魏 斌，田一男，李 平，石 梅，曹雪峰，肖啟程，涂 蕊，但佳明，楊亭玉，彭廣能，鐘志軍，*

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130； 2.邛崍市農業(yè)和林業(yè)局，四川 邛崍 611530； 3.綿陽市經開區(qū)動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000)

犬瘟熱病毒原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

魏 斌1，田一男1，李 平2，石 梅3，曹雪峰1，肖啟程1，涂 蕊1，但佳明1，楊亭玉1，彭廣能1，鐘志軍1，*

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130； 2.邛崍市農業(yè)和林業(yè)局，四川 邛崍 611530； 3.綿陽市經開區(qū)動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000)

為建立一種不提取病毒RNA，直接采用TaqMan熒光定量RT-PCR檢測樣本上清液中犬瘟熱病毒的方法。通過擴增CDV的NP基因部分片段構建重組質粒，建立TaqMan熒光定量PCR方法，對所建立的方法進行特異性、敏感性、重復性檢測；比較了提取核酸后進行熒光定量RT-PCR與不提取核酸對原液進行熒光定量RT-PCR檢測的結果，最后對疑似CDV病料進行檢測。結果顯示，建立的CDV質粒TaqMan熒光定量PCR檢測靈敏度比普通PCR靈敏度高1 000倍。將核酸提取液和病毒原液稀釋后用該研究建立的方法進行檢測，最小檢測稀釋倍數分別為107和105，表明提取核酸后樣本中的有效cDNA濃度比直接使用病毒原液檢測高100倍。特異性和重復性檢測結果表明，該方法特異性良好且重復性較高。對97份臨床病料進行檢測，建立的方法共檢出60份陽性，陽性檢出率高于普通RT-PCR和膠體金快速檢測試紙板，提取核酸法與原液法的一致率為100%。標準曲線分析表明，當病毒含量高于102拷貝·μL-1時，與普通RT-PCR以及膠體金快速檢測試紙板相比，CDV原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測技術陽性檢出率更高、準確性更好，值得臨床推廣應用。

犬瘟熱病毒；病毒原液；TaqMan熒光定量RT-PCR；特異性；重復性

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(caninedistempervirus，CDV)引起的一種對寵物犬以及經濟毛皮動物(貂、狐)等造成嚴重危害的疾病。該病呈世界性分布，死亡率達80%～90%，1997年《中華人民共和國動物防疫法》將其列為三類動物疫病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CD的發(fā)生率隨著人口的增加逐年增加[2]。CDV在中國的感染率也呈上升趨勢，近年來，在江蘇、四川、黑龍江、云南等地均有CDV流行的報道[3-6]。CDV不僅可感染犬，還可感染浣熊、大熊貓以及靈長類動物猴子等[3，5，7-9]。有試驗表明，CDV可感染人源細胞，提示CDV存在感染人的潛在風險[10]。因此，對CDV的準確診斷在臨床中具有重要意義。

目前，中國臨床中對CDV的檢測主要以獸醫(yī)師經驗診斷以及膠體金快速檢測試紙板為主，但犬冠狀病毒、犬輪狀病毒、犬腺病毒-1型和犬腺病毒-2型在犬中也可引起同犬瘟熱一樣的癥狀，膠體金快速檢測試紙板的準確性低且易出現(xiàn)假陽性，導致臨床診斷出現(xiàn)誤差，需要借助實驗室診斷進行確診[11-15]。目前，CDV常用的實驗室檢查技術主要包括ELISA、血清中和試驗、病毒的分離培養(yǎng)以及RT-PCR[16]，但是這些方法均易受影響且靈敏性較低[17]。RT-PCR擴增是CDV常用的實驗室檢測方法，常規(guī)RT-PCR方法操作復雜耗時長，臨床樣品中的一些抑制劑會對其產生影響且特異性較低[18]。因此，建立一種簡單、快速、準確檢測CDV的方法具有重要意義。

