羅燕燕+劉效栓+肖正國+李喜香+李季文+畢映燕+張柏桃

摘要：目的 建立甘草藥渣提取物中甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸的測定方法。方法 采用HPLC雙波長法對甘草藥渣提取物中的主要成分甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素和甘草酸進(jìn)行定量分析。色譜柱為Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈（A）-0.085%磷酸水（B）為流動相，采用梯度洗脫（0～8 min，81%B；8～35 min，81%→50%B；35～60 min，50%B），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 ?L，柱溫為室溫，雙波長檢測（λ1=237 nm，λ2=254 nm）。結(jié)果 甘草苷在0.040 8～0.816 ?g、異甘草苷在0.052 8～1.056 ?g、甘草素在0.022 4～0.448 ?g、異甘草素在0.021 2～0.424 ?g、甘草酸在0.044 8～0.896 ?g范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.69%、98.31%、99.10%、98.55%、99.14%，RSD分別為1.39%、1.29%、1.78%、2.14%、1.15%。結(jié)論 本法準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于甘草藥渣提取物中上述5種成分的測定。

關(guān)鍵詞：甘草藥渣提取物；高效液相色譜法；雙波長法；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.016

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0064-04

Simultaneous Determination of Liquiritin， Isoliquiritin， Glycyrrhizin， Isoliquiritigenin and Glycyrrhizic Acid in Licorice Extract by HPLC Dual Wavelength Spectrophotometry LUO Yan-yan1， LIU Xiao-shuan2， XIAO Zheng-guo2， LI Xi-xiang2， LI Ji-wen2， BI Ying-yan2， ZHANG Bo-tao3 （1. Pharmacy College， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Pharmacy Department， Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China； 3. Pharmaceutical Inspection Institute of Gansu Province， Lanzhou 730070， China）

Abstract： Objective To establish a method for the simultaneous determination of liquiritin， isoliquiritin， glycyrrhizin， isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid in licorice extract. Methods Liquiritin， isoliquiritin， glycyrrhizin， isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid in licorice extract were determined by HPLC dual wavelength spectrophotometry. Symmetry C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used. The mobile phase was acetonitrile （A） - 0.085% phosphoric acid water （B）， ingradient elution mode （0–8 min， 81% B； 8–35 min， 81%→50% B； 35– 60 min， 50% B） with the flow rate of 1.0 mL/min. The sample size was 10 ?L， and column temperature was room temperature. Dual wavelength detection， λ1=237 nm， λ2=254 nm. Results Liquiritin， isoliquiritin， glycyrrhizin， isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid were linear in the ranges of 0.040 8–0.816 ?g， 0.052 8–1.056 ?g， 0.022 4– 0.448 ?g， 0.021 2–0.424 ?g， and 0.044 8–0.896 ?g， respectively. The average recovery was 98.69%， 98.31%， 99.10%， 98.55%， and 99.14%， respectively； RSD was 1.39%， 1.29%， 1.78%， 2.14%， and 1.15 %， respectively. Conclusion The method is accurate， reliable and specific. The results are stable with good repeatability. It can be used for the determine of above 5 components in licorice extract.endprint

Key words： licorice extract； HPLC； dual wavelength spectrophotometry； content determination

基金項目：蘭州市科技計劃項目（2014-2-32）

通訊作者：劉效栓，E-mail：liuxiaoshuan1964@163.com

甘草為豆科甘草屬甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草G.inflata Bat.、光果甘草G.glabra L.的干燥根和根莖，具補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止咳化痰、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功。甘草的主要有效成分為甘草酸和甘草黃酮[1]。

近年來，隨著對甘草開發(fā)利用的不斷深入，甘草和甘草制品的需求量逐年增加，甘草資源急劇減少。與此同時，甘草提取甘草酸或甘草浸膏后剩余的殘渣（甘草渣）也逐漸成為危害生態(tài)環(huán)境的又一物質(zhì)[2]。目前甘草的利用率僅為30%，剩余物基本作為藥渣棄去，據(jù)估計，我國每年有數(shù)萬噸甘草藥渣未被資源化利用[3]。而甘草藥渣是一種寶貴的可再利用資源，其中含有大量的黃酮[4-5]及甘草酸[6]。因此，有效地從甘草渣中再次提取黃酮和甘草酸對充分開發(fā)利用甘草資源意義重大。

