陳宇熹,方振霞,雷美玲,吳藝嵐,張?jiān)轮?牛 蓉,葉 舟

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

黃曲霉毒素B1人工抗原的制備、鑒定與免疫特性研究

陳宇熹,方振霞,雷美玲,吳藝嵐,張?jiān)轮?牛 蓉,葉 舟?

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

采用EDC法制備獲得黃曲霉毒素B1人工抗原AFB1-BSA。對AFB1-BSA紫外掃描,結(jié)果表明其圖譜與黃曲霉毒素B1和BSA的圖譜有明顯差異,其紅外掃描結(jié)果與BSA的圖譜也有明顯差異,表明BSA與黃曲霉毒素B1偶聯(lián)成功。以不同摩爾比的AFB1-BSA人工抗原免疫小鼠,制備了特異性的鼠抗AFB1多克隆抗血清。綜合評價(jià)不同起始摩爾比反應(yīng)所得人工抗原的免疫特性和AFB1轉(zhuǎn)化率,當(dāng)AFB1與BSA的起始摩爾比為40∶1時(shí),AFB1與BSA的偶聯(lián)產(chǎn)物摩爾比為4.93∶1,AFB1的轉(zhuǎn)化率達(dá)12.33%；用間接ELISA法測其抗血清的效價(jià),經(jīng)過四次免疫之后,抗血清的效價(jià)最高,高達(dá)1∶1 056 000。

黃曲霉毒素B1；人工抗原；抗體血清；ELISA

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,簡稱AFB1)是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的主要次級代謝產(chǎn)物之一,是目前所發(fā)現(xiàn)的一類強(qiáng)毒性,強(qiáng)致畸致癌性的真菌毒素(Ono et al.,2001；馮廣鵬等,2007；黃向華等,2004；Busby et al.,1984；馬健等,2012)。在世界不同地區(qū),它對農(nóng)作物、食品和飼料造成的廣泛污染,已成為威脅人類以及動物健康的嚴(yán)重問題(Maria et al.,2000；Ponland et al.,1993；Brown et al.,1998；Charles et al.,2001)。進(jìn)一步加強(qiáng)對黃曲霉毒素B1的檢測,提高檢測效率,有助于預(yù)防和控制早期中毒事件的爆發(fā)(Lu et al.,2008；Cullen,2008),對保障食品安全和人畜健康具有重要的意義。

目前AFB1毒素的檢測有薄層層析法(馬俊,2013)、高效液相色譜法(Sani et al.,2013)、免疫親和柱層析法(謝芳等,2013)、ELISA法(Liu et al.,2013)、高靈敏度時(shí)間免疫分辨法(黃飚等,2006)等現(xiàn)代檢測方法(李響等,2013)。AFB1檢測試劑盒具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),備受青睞,但對于這種試劑盒的市場化開發(fā)需要AFB1抗體作為原料。黃曲霉毒素B1的分子量為312.3,是只有反應(yīng)原性而無免疫原性的小分子半抗原,不能通過刺激動物分泌抗體,只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、多聚氨基酸等載體蛋白連接成為大分子物質(zhì)才能轉(zhuǎn)化為具有免疫原性的完全抗原(Gathumbi et al.,2013)。提高AFB1人工抗原合成轉(zhuǎn)化率,選擇適宜的免疫途徑,獲得高效價(jià)AFB1抗體,成為AFB1檢測試劑盒市場化開發(fā)的重要技術(shù)難題。關(guān)于AFB1人工抗原合成方法已有報(bào)道(王磊等,2011；孫亞寧等,2010；王光建等,1995；Chu et al.,1977；江湖等,2005)。本研究采用EDC法合成了AFB1-BSA人工抗原,AFB1得到了較高的轉(zhuǎn)化率。用此不同摩爾比的人工抗原免疫小鼠,確立了適宜的免疫途徑,對產(chǎn)生最大效價(jià)的抗體進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃曲霉毒素B1、B2、G1標(biāo)準(zhǔn)品、陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)、羧甲氧基羥氨半鹽酸鹽(CMO)、碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、弗氏完全和非完全佐劑(Sigma公司)；羊抗鼠IgG∶HRP酶標(biāo)二抗(北京索萊寶科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

BALB/c小白鼠,健康雌性,6周齡,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.2 人工抗原的制備

