藺曉源+鄧娜+蔡瑩+劉芳

摘要：目的 觀察四神丸對脾腎陽虛型泄瀉模型大鼠胃竇組織Ghrelin-CaM-MLCK信號通路的影響，探討其作用機制。方法 采用灌服腺嘌呤和番瀉葉水煎劑制作脾腎陽虛型泄瀉大鼠模型。將72只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和四神丸高、中、低劑量組，每組12只。各給藥組給予相應藥物灌胃，連續(xù)14 d，免疫組化和Western blot分別檢測胃竇組織腦腸肽胃促生長素（Ghrelin）及其受體（GHSR）、鈣調(diào)素（CaM）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的蛋白表達。結果 模型組大鼠胃竇組織Ghrelin、GHSR、CaM和MLCK蛋白表達均較正常組明顯升高（P<0.01）；各給藥組上述指標蛋白表達均明顯低于模型組（P<0.05，P<0.01），且以四神丸高劑量組最為明顯。結論 四神丸對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠的作用可能與調(diào)節(jié)Ghrelin-CaM-MLCK信號通路指標的蛋白表達有關。

關鍵詞：四神丸；泄瀉；胃促生長素；胃促生長素受體；鈣調(diào)素；肌球蛋白輕鏈激酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.009

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0034-04

Effects of Sishen Pills on Ghrelin-CaM-MLCK Signaling Pathway in Sinuses Ventriculi of Rats with Diarrhea of Yang Deficieney of Spleen and Kidney LIN Xiao-yuan1， DENG Na2， CAI Ying2， LIU Fang1 （1. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To explore the effects of Sishen Pills on Ghrelin-CaM-MLCK signaling pathway with sinuses ventriculi in diarrhea rats of yang deficieney of spleen and kidney； To discuss its mechanism of action. Methods A model rats with diarrhea model of yang deficieney of spleen and kidney was established by treated with intragastric administration of adenine and Senna water decoction to replicate. 72 SD rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group， Sishen Pills high-， medium- and low-dose groups， with 12 rats in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage， for 14 days. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expressions of Ghrelin and GHSR， CaM， and MLCK protein in the sinuses ventriculi. Results In the model group， Ghrelin， GHSR， CaM and MLCK protein expressions of the sinuses ventriculi significantly increased （P<0.01）. In each medication group， protein expression of the indexes was lower than the model group （P<0.05， P<0.01）. The Sishen Pills high-dose group was particularly obvious. Conclusion The effect of Sishen Pills on diarrhea model rats of yang deficieney of spleen and kidney may be associated with regulation of index protein expression in Ghrelin-CaM-MLCK signaling pathway.

Key words： Sishen Pills； diarrhea； Ghrelin； GHSR； CaM； MLCK； rats

基金項目：國家自然科學基金（81403380）；湖南省教育廳科研項目（15B178、17C1636）

通訊作者：劉芳，E-mail：2289797960@qq.com

泄瀉可見于腸易激綜合征等多種消化道疾病導致的腹瀉，其發(fā)病率和復發(fā)率高，治愈難度大，嚴重影響人們的身心健康。四神丸臨床治療脾腎陽虛型泄瀉療效顯著[1-2]，但其作用機制目前尚未明了。隨著生物-心理-社會醫(yī)學模式的提出，以及神經(jīng)胃腸病學研究的發(fā)展，腦腸軸調(diào)控下的胃腸運動變化與泄瀉的發(fā)病機制相關[3-4]。本研究觀察四神丸對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠胃竇組織腦腸肽胃促生長素（Ghrelin）及其受體（GHSR）、鈣調(diào)素（CaM）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的影響，為揭示四神丸治療脾腎陽虛泄瀉的作用靶點提供實驗依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠72只，6～7周齡，體質(zhì)量（200±20）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物房。

1.2 藥物及制備

四神丸，北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司，批號14080012，研碎后過篩，用蒸餾水配制，濃縮成0.732、0.366、0.183 g/mL的混懸液，置于4 ℃冰箱備用；匹維溴銨片，法國蘇威制藥公司，批號637882，研碎后過篩，配制成1.523 mg/mL的藥液備用；腺嘌呤（Solarbio，Lot.No.617D051），配制成0.02 g/mL的懸濁液；番瀉葉，購于長沙老百姓大藥房，冷水浸1 h后加水煮沸約10 min，過濾濃縮成1.0 g/mL的藥液。