熒光定量RT-PCR由于其檢測的準確性和操作的簡便性逐漸成為代替普通RT-PCR對病毒進行檢測的方法。TaqMan熒光定量RT-PCR已廣泛用于貓細小病毒、犬細小病毒(canineparvovirus, CPV)和CDV等病原的檢測[16，17，19]。近年來，有學者嘗試使用TaqMan實時熒光定量PCR對臨床中的病原進行檢測，整個檢測過程不提取核酸以提高檢測效率和減少檢測成本[20-25]。本試驗嘗試建立一種直接采用臨床樣本原液檢測CDV的TaqMan熒光定量RT-PCR技術，檢測過程不提取樣本核酸，為臨床快速準確診斷CDV提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與試劑

CDV陽性株、犬狂犬病病毒(Rabiesvirus， RABV)陽性株、犬腺病毒Ⅰ型(Canine Adenovirus Type 1，CAV-1)陽性株、犬腺病毒Ⅱ型(Canine Adenovirus Type 2，CAV-2)陽性株、犬副流感病毒(Canineparainfluenzavirus，CPIV)陽性株(CPIV/A-20-8)、CPV陽性株均由本課題組分離鑒定并保存[26]。CDV在Vero細胞中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)基選用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Sigma，Saint Louis，Mo，USA)。

病毒RNA/DNA小量提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，核酸凝膠回收試劑盒及高純質粒小量制備試劑盒購自厚生生物科技有限公司，pEASY-T1 Simple Cloning Vector購自北京全式金生物技術有限公司，熒光定量PCR反應試劑盒(one step probe PCR master mix)和大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司，核酸染料、瓊脂糖、生化試劑等購自生工生物工程(上海)股份有限公司，陽性對照為本課題組分離保存的CDV毒株核酸，陰性對照為無菌水。

1.2 臨床病料

97份病料取自四川農業(yè)大學獸醫(yī)院門診病例中疑似犬CDV的病例，將其口鼻分泌物及尿液混于裝有1.0 mL PBS的1.5 mL離心管中，震蕩混勻后，5 000g離心5 min，收集上清備用。所有臨床樣本采集后置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒核酸的提取

文中所涉及的相關病毒核酸，均使用病毒核酸提取試劑盒從200 μL細胞培養(yǎng)液或臨床病料提取，提取后的核酸置于-70 ℃保存。

1.4 引物設計與合成

對Gen Bank提交的CDV核衣殼蛋白(NP)基因序列(基因登錄號：KJ466106)進行比對，設計CDV熒光定量RT-PCR引物和TaqMan通用探針。引物序列分別為qPCR-F: 5’ - AGGTCTCGACTATTGGATAGACTT-3’，qPCR-R: 5’-CGAACAAGGAGAGGATACTGAT-3’，探針為qPCR-probe: FAM-5’-ATTGGTTGGTGATCCGAAAATCAAC-3’-BHQ1，擴增片段長度為100 bp。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 重組質粒標準品的制備

按照病毒RNA/DNA小量提取試劑盒說明書提取CDV陽性毒株RNA，然后以RNA為模板，使用RT-PCR特異性引物進行RT-PCR擴增。25 μL CDV RT-PCR反應體系：Master Mix 12.5 μL，RNA模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，Quant RTase 0.4 μL，ddH2O 8.1 μL。反應條件：50 ℃反轉錄30 min，92 ℃逆轉錄酶失活3 min；92 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，68 ℃ 20 s，40個循環(huán)；68 ℃ 7 min。用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳對產物進行鑒定。

回收100 bp的NP基因片段，將回收產物和pEASY-T1 Simple載體連接，轉入DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細胞，菌液過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，菌落進行振蕩培養(yǎng)并提取質粒。PCR鑒定重組質粒，測序正確的陽性重組質粒作為本試驗CDV質粒熒光定量PCR方法的標準品。用核酸測定儀對該標準品進行濃度測定。