1.2.1 AFB1肟的制備 參照江湖等(2005)方法,將2 mg AFB1與4 mg CMO溶解于400 μL吡啶中,25℃避光振搖反應(yīng)24 h,取出微量進(jìn)行TLC檢測。將反應(yīng)產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸干,所得固體加入3 mL超純水溶解,加入0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8.0,分3次加入苯(4 mL、3 mL、3 mL)振蕩萃取有機(jī)相中未肟化的AFB1。按照AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線(配制濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg·mL－1的 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過紫外掃描測定各濃度在特征吸收波長363 nm處的吸光度制作AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線),計(jì)算AFB1的肟化率；在水相中滴加0.1 mol·L－1稀鹽酸調(diào)至pH 3.0沉淀AFB1肟；用乙酸乙酯抽提沉淀物,旋轉(zhuǎn)蒸干即得純凈的AFB1肟。

1.2.2 AFB1肟與C-BSA偶聯(lián)物的制備 0.2 mg AFB1肟溶于100 μL DMF－水(6∶9,V/V)中,加入2 mg EDC避光混勻,再加入0.5%C-BSA溶液(BSA溶于0.13 mol·L－1的NaHCO3溶液)中,25℃避光100 r·min－1反應(yīng)4 h,再補(bǔ)加EDC 2 mg繼續(xù)反應(yīng)至24 h,將偶聯(lián)產(chǎn)物裝入透析袋,4℃環(huán)境下,在0.01 mol·L－1PBS(pH 7.4)中透析3 d(24 h更換一次透析液)。

1.2.3 反應(yīng)物起始摩爾比對偶聯(lián)比的影響 參照陳福生等(1998)方法,取1 mg AFB1,按1.2.1的方法制備AFB1肟,得到的肟分成5等份,調(diào)整C-BSA溶液濃度使之與AFB1的摩爾比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40及1∶50,按1.2.2中的方法制備AFB1肟與C-BSA的偶聯(lián)物。用甲醇－PBS(1 ∶1,V/V)為溶劑分別配制0.023 mg·mL－1的AFB1和2 mg·mL－1的 C-BSA,偶聯(lián)物也以甲醇－PBS(1∶1,V/V)為溶劑溶解,分別測定三種物質(zhì)在AFB1特征吸收波長(363 nm)處的吸光度值和C-BSA特征吸收波長(278 nm)處的吸光度值,計(jì)算得到AFB1363 nm摩爾消光系數(shù)(KAam)為7 373,278 nm摩爾消光系數(shù)(KAbm)為1 937；BSA 363 nm摩爾消光系數(shù)(KBam)為2 529,278 nm摩爾消光系數(shù)(KBbm)為44 538。ACam為偶聯(lián)物在363 nm處的吸光度值,ACbm為偶聯(lián)物在278 nm處的吸光度值,A、B兩物質(zhì)摩爾比如下。

1.3 人工抗原的結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.1 紫外－可見掃描光譜法鑒定 分別取少量的AFB1、C-BSA以及它們的偶聯(lián)產(chǎn)物,用甲醇－PBS(1∶1,V/V)配成溶液,在200－600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,分析掃描圖譜。

1.3.2 紅外－可見掃描光譜法鑒定 分別取少量BSA標(biāo)準(zhǔn)品、AFB1-BSA偶聯(lián)物與KBr混勻,在高壓紅外燈下烘干研磨制成溴化鉀片,在傅立葉紅外光譜儀上進(jìn)行掃描,分析掃描圖譜。

1.4 抗血清的制備

1.4.1 免疫方法 BALB/c小白鼠12只,分成5組,每組2只,同時(shí)設(shè)置陰性對照組2只。每只腹部皮下多點(diǎn)注射人工抗原100 μg·次－1,陰性對照組注射等體積的PBS溶液,間隔兩周免疫一次；第一次免疫時(shí),抗原與等體積的完全弗氏佐劑混合均勻,以后各次均和等體積的不完全弗氏佐劑混合,一共免疫5次。