1.3 主要試劑與儀器

Ghrelin兔抗多克隆抗體（LSBIO，72557），GHSR兔抗多克隆抗體（Abcam，GR80260-1），CaM兔抗多克隆抗體（Abcam，GR56360-17），MLCK兔抗多克隆抗體（Abcam，GR125269-7），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Bioswamp），蛋白質(zhì)Marker（Thermo），PV-6001免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。CheemiDoc XRS+Imager化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio-rad），BX51顯微鏡和Image-Pro Express圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司），RM2235切片機（德國Laica公司），Lynx6000落地式高速離心機（美國Thermo Fisher），Pureloab Classic UVF超純水儀（法國ELGA Labwater）。

1.4 造模

參考文獻[5]方法造模。每只大鼠予0.2 g/kg腺嘌呤灌胃4周，并單、雙日交替喂養(yǎng)甘藍（10 g/只）和精煉豬油（2 mL/只），第3周起再灌服冰番瀉葉水浸劑2周。

1.5 分組和給藥

所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，先根據(jù)體質(zhì)量采用隨機數(shù)字法取12只作為正常組，不予造模，其余60只造模后再隨機分為模型組、陽性藥組和四神丸高、中、低劑量組，每組12只。四神丸高、中、低劑量組大鼠分別給予7.32、3.66、1.83 mg/（kg·d）灌胃（相當于成人等效劑量的4、2、1倍），陽性藥組給予匹維溴銨15.23 mg/（kg·d）灌胃，模型組給予等量蒸餾水，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。各組給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)14 d。

1.6 取材

各組大鼠末次給藥后10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，置于冰盒上迅速取出胃竇，剪取小段置于凍存管放入液氮中保存，另取小段用4%多聚甲醛固定保存。

1.7 觀察指標

1.7.1 免疫組化檢測胃竇組織胃促生長素的蛋白表達 將胃竇組織從多聚甲醛中取出，石蠟包埋，連續(xù)切片粘貼于載玻片上；然后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶；一抗用兔抗大鼠Ghrelin多克隆抗體（1∶8000），PBS替代一抗為陰性對照，4 ℃孵育過夜，DAB顯色3～5 min。脫水、透明、封片后用圖像分析系統(tǒng)拍攝200倍圖像，每張切片置400倍鏡下隨機選取陽性表達不重復的5個視野，采用圖像分析系統(tǒng)測定OD值。其值越大，反映蛋白表達量越高。

1.7.2 Western blot檢測胃竇組織胃促生長素受體、鈣調(diào)素和肌球蛋白輕鏈激酶的蛋白表達 將凍存胃竇組織取出，進行蛋白提取、定量，每孔上樣量為10 μg蛋白，行電泳、濕轉(zhuǎn)膜，分別加入一抗GHSR（1∶500）、CaM（1∶2000）、MLCK（1∶8000）和二抗，顯色后將膜置于化學發(fā)光系統(tǒng)中檢測，以目的條帶和GAPDH條帶的灰度比值作為蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四神丸對胃竇組織胃促生長素蛋白表達的影響

Ghrelin免疫陽性表達在胃竇組織呈棕黃色染色。與正常組比較，模型組胃竇組織Ghrelin蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組均可下調(diào)胃竇組織Ghrelin蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），且以四神丸高劑量組效果最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表1、圖1。

2.2 四神丸對胃竇組織胃促生長素受體、鈣調(diào)素和肌球蛋白輕鏈激酶蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組胃竇組織GHSR、CaM、MLCK蛋白表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組均可下調(diào)胃竇組織GHSR、CaM、MLCK的蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），且以四神丸高劑量組效果最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表2、圖2。

