喬姍姍+鄭時奇+方明月+師朵芝+李德利+王騰宇+王如峰

摘要：目的 比較2種體外肝代謝模型轉(zhuǎn)化藜蘆酸葡萄糖酯的轉(zhuǎn)化樣式和轉(zhuǎn)化率差異。方法 通過大鼠肝微粒體和肝S9體外轉(zhuǎn)化模型對藜蘆酸葡萄糖酯進行生物轉(zhuǎn)化，采用HPLC檢測轉(zhuǎn)化底物及產(chǎn)物的含量，檢測波長254 nm，流動相為乙腈（A）-1%乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，5%～40%A；6～9 min，40%～50%A；9～11 min，50%～5%A），流速1.0 mL/min。結(jié)果 2種模型均可將藜蘆酸葡萄糖酯轉(zhuǎn)化為藜蘆酸，但應(yīng)用肝S9模型得到的代謝產(chǎn)物多于肝微粒體模型，且肝S9模型對酯類的轉(zhuǎn)化率高于肝微粒體模型。結(jié)論 肝S9模型對酯類的轉(zhuǎn)化能力高于肝微粒體模型。

關(guān)鍵詞：藜蘆酸葡萄糖酯；藜蘆酸；肝微粒體；肝S9

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.015

中圖分類號：R285.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0060-04

Comparative Study on Transformation of Tecomin by Using Liver Microsomes and Liver S9 QIAO Shan-shan， ZHENG Shi-qi， FANG Ming-yue， SHI Duo-zhi， LI De-li， WANG Teng-yu， WANG Ru-feng （School of Life Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

Abstract： Objective To compare the difference of transformation profile and transformation rate of tecomin by using two in vitro liver metabolism models. Methods Liver microsomes and liver S9 fraction models were employed to transform tecomin. HPLC was used to determine the contents of tecomin and its metabolites at the detecting wavelength of 254 nm. The gradient elution （0–6 min， 5%–40% A； 6–9 min， 40%–50% A； 9–11 min， 50%–5% A） was carried out by using mobile phase of acetonitrile （A） - 1% acetic acid （B） at a flow rate of 1 mL/min. Results Both models could transform tecomin into veratric acid； however， the metabolites obtained with liver S9 were more than those obtained with liver microsomes， and the transformation rate of the former was higher than that of the latter. Conclusion The liver S9 fraction can more efficiently transform esters than liver microsomes.

Key words： tecomin； veratric acid； liver microsomes； liver S9 fraction

肝臟是藥物代謝的重要器官，是機體進行生物轉(zhuǎn)化的主要場所。以肝臟為基礎(chǔ)的體外代謝模型以其特有的優(yōu)勢在藥物代謝研究中得到廣泛應(yīng)用。肝微粒體和肝S9是2種常用的模擬藥物肝代謝的體外模型。肝S9是將肝組織勻漿后，經(jīng)9000 r/min離心所得的上清液，可在肝微粒體的早期制備階段獲得，含有微粒體和胞質(zhì)分?jǐn)?shù)，含有生物轉(zhuǎn)化Ⅰ相反應(yīng)所需的CYP450酶類和Ⅱ相代謝酶（如葡萄糖酸轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、硫酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶等）和其他的一些氧化酶和脫氫酶，如負(fù)責(zé)酒精代謝的乙醛脫氫酶

基金項目：北京市自然科學(xué)基金面上項目（7172129）

通訊作者：王如峰，E-mail：wangrufeng@tsinghua.org.cn

等[1-2]。與肝S9不同，肝微粒體只含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞細(xì)胞分?jǐn)?shù)，包括負(fù)責(zé)藥物代謝的CYP450酶和極少量的Ⅱ相代謝酶[3-4]。既然二者所含的代謝酶存在差異，它們對藥物的代謝是否存在差異值得關(guān)注。藜蘆酸葡萄糖酯是本課題組從金蓮花Flos Trollii中首次分離出的一種酚酸類化合物（見圖1），前期研究已經(jīng)顯示其可在肝內(nèi)代謝，具有抗炎和抑菌活性，被視為金蓮花的抗炎和抑菌有效成分之一[5-7]。從分子結(jié)構(gòu)來看，藜蘆酸葡萄糖酯是由藜蘆酸的羧基和葡萄糖C1位的羥基脫水形成的糖酯類化合物[8]。前期研究表明，藜蘆酸葡萄糖酯在體內(nèi)可被代謝為藜蘆酸，并推測其主要代謝器官為肝臟[9-10]。因此，本研究以藜蘆酸葡萄糖酯為底物對這2種模型的代謝樣式和代謝速率進行比較，為選擇合適可行的體外肝代謝模型提供依據(jù)。