1.4.2 抗血清的分離 免疫小鼠從每次免疫后的第14 d斷尾取血,血樣于室溫下放置1－2 h,12 000 r·min－1離心10－15 min,取上層血清,測效價(jià)并分裝,－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 間接非競爭ELISA測抗血清效價(jià) 用0.1 mol·L－1pH 9.5的碳酸鹽緩沖溶液稀釋AFB1-BSA人工抗原至2.5 μg·mL－1,每孔100 μL包被96孔酶標(biāo)板,4℃過夜,傾去包被液,PBST(含0.05%Tween-20,pH 7.2,0.1 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液)滿孔洗板三次,拍干；每孔200 μL 5%PBSM(5 g脫脂奶粉溶于100 mL PBS),37℃保溫保濕2 h,傾去封閉液,PBST洗板三次,拍干；加入100 μL以PBSM倍比稀釋的抗血清和陰性血清,同時(shí)用PBSM作為空白對照,37℃保溫保濕2 h,PBST洗板三次,拍干；每孔加入100 μL的羊抗鼠IgG∶HRP酶標(biāo)二抗(以PBSM作1∶2 000稀釋),37℃保溫保濕2 h,PBST洗板三次,拍干；每孔加100 μL反應(yīng)底物(4 mg鄰苯二胺加入10 mL底物緩沖液、10 μL H2O2,現(xiàn)配現(xiàn)用),37℃避光反應(yīng)15 min,每孔50 μL 2mol·L－1H2SO4終止反應(yīng),5 min后以空白對照孔調(diào)零,490 nm處測吸光度。

1.4.4 抗血清特異性的鑒定 參照張小鶯等(2011)方法,將AFB1-BSA人工抗原作適當(dāng)稀釋,與抗血清、昆明小鼠血清、健康家兔血清、BSA作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),同時(shí)用陰性血清作對照。

1.4.5 間接競爭ELISA法鑒定抗體靈敏度 2.5 μg·mL－1人工抗原AFB1-BSA包被酶標(biāo)板,每孔100 μL,4℃過夜,傾去包被液,PBST洗滌拍干；5%PBSM封閉,每孔200 μL,37℃保溫保濕 2 h,洗滌拍干。 配制 0、0.01、0.1、0.2、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 ng·mL－1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(20%甲醇－PBS溶解)。每孔依次加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL,抗血清(PBSM 稀釋 4 000倍)50 μL,反應(yīng)底物 100 μL,37℃避光反應(yīng) 15 min,每孔 50μL 2 mol·L－1H2SO4終止反應(yīng),5 min后以空白對照孔調(diào)零,490 nm處測吸光度。按已優(yōu)化的競爭反應(yīng)條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算AFB1對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)抑制率在50%時(shí)的濃度(I50)及最低檢測限(I10)。

1.4.6 間接競爭ELISA測抗血清與AFB2、AFG1的交叉反應(yīng)情況 按照1.4.5分別配置AFB2、AFG1標(biāo)準(zhǔn)溶液代替AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液,其它步驟相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的制備

2.1.1 AFB1肟的制備與AFB1轉(zhuǎn)化率 當(dāng)肟化反應(yīng)進(jìn)行至24 h,采用TLC法對肟化反應(yīng)進(jìn)行檢測,用氯仿－甲醇(9∶1,V/V)進(jìn)行展層。在其特征吸收波長363 nm紫外光激發(fā)下對產(chǎn)生的藍(lán)色熒光進(jìn)行分析,TLC展層結(jié)果(圖1)顯示,AFB1的Rf值為0.79,而AFB1肟的Rf值為0.28,AFB1肟在AFB1對應(yīng)處沒有熒光,表明反應(yīng)進(jìn)行完全。AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y＝0.0234x＋0.0085,R2＝0.9979；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AFB1轉(zhuǎn)化率高達(dá)94.2%。

2.1.2 反應(yīng)物起始摩爾比對偶聯(lián)比的影響 起始反應(yīng)物不同摩爾比所制備偶聯(lián)產(chǎn)物中AFB1與C-BSA摩爾比,結(jié)果見表1。AFB1與C-BSA起始摩爾比的增加,偶聯(lián)產(chǎn)物中AFB1與C-BSA摩爾比也相應(yīng)提高,AFB1的轉(zhuǎn)化率卻逐漸降低。

圖1 TLC法檢測肟化產(chǎn)物Figure 1 The test of AFB1-Oxime by TLC

表1 偶聯(lián)反應(yīng)起始摩爾比對偶聯(lián)產(chǎn)物摩爾比的影響Table 1 The influence of initial molar ratio on coupled production molar ratio