表1 各組大鼠胃竇組織Ghrelin蛋白表達比較（—x±s）

組別 只數(shù) 劑量/（mg/kg） Ghrelin

正常組 5 0.38±0.07

模型組 5 0.79±0.14##

陽性藥組 5 15.23 0.58±0.11△*

四神丸高劑量組 5 7.32 0.47±0.08△△

四神丸中劑量組 5 3.66 0.54±0.10△

四神丸低劑量組 5 1.83 0.65±0.11△*endprint

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；

與四神丸高劑量組比較，*P<0.05

正常組 模型組 陽性藥組 四神丸高劑量組 四神丸中劑量組 四神丸低劑量組

圖1 各組大鼠胃竇組織Ghrelin陽性表達（免疫組化染色，×200）

表2 各組大鼠胃竇組織GHSR、CaM、MLCK蛋白表達比較（—x±s）

組別 只數(shù) 劑量/（mg/kg） GHSR CaM MLCK

正常組 5 0.18±0.04 0.16±0.03 0.17±0.04

模型組 5 0.62±0.11## 0.59±0.09## 0.57±0.08##

陽性藥組 5 15.23 0.33±0.07△△* 0.27±0.05△△ 0.32±0.07△*

四神丸高劑量組 5 7.32 0.24±0.05△△ 0.20±0.04△△ 0.22±0.04△△

四神丸中劑量組 5 3.66 0.35±0.08△△* 0.31±0.06△△* 0.33±0.05△*

四神丸低劑量組 5 1.83 0.51±0.10△* 0.46±0.08△* 0.41±0.07△*

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與四神丸高劑量組比較，*P<0.05

A B C D E F

GHSR

41 kD

CaM 16 kD

MLCK 210 kD

GAPDH 36 kD

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性藥組；D.四神丸高劑量組；

E.四神丸中劑量組；F.四神丸低劑量組

圖2 各組大鼠胃竇組織GHSR、CaM、MLCK蛋白表達免疫印跡電泳圖

3 討論

腦腸軸異常機制在泄瀉的發(fā)病中起重要作用，胃腸活動可通過腦腸軸的影響而引起不同腦腸肽的反應來改變[6]。Ghrelin是日本科學家Kojima等首先在大鼠胃黏膜及下丘腦中發(fā)現(xiàn)的一種腦腸肽，Ghrelin及其受體GHSR主要分布于胃腸道，其具有調(diào)節(jié)胃腸運動、促進胃酸分泌、增進食欲、保護消化系統(tǒng)黏膜等重要功能[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin能促進大鼠胃排空、小腸推進及改善胃腸動力[8]；小鼠胃排空的延遲與GHSR缺乏有關[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性應激所致胃腸運動功能障礙小鼠血清Ghrelin水平降低[10]?，F(xiàn)代細胞生物學研究發(fā)現(xiàn)，興奮性腦腸肽Ghrelin對胃腸運動的調(diào)節(jié)作用與GHSR-G蛋白偶聯(lián)-Ca2+轉(zhuǎn)導密切相關[11]。胞內(nèi)三磷酸肌醇受體（IP3R）鈣通道的開放有賴于胞外腦腸肽等激動劑與其G蛋白偶聯(lián)受體結合后激活磷脂酶C（PLC），PLC使磷脂酰肌醇二磷酸水解產(chǎn)生IP3。IP3促使胞內(nèi)鈣庫打開，胃腸平滑肌細胞胞漿Ca2+濃度升高，Ca2+與CaM結合后形成Ca2+-CaM復合物激活MLCK，激活的MLCK催化肌球蛋白輕鏈上的絲氨酸-19磷酸化，導致肌球蛋白頭部的ATP酶活性增加，進而引起平滑肌收縮[12]。反之，一旦細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，Ca2+與CaM分離，MLCK活性降低，則引起平滑肌舒張。

泄瀉病位在腸，脾失健運是其關鍵，同時亦與腎臟密切相關。如《靈樞·邪氣臟腑病形》認為腎脈“小甚為洞泄”。在此認識的基礎上，后世明確提出了脾腎陽虛的五更泄瀉。基于“脾腎相關”理論，治當益火補土。《醫(yī)貫》指出：“命門之火旺，火能生土，而脾亦強。”《內(nèi)科摘要》之四神丸，君以補骨脂溫腎助陽、壯火益土、暖脾止瀉；臣以肉豆蔻溫中澀腸，佐以吳茱萸助陽止瀉，五味子收斂固澀。該方配伍精、藥力專，是治療脾腎陽虛型泄瀉的經(jīng)典名方。我們前期通過成功制作脾腎陽虛泄瀉大鼠模型[13]，進行了四神丸治療泄瀉的免疫學機制研究，證實了通過“以方（四神丸）測證（脾腎陽虛）”的效應機制來探討“脾腎相關”理論的科學內(nèi)涵這一思路的可行性。研究發(fā)現(xiàn)，四神丸對脾腎陽虛泄瀉大鼠的作用可能與調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子、白細胞介素（IL）-2、IL-4和外周血T細胞亞群水平有關[14-15]。