圖1 藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸結(jié)構(gòu)式

1 動物、儀器與試藥

SPF級雄性SD大鼠10只，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，動物許可證號SCXK（京）2011-0004，常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥實驗室動物房。endprint

Waters Breeze 1525型液相色譜儀（包括Waters 1525二元溶劑輸液泵、Waters 2489紫外檢測器、Waters breeze 2色譜工作站），美國Waters公司；Phenomenex色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 ?m），美國Phenomenex公司；TU-1901型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；T10 basic型勻漿器，德國IKA公司；電熱恒溫振蕩水槽，金壇市華立實驗儀器廠；CP100WX型超速離心機，日本株式會社日立制作所；漩渦混勻儀，海門市氣林貝雨儀器廠；高速低溫離心機，美國Kendro儀器公司；氮氣吹干儀，北京市優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；pH計，徐州亞名儀器儀表有限公司；AE240十萬分之一電子天平，瑞士Mettler公司。

氧化型輔酶Ⅱ（NADP）、還原性輔酶Ⅰ（NADH）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH），Sigma公司；DL-硫酸蘇糖醇（DTT），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂、乙二胺四乙酸二鈉，北京高華偉業(yè)食品添加劑有限公司；分析純乙腈、甲醇、乙酸乙酯，北京東方飛思科技發(fā)展有限公司；色譜純乙腈、甲醇，美國Fisher公司；Folin-酚試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；苯巴比妥鈉注射液，中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院；藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸均由本實驗室從金蓮花中分離得到，按照面積歸一化法測得其純度不低于98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 肝微粒體和肝S9的制備

采用一次離心法制備大鼠肝S9，二次離心法制備大鼠肝微粒體。大鼠在動物房適應(yīng)1周后，腹腔注射苯巴比妥鈉注射液（80 mg/kg），連續(xù)3 d，誘導(dǎo)肝酶產(chǎn)生。大鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉處死，迅速打開腹腔，從肝門靜脈注射冰冷生理鹽水，清除肝內(nèi)殘留血液，取出肝臟，用冰冷生理鹽水洗凈，去除肝臟表面血液，濾紙吸干液體，稱重。將肝臟剪成小塊后，按1∶3比例加入50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，用電動勻漿機勻漿，將勻漿液于4 ℃、9000×g離心30 min，棄去上層脂質(zhì)和下層沉淀后的清液即為制得的肝S9，分裝，于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。將勻漿液在4 ℃、12 500×g離心15 min，取棄去上層脂質(zhì)和下層沉淀后的清液，再于105 000×g離心70 min，沉淀部分即肝微粒體，將肝微粒體重懸浮于磷酸鹽緩沖液（20%甘油、50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4、0.1 mmol/L EDTA，pH 7.4）中，分裝，于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 肝微粒體和肝S9蛋白濃度測定

采用Folin-酚試劑盒測定肝S9、肝微粒體的蛋白濃度。按照Lowry法[11]，采用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液（BSA）進行測定，將蛋白含量對紫外可見吸收值（OD）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，OD=2.019 41C+0.089 82，r=0.999 8，表明在0～0.25 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最后測定肝S9蛋白濃度為20.92 mg/mL，肝微粒體蛋白濃度為28.13 mg/mL。

2.3 體外肝代謝實驗

精密量取藜蘆酸葡萄糖酯適量，溶于磷酸鹽緩沖液中備用。將配制好的酶系（NADPH再生系統(tǒng)，包括2.0 mmol/L NADP、1.0 mmol/L NADH、20 mmol/L G-6-P、2.0 IU/mL G-6-PDH、8.0 mmol/L MgCl2）、肝微粒體（蛋白濃度8.0 mg/mL）、肝S9（蛋白濃度8.0 mg/mL）定量加入各反應(yīng)組中，搖勻后，37 ℃水浴溫孵5 min，再定量加入藜蘆酸葡萄糖酯開始反應(yīng)，實驗體系見表1。120 min后加入等量冰凍的乙酸乙酯終止反應(yīng)，14 800 r/min離心10 min，取上清液，加入等量乙酸乙酯萃取3次，氮氣吹干，以500 ?L甲醇復(fù)溶，0.45 ?m微孔濾膜過濾后，HPLC分析。

2.4 液相色譜分析

2.4.1 色譜條件 Phenomenex色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 ?m），有預(yù)柱；流動相為乙腈（A）-1%乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，5%～40%A；6～9 min，40%～50%A；9～11 min，50%～5%A）；流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 ?L。結(jié)果藜蘆酸葡萄糖酯與藜蘆酸的峰形良好，分離完全，無雜質(zhì)峰干擾，空白肝微粒體、肝S9對測定無干擾，專屬性強，見圖2。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗 測定結(jié)果顯示，藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸的保留時間分別為7.702、9.803 min，理論塔板數(shù)分別為26 292、50 607，拖尾因子分別為0.95、1.01，檢測限（LOD）分別為0.06、0.03 ng，定量限（LOQ）分別為0.19、0.10 ng。以上數(shù)據(jù)表明上述條件適用于2種化合物的分析。