2.2 人工抗原的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 人工抗原紫外－可見掃描光譜法分析 AFB1、C-BSA、AFB1-BSA人工抗原的紫外掃描光譜結(jié)果見圖2。BSA是一種血清蛋白,在278 nm具有特征吸收峰,AFB1在363 nm處具有特征吸收峰。AFB1-BSA人工抗原同時(shí)具有AFB1和BSA兩者明顯的吸收峰,由于兩者的疊加效應(yīng),AFB1-BSA人工抗原吸收峰的位置有輕微的位移,由此判定,AFB1和BSA偶聯(lián)成功。

2.2.2 人工抗原紅外結(jié)構(gòu)分析 BSA、AFB1-BSA人工抗原的紅外掃描結(jié)果見圖3。BSA光譜顯示,3 400 cm左右為胺基振動產(chǎn)生,1 651 cm酰胺譜帶1,1 567 cm酰胺譜帶2；AFB1-BSA的紅外光譜顯示,除具有BSA的特征譜帶外,在1 100 cm附近具有AFB1肟結(jié)構(gòu)中的C-O-C鍵吸收峰,偶聯(lián)物在1 162 cm、1 077 cm顯示出明顯吸收峰。而1 760 cm處的香豆素環(huán)戍酮吸收峰、1 630 cm的C＝N特征峰由于受BSA吸收峰的影響表現(xiàn)并不明顯,表明所得產(chǎn)品不再是AFB1,而是AFB1肟。結(jié)果表明AFB1肟與BSA偶聯(lián)成功。

圖2 AFB1、C-BSA及其偶聯(lián)產(chǎn)物紫外掃描疊加圖Figure 2 The UV scaning absorbance spectrum of AFB1、C-BSA and their coupled production

圖3 BSA及AFB1-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物紅外結(jié)構(gòu)圖譜Figure 3 The infrared structure spectrum of BSA and AFB1-BSA coupled production

2.3 抗血清的研究

2.3.1 免疫小鼠抗血清效價(jià)檢測 采用間接非競爭ELISA測定小鼠抗血清效價(jià),以陽性孔的吸光度值大于陰性孔的2.1倍的最高稀釋倍數(shù)作為該抗體的效價(jià)。以免疫次數(shù),不同比例的人工抗原,抗體效價(jià)為坐標(biāo)軸,得到抗體效價(jià)三維變化柱形圖(圖4)。不同比例的人工抗原產(chǎn)生的抗體效價(jià)變化,結(jié)合AFB1-BSA人工抗原中AFB1的利用率,40∶1的人工抗原綜合效果最佳,經(jīng)過第四次免疫后,效價(jià)達(dá)到最大,為1 056 000,第五次開始降低。根據(jù)一般免疫規(guī)律,效價(jià)達(dá)到最大值之后就不會再升高而開始下降(王延華等,2005),因此不再增加免疫次數(shù)。

圖4 小鼠免疫效價(jià)變化三維柱形圖Figure 4 The three-dimensional column of mice immune titer

2.3.2 抗血清特異性的鑒定 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定抗血清的特異性,結(jié)果如表2。抗血清與AFB1-BSA之間出現(xiàn)清晰的沉淀線,而與昆明小鼠血清、健康家兔血清、BSA、陰性小鼠血清之間未出現(xiàn)沉淀線,說明抗血清對AFB1具有特異性。

表2 抗血清特異性鑒定結(jié)果1)Table 2 The evaluation results of antiserum specificity

2.3.3 抗血清中抗體靈敏度的鑒定 通過間接競爭ELISA法測抗體的靈敏度,以AFB1濃度的對數(shù)值Lgx為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制AFB1間接競爭抑制曲線(圖5)。濃度在0.1－6.25 ng·mL－1和12.5－200 ng·mL－1時(shí)有較好的線性關(guān)系,得到的標(biāo)準(zhǔn)線性方程分別為:y＝27.446x＋42.4,R2＝0.9965,n＝7；y＝7.6903x＋73.164,R2＝0.9962,n＝5。 計(jì)算靈敏度 I50＝1.9 ng·mL－1,最低檢測限 I10＝0.1 ng·mL－1。