通常情況下，僅采用單一波長檢測黃酮類和三萜類2類物質(zhì)無法實現(xiàn)其整體表達(dá)和全面評價，而雙波長法同時測定具操作簡便、靈敏可靠、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。本試驗采用HPLC雙波長法同時測定甘草藥渣提取物中4種黃酮成分及甘草酸的含量，為甘草藥渣提取物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters1525泵，Waters717進(jìn)樣器，Waters2487雙通道紫外檢測器），AR124CN型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司），SB-3200D型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

甘草飲片（甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，批號20160325、20160402，經(jīng)甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師鑒定為Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖；甘草藥渣（自制，批號20160826）；甘草藥渣提取物（自制，批號20161102、20161104、20161106、20161108、20161110、20161112、20161114）；甘草苷對照品（批號B-20414）、異甘草苷對照品（批號B-21524）、甘草素對照品（批號B-20416）、異甘草素對照品（批號B-21525）、甘草酸對照品（批號B-20414），上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇（色譜純，批號20160905）、乙腈（批號20160505）、磷酸（批號20160307），天津市大茂化學(xué)試劑廠；含量測定用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷0.040 8 mg、異甘草苷0.052 8 mg、甘草素0.022 4 mg、異甘草素0.021 2 mg、甘草酸0.044 8 mg的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取甘草藥渣提取物（批號20161102）約100 mg，精密稱定，加70%乙醇超聲處理（溫度37 ℃，功率300 W）5 min，定容至25 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱：Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.085%磷酸水（B），梯度洗脫（0～8 min，81%B；8～35 min，81%→50%B；35～60 min，50%B）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L；柱溫：室溫；雙波長檢測[7-8]：λ1=237 nm，λ2=254 nm。色譜圖見圖1。

A

B

C

D

注：A.混合對照品（λ1）；B.供試品（λ1）；C.混合對照品（λ2）；D.供試品（λ2）；

1.甘草苷；2.異甘草苷；3.甘草素；4.甘草酸；5.異甘草素

圖1 甘草藥渣提取物中5種成分HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20 ?L，在上述色譜條件下依次進(jìn)樣，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。甘草苷Y=2 154 989.975X-14 196.073，r=0.999 7；異甘草苷Y=1 270 876.187X-10 898.366，r=0.999 7；甘草素Y=4 705 003.769X-18 178.439，r=0.999 8；異甘草素Y=1 883 245.602X-7160.195，r=0.999 7；甘草酸Y=838 071.814X-6863.610，r=0.999 8。結(jié)果表明，甘草苷在0.040 8～0.816 ?g、異甘草苷在0.052 8～1.056 ?g、甘草素在0.022 4～0.448 ?g、異甘草素在0.021 2～0.424 ?g、甘草酸在0.044 8～0.896 ?g范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 ?L，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸的RSD分別為1.36%、1.08%、1.92%、1.64%、1.83%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，運(yùn)用雙波長融合譜技術(shù)對提取物具有代表性和互補(bǔ)性的237、254 nm波長下色譜圖進(jìn)行融合。選擇圖1B、D中特征峰1、2、3、4、5號，以1號色譜峰為內(nèi)標(biāo)，考察其相對保留時間和峰面積。計算相對保留時間γi，s=t'i/t's，式中i和s分別為特征峰和內(nèi)標(biāo)峰。結(jié)果所標(biāo)定色譜峰（甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸及異甘草素）的相對保留時間RSD<0.3%；峰面積的RSD分別為1.36%、2.15%、2.14%、1.26%、1.23%，表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。endprint

2.6 重復(fù)性試驗

稱取甘草藥渣提取物（批號20161102）6份，按“2.1.2”項下方法制備，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測定，結(jié)果甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸的RSD分別為1.87%、1.62%、1.93%、1.32%、1.08%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密量取6份已知含量的供試品溶液5 mL，用移液器分別精密加入甘草苷對照品（0.040 8 g/L）、異甘草苷對照品（0.052 8 g/L）、甘草素對照品（0.022 4 g/L）、異甘草素對照品（0.021 2 g/L）及甘草酸對照品溶液（0.044 8 g/L）適量，按供試品溶液制備方法制備并測定，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測定

取7批甘草藥渣提取物，每批平行3份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，通過測得的峰面積值計算甘草藥渣提取物中甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸的含量，結(jié)果見表2。