2.4.3 方法學(xué)考察

2.4.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取藜蘆酸葡萄糖酯6.40 mg和藜蘆酸3.30 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，為對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.75、2、2.5 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配制成8個不同濃度的對照品溶液。分別進樣測定，以藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸的峰面積對其各自濃度進行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。藜蘆酸葡萄糖酯Y=722 359X-1806.3（r=0.999 2），線性范圍0.016～0.32 mg/mL；藜蘆酸Y=2 372 949X+1061.8（r=0.999 3），線性范圍0.008 25～0.165 mg/mL。

2.4.3.2 精密度和準(zhǔn)確度試驗 配制3個不同濃度的藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸的混合對照品溶液。按“2.4.1”項下色譜條件，在同一日內(nèi)分別將各濃度的同一樣品連續(xù)進樣6次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照色譜峰的峰面積求得樣品中藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸的濃度，并計算3個濃度各連續(xù)6次進樣的RSD和RE，結(jié)果表明本方法的日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度良好。然后，分別將各濃度的同一樣品每日連續(xù)進樣2次，連續(xù)進樣3 d，同法求得樣品中藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸的濃度，并計算3個濃度各6次進樣的RSD，結(jié)果表明本方法的日間精密度良好。見表2。endprint

2.4.3.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗 用空白溫孵體系（肝S9）配制3個不同濃度的藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸溶液，每個濃度6份，按“2.3”項下方法除去蛋白，得到供試品溶液。分別進樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照色譜峰的面積求得樣品中藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸的濃度，并計算3個濃度各6份樣品的RSD，結(jié)果表明重復(fù)性良好。用空白溫孵體系配制3個不同濃度的藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸溶液，每個濃度3份，按“2.3”項下方法除去蛋白，得到供試品溶液。分別在室溫下放置0、4、8 h及-20 ℃放置4、7、10 d進樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照色譜峰的面積求得樣品中藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸的濃度，并分別計算短期和長期穩(wěn)定性的RSD，結(jié)果表明樣品的短期和長期穩(wěn)定性良好。見表2。

2.4.3.4 絕對回收率試驗 制備低、中、高濃度的大鼠肝微粒體、肝S9溫孵樣品（含藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸），按“2.3”項下方法除去蛋白，以相同濃度的藜蘆酸葡萄糖酯和藜蘆酸所得色譜峰面積為對照，二者的平均回收率（n=3）分別為91.23%、87.61%。

2.4.4 定性和定量分析 由圖2可知，肝微粒體和肝S9均可將藜蘆酸葡萄糖酯轉(zhuǎn)化為藜蘆酸，但是，通過對底物藜蘆酸葡萄糖酯和代謝產(chǎn)物藜蘆酸的定量分析可知，在相同的作用條件下，肝S9轉(zhuǎn)化模型對藜蘆酸葡萄糖酯的轉(zhuǎn)化效率高于肝微粒體模型。結(jié)果見表3。

3 討論

肝微粒體和肝S9是研究藥物肝代謝的常用模型，這2種模型由于制備方法不同，導(dǎo)致其所含的酶系有所差異。相對而言，肝S9所含酶的種類，特別是Ⅱ相代謝酶要多于肝微粒體，由此可能造成肝S9模型催化的Ⅱ相代謝多于肝微粒體。已有研究表明，肝S9是一種穩(wěn)定、可靠、低成本的體外肝代謝模型[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝S9導(dǎo)致的藜蘆酸葡萄糖酯的代謝產(chǎn)物多于肝微粒體（見圖2），在高極性區(qū)，肝S9的代謝產(chǎn)物比肝微粒體的代謝產(chǎn)物明顯多2個峰（6.05、6.85 min），其極性大于藜蘆酸葡萄糖酯，推測可能是Ⅱ相代謝產(chǎn)物。在相同蛋白濃度條件下，肝S9對藜蘆酸葡萄糖酯的轉(zhuǎn)化率明顯高于肝微粒體，說明肝S9對酯類化合物的轉(zhuǎn)化明顯強于肝微粒體，并且隨著底物濃度的增加，肝微粒體對藜蘆酸葡萄糖酯的轉(zhuǎn)化率明顯降低，但肝S9的轉(zhuǎn)化率始終大于50%（見表3）。因此，與肝微粒體模型比較，肝S9模型是一種制備簡單、快速、低成本、轉(zhuǎn)化率高、酶系豐富的體外肝代謝模型。

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（收稿日期：2017-04-06）

（修回日期：2017-06-09；編輯：陳靜）endprint