2.3.4 抗血清的交叉反應(yīng) 通過間接競爭ELISA法,以AFB2、AFG1作為競爭抗原,檢測它們對小鼠抗血清的競爭抑制性,并測定AFB2、AFG1與AFB1之間的交叉反應(yīng)率。結(jié)果表明,AFB2、AFG1的靈敏度 I50分別為 13.8 ng·mL－1,17.1 ng·mL－1。 AFB1對抗血清的競爭抑制性最強(qiáng),記為100%,AFB2、AFG1的交叉反應(yīng)率分別為:13.77%、11.11%。說明本試驗(yàn)制備的AFB1-BSA人工抗原具有很好的靈敏度。

圖5 AFB1間接競爭ELISA抑制曲線Figure 5 The inhibitive curve of AFB1indirectly competing ELISA

3 小結(jié)與討論

本研究采用EDC法制備了不同摩爾比的AFB1-BSA人工抗原,在制備AFB1肟時(shí),江湖等(2005)前人采取冷凍干燥,由于吡啶的熔點(diǎn)比較低,對真空冷凍干燥機(jī)等設(shè)備的要求較高,本試驗(yàn)將反應(yīng)產(chǎn)物備AFB1肟進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸干,使試驗(yàn)更加可行。AFB1轉(zhuǎn)化為AFB1肟的轉(zhuǎn)化率高達(dá)94.2%,與江湖等(2005)、吳鑫茹等(2013)、魏繼濤等(2012)研究相比,AFB1得到了高效率的利用。

研究幾種不同摩爾比制備的人工抗原,不是摩爾比越高的人工抗原免疫效價(jià)越高,也不是AFB1轉(zhuǎn)化率越高的人工抗原免疫效價(jià)越高,需同時(shí)將不同摩爾比制備的人工抗原經(jīng)過一定的免疫程序進(jìn)行綜合比較,才能得到AFB1利用率高,效價(jià)高、特異性好的抗體,該評價(jià)方面目前尚未見相關(guān)報(bào)道。AFB1與BSA的起始反應(yīng)摩爾比為40∶1,得到人工抗原中AFB1與BSA的偶聯(lián)產(chǎn)物摩爾比為4.94∶1,經(jīng)過四次免疫得到血清效價(jià)高達(dá)1 056 000,高于孫秀蘭等(2007)、魏繼濤(2012)的研究結(jié)果,確立了適宜的免疫途徑。通過抗體靈敏度、特異性、交叉反應(yīng)的鑒定結(jié)果可以看出,抗血清效價(jià)高、特異性好,說明免疫方法成功,自制的人工抗原具有較好的抗原性。

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Preparation and identification and immunological properties of Aflatoxin B1artificial antigen

CHEN Yu-Xi,FANG Zhen-Xia,LEI Mei-Lin,WU Yi-Lan,Zhang Yue-Zhu,NIU Rong,YE Zhou?
(College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China)

Aflatoxin B1artificial antigen(AFB1-BSA)was prepared with EDC method.The results showed that the UV spectrum of AFB1-BSA was different from BSA and Aflatoxin B1obviously,and the IV spectrum was also different from BSA distinctly,all of which indicated that the preparation of AFB1-BSA was successful.BALB/c mice were immunized wth different molar ratio of AFB1-BSA artificial antigen,which made preparation of the specific polyclonal antiserum against AFB1.This paper comprehensively evaluated the immune characteristics of artificial antigens of different initial molar ratio and the utilization rate of AFB1.The artificial antigen was obtained with the molar ratio of 4.93∶1 and the AFB1utilization rate of 12.33%,when the initial molar ratio of Aflatoxin B1to C-BSA was 40∶1.BALB/c mice were immunized with AFB1-BSA for 4 times,and their titer antiserum from those mice were up to 1∶1 056 000 testified by indirect ELISA method.

aftatoxin B1；artificial antigen； antiserum；ELISA

TS201.3

A

1001－4276－(2017)01－0080－08

陳宇熹，方振霞，雷美玲，等，2017.黃曲霉毒素B1人工抗原的制備、鑒定與免疫特性研究[J].武夷科學(xué)，33:80-87.

2017－10－07。

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011J01077)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172297)；科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2011GB2C400012)。

陳宇熹(1984－)，女，助教。研究方向:生物農(nóng)藥。Email:liesleyu＠163.com。?

葉舟(1957－)，男，教授。研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)研究。Email:yezhou1182＠126.com。

(責(zé)任編輯:陳曉雯)