保留時間與供試品溶液和藥材提取液的色譜峰保留時間以及紫外吸收光譜圖進(jìn)行比對（見圖2），鑒定了供試品溶液中9個色譜峰：新綠原酸（4號峰，來源于金銀花和魚腥草），綠原酸（6號峰，來源于連翹、金銀花和魚腥草），隱綠原酸（8號峰，來源于金銀花和魚腥草），異連翹酯苷A（15號峰，來源于連翹），連翹酯苷A（20號峰，來源于連翹），槲皮苷（23號峰，來源于魚腥草），異綠原酸C（24號峰，來源于金銀花），連翹苷（26號峰，來源于連翹），甘草酸（31號峰，來源于甘草）。其中以出峰穩(wěn)定、峰面積較大的20號色譜峰連翹酯苷A為參照峰。

2.7 指紋圖譜相似度分析

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件對10批連花清瘟膠囊品的指紋圖譜進(jìn)行分析，以S1（批號B1507002）為參照指紋圖譜，采用中位數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進(jìn)行多點校正和自動匹配，計算相似度并生成對照指紋圖譜（R），然后進(jìn)行相似度計算，10批連花清瘟膠囊指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度評價結(jié)果見表2。

3 討論

本試驗考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液3個流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相系統(tǒng)的色譜峰出峰較多，基線穩(wěn)定，各峰分離度較好，因此最終選擇甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相系統(tǒng)。在該色譜條件下增加梯度洗脫有機相比例，并延長洗脫時間至140 min，結(jié)果表明，70 min后沒有明顯的色譜峰，因此流動相洗脫時間確定為70 min。

本試驗分別考察了Waters ACQUITY UPLC CSH C18（1.7 ?m，2.1 mm×100 mm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 ?m，2.1 mm×100 mm）、Waters ACQUITY UPLC BEH shield RP C18（1.7 ?m，2.1 mm×100 mm）和Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 ?m，2.1 mm×100 mm）4種不同的色譜柱，比較不同色譜柱對各色譜峰分離度及峰形的影響。結(jié)果表明，只有使用Waters ACQUITY UPLCHSS T3 C18柱時，各色譜峰峰形及分離度較好。因此，本方法選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱。

本試驗分別考察了甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇的提取效果，結(jié)果表明，50%甲醇作為提取溶劑所得的指紋圖譜中色譜峰最多，峰面積較大，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑。比較了超聲法和加熱回流法2種提取方法，結(jié)果表明，超聲提取和回流提取所得指紋圖譜色譜峰的數(shù)目和強度沒有明顯區(qū)別，由于超聲提取方法簡便，因此選擇超聲提取方式。分別比較了超聲提取20、30、40 min，結(jié)果表明，超聲提取30 min與40 min所得指紋圖譜中色譜峰數(shù)量較超聲提取20 min多，且提取30 min和40 min所得指紋圖譜的色譜峰無明顯區(qū)別，因此最終確定超聲提取時間為30 min。

本研究采用PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描，比較200～400 nm所得的指紋圖譜色譜圖，結(jié)果在239 nm下檢測的色譜圖中色譜峰最多，因此確定檢測波長為239 nm?？疾炝瞬煌V柱溫度25、30、35 ℃所得的指紋圖譜色譜圖，結(jié)果表明，色譜柱溫度為30 ℃時，色譜圖中的色譜峰數(shù)量最多且分離效果最好。

本研究按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》[17]，采用UPLC對連花清瘟膠囊中非揮發(fā)性成分指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)進(jìn)行研究，取得了較滿意的結(jié)果，標(biāo)定了32個共有峰，指認(rèn)了其中9個共有峰，同時方法學(xué)考察其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，表明所建立的UPLC指紋圖譜方法可行，運用指紋圖譜相似度軟件對連花清瘟膠囊UPLC指紋圖譜進(jìn)行了相似度計算，結(jié)果10批連花清瘟膠囊的指紋圖譜相似度在0.970～0.999，表明各批次樣品的成分無明顯差異，整體質(zhì)量有較好的穩(wěn)定性，為客觀評價連花清瘟膠囊質(zhì)量提供一定依據(jù)。

中藥復(fù)方是多味藥、多組分、多因素構(gòu)成的復(fù)雜體系，其化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性是其療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。為了更全面地控制連花清瘟膠囊的質(zhì)量，本研究首次建立了連花清瘟膠囊的UPLC指紋圖譜，方法簡單、快捷，可較全面反映連花清瘟膠囊中化學(xué)成分信息，經(jīng)初步驗證，該方法能夠用來控制本品的質(zhì)量，確保產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性、均一性，從而為控制連花清瘟膠囊的質(zhì)量提供了新方法。

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（收稿日期：2017-05-08）

（修回日期：2017-06-02；編輯：陳靜）endprint