本研究結果顯示，脾腎陽虛泄瀉模型大鼠胃竇組織Ghrelin、GHSR、CaM和MLCK蛋白表達均明顯升高，表明模型大鼠胃排空出現(xiàn)亢進狀態(tài)。給藥后發(fā)現(xiàn)，四神丸高、中、低劑量均可不同程度下調(diào)Ghrelin、GHSR、CaM、MLCK的蛋白表達，且以四神丸高劑量組最為明顯，表明四神丸對胃竇的調(diào)節(jié)作用具有劑量依賴性。四神丸中劑量組上述指標改變與陽性藥組比較無明顯差異，提示四神丸對該模型大鼠的作用在中劑量上與西藥匹維溴銨片效果相當?；谝陨涎芯课覀兺茰y，四神丸可能通過調(diào)節(jié)Ghrelin-CaM-MLCK信號通路指標的表達而抑制胃腸蠕動，達到止瀉的目的。同時，本研究可為揭示四神丸治療脾腎陽虛泄瀉的腦腸肽作用機制提供借鑒。

參考文獻：

[1] 劉弼，陳萍，肖鵬，等.四神丸加味治療腹瀉型腸易激綜合征臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（3）：503-505.

[2] 張旖晴，蘇曉蘭，張曉紅，等.參苓白術散合四神丸加減治療脾腎陽虛泄瀉的臨床療效[J].陜西中醫(yī)，2016，37（6）：671-672.

[3] LONGSTRETH G F， THOMPSON W G， CHEY W D， et al. Functional bowel disorders[J]. Gastroenterology，2006，130（5）：1480-1491.

[4] 李寧寧，方秀才.腦-腸軸在腸易激綜合征發(fā)病中的作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2013，22（2）：163-166.endprint

[5] 陳志敏，潘新，張美，等.二神丸中藥物炮制前后對腸道菌群和UCP2基因表達影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（14）：6-9.

[6] 唐洪梅，房財富，廖小紅，等.神經(jīng)肽Y和5-羥色胺在腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠中表達的研究[J].中國藥理學通報，2012，28（7）：916- 920.

[7] AKAMIZU T， KANGAWA K. The physiological significance and potential clinical applications of ghrelin[J]. Eur J Intern Med， 2012，23（3）：197-202.

[8] 郝國強，張建生，費乃昕，等.Ghrelin對大鼠胃腸動力的影響[J].天津醫(yī)科大學學報，2008，14（1）：58-60.

[9] YANG C G， WANG W G， YAN J， et al. Gastric motility in ghrelin receptor knockout mice[J]. Mol Med Rep，2013，7（1）：83-88.

[10] 鄧娜，藺曉源，易健，等.四磨湯有效成分對慢性應激小鼠血清Ghrelin、NO、Leptin的影響[J].中醫(yī)藥導報，2014，20（3）：12-14.

[11] MUCCIOLI G， BARAGLI A， GRANATA R， et a1. Heterogeneity of ghrelin/growth hormone secretagogue receptors. Toward the understanding of the molecular identity of novel ghrelin/GHS receptors[J]. Neuroendocrinology，2007，86（3）：147-164.

[12] TANG Z， CHEN H， YANG J， et a1. The comparison of Ca2+/CaM-independent and Ca2+/CaM-dependent phosphorylation of myosin light chains by MLCK[J]. Physiol Res，2005，54（6）：671-678.

[13] 藺曉源，鄧娜，李霞，等.四神丸對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠實驗研究[J].中國中醫(yī)急癥，2016，25（5）：756-757.

[14] 蔡瑩，藺曉源，李玉潔，超微四神丸對泄瀉模型大鼠血清細胞因子的影響[J].中醫(yī)藥學報，2013，41（1）：80-81.

[15] 蔡瑩，藺曉源，鄧娜.超微四神丸對泄瀉模型大鼠T細胞亞群的影響[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2014，30（1）：12-14.

（收稿日期：2017-01-20）

（修回日期：2017-02-23；編輯：華強）endprint