表1 甘草藥渣提取物中5種成分加樣回收率試驗

成分 樣品中

含量/?g 加入量

/?g 測得量

/?g 回收率

/% 平均回

收率/% RSD

/%

甘草苷 153.36 40.80 193.96 99.50

153.36 40.80 194.34 100.43

153.36 40.80 193.19 97.62 98.69 1.39

153.36 40.80 193.67 98.79

153.36 40.80 193.83 99.18

153.36 40.80 192.78 96.61

異甘草苷 51.83 26.40 77.47 97.13

51.83 26.40 78.03 99.25

51.83 26.40 78.19 99.85 98.31 1.29

51.83 26.40 77.76 98.22

51.83 26.40 77.93 98.87

51.83 26.40 77.32 96.56

甘草素 7.21 6.72 13.91 99.75

7.21 6.72 13.87 99.15

7.21 6.72 13.79 97.96 99.10 1.78

7.21 6.72 14.02 101.38

7.21 6.72 13.68 96.32

7.21 6.72 13.93 100.04

異甘草素 18.34 10.60 28.92 99.81

18.34 10.60 28.39 94.81

18.34 10.60 28.95 100.09 98.55 2.14

18.34 10.60 28.88 99.43

18.34 10.60 28.65 97.26

18.34 10.60 28.93 99.91

甘草酸 378.33 44.80 423.12 99.98

378.33 44.80 423.09 99.91

378.33 44.80 423.10 99.93 99.14 1.15

378.33 44.80 422.98 99.67

378.33 44.80 422.05 97.59

378.33 44.80 422.12 97.75

表2 甘草藥渣提取物中5種成分含量測定結(jié)果（mg/g）

批號 甘草苷 異甘草苷 甘草素 異甘草素 甘草酸 總含量

20161102 7.39 2.50 0.35 0.88 18.22 29.34

20161104 9.15 3.06 0.38 1.01 22.71 36.30

20161106 9.17 3.05 0.38 1.02 22.75 36.35

20161108 9.33 3.10 0.38 1.02 23.15 36.98

20161110 9.35 2.99 0.39 1.04 23.18 36.94

20161112 9.43 3.15 0.39 1.03 23.36 37.37

20161114 6.77 2.33 0.32 0.79 17.27 27.48

3 討論

本試驗考察了不同溶媒（包括甲醇及不同濃度的乙醇）超聲提取樣品，比較各溶媒對樣品的溶解性，發(fā)現(xiàn)樣品在70%乙醇溶液中溶解度大于甲醇溶液，同時考慮到溶劑的安全性和環(huán)保因素，故選擇70%乙醇作為樣品提取溶劑。

本試驗曾參考文獻(xiàn)[9-11]，對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水的不同比例和梯度洗脫系統(tǒng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.085%磷酸為流動相所得到的色譜圖中，化合物的分離效果好，色譜峰形佳且相對穩(wěn)定，故選用乙腈-0.085%磷酸為系統(tǒng)流動相。

本試驗在選擇波長時，以檢測甘草黃酮（甘草苷）具有代表性的波長237 nm[12]為主。依據(jù)文獻(xiàn)[8]，甘草酸的最大紫外吸收波長是254 nm。通過進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，在254 nm波長下甘草藥渣提取物中甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸均有較好的吸收，故選擇λ1=237 nm，λ2=254 nm。

在HPLC特征圖譜或指紋圖譜研究中，傳統(tǒng)的定位方法為隨行對照或者相對保留時間定位。通過試驗發(fā)現(xiàn)，對于復(fù)雜化合物中某一組分的定位測定，還可以參考同一時間2個波長下面積的比值來確定指紋峰，以排除相鄰峰的干擾，避免因?qū)嶒炇覝貪穸茸兓斐杀Ａ魰r間不恒定所致的誤差。endprint

同時，曾試驗在梯度洗脫時間變換同時變換檢測波長，發(fā)現(xiàn)其重復(fù)性較差、操作較復(fù)雜。而雙波長同時檢測提高了精密度和靈敏度，重復(fù)性良好。

目前，對這5種成分（包括甘草黃酮和甘草酸）含量的同時測定尚未見文獻(xiàn)報道。本試驗將5個對照品按一定體積混合進(jìn)樣得出其混合圖譜，同時測定，不僅簡化了操作，還節(jié)省了成本及時間，為甘草藥渣指紋圖譜的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-03-10）

（修回日期：2017-04-01；編輯：陳靜）endprint