1.6 CDV質粒熒光定量PCR標準曲線的制作

將CDV重組質粒標準品進行10倍倍比稀釋(10～107)，以此為模板進行熒光定量PCR擴增。25 μL CDV質粒PCR反應體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，質粒模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，探針(5 μmol·L-1)1.0 μL，HotMasterTaqpolymerase 1.0 μL，ddH2O 7.5 μL。反應條件：92 ℃ 3 min；92 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s;68 ℃ 20 s，40個循環(huán)，68 ℃ 7 min。以質粒濃度為橫坐標，以Ct值為縱坐標，制作標準曲線。

1.7 CDV質粒熒光定量PCR特異性試驗

以CDV陽性株、RABV陽性株、CAV-Ⅰ陽性株、CAV-Ⅱ陽性株、CPIV陽性株、CPV陽性株的核酸為模板，病毒培養(yǎng)液為陰性對照，對模板進行50 ℃反轉錄30 min。然后用1.6節(jié)的方法進行檢測，以檢測該方法的特異性。

1.8 CDV質粒熒光定量PCR敏感性試驗

將CDV重組質粒進行10倍倍比稀釋后作為模板，用所建立的方法和普通PCR方法進行檢測，檢測該方法的敏感性。

1.9 CDV質粒熒光定量PCR重復性試驗

將CDV陽性質粒標準品進行稀釋，取同一批次3個不同梯度(稀釋倍數102、104、106)的標準品為模板，用所建立的方法進行組內和組間重復性試驗，并計算其組內及組間變異系數，評價該方法的重復性。

1.10 CDV核酸及病毒原液熒光定量RT-PCR比較

將CDV病毒培養(yǎng)液上清及其核酸10倍倍比稀釋后，用所建立的方法進行檢測。25 μL CDV RT-PCR反應體系：2×Quant One Step Probe qRT-PCR Master Mix 12.5 μL，病毒培養(yǎng)液上清或RNA模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，探針(5 μmol·L-1)1.0 μL，HotMasterTaqpolymerase 1.0 μL，Quant RTase 0.4 μL，ddH2O 7.1 μL，反應條件：50 ℃反轉錄30 min，92 ℃逆轉錄酶失活3 min；92 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s;68 ℃ 20 s，40個循環(huán)；68 ℃ 7 min。比較原液及核酸的初始核酸濃度差異及兩者的最小檢測濃度。

1.11 臨床樣品檢測

將收集的97份疑似CDV臨床樣品分別使用膠體金快速檢測試紙板、普通RT-PCR、熒光定量RT-PCR及本研究建立的熒光定量RT-PCR進行檢測，設置陽性對照和陰性對照，對檢測結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 CDV質粒標準品

CDV陽性毒株提取RNA后進行RT-PCR擴增，擴增出預期目標大小產物。產物經膠回收、連接、轉化、陽性克隆菌培養(yǎng)、提取質粒后，經PCR、酶切鑒定及測序，成功構建了重組質粒標準品(圖1)。經測定，該質粒標準品的濃度為4.20×108拷貝·μL-1。

2.2 CDV質粒熒光定量PCR標準曲線

CDV重組質粒標準品進行10倍連續(xù)梯度稀釋后進行熒光定量PCR擴增，得到相應的動力學曲線(圖2-A)和標準曲線(圖2-B)，核酸初始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關系，決定系數R2=0.999 5。

2.3 CDV質粒熒光定量RT-PCR特異性

利用所建立的方法檢測RABV、CPIV、CAV-Ⅰ、CAV-Ⅱ、CPV及CDV核酸，結果(圖3)顯示，只有CDV核酸出現(xiàn)擴增曲線，其余病毒均無特異性擴增信號，表明該方法檢測CDV的特異性較好。

2.4 CDV熒光定量PCR的敏感性

將CDV重組質粒進行10倍連續(xù)梯度稀釋后，用所建立的方法進行檢測。結果表明，該方法可檢測出稀釋至107的CDV模板(圖4-A)，其最低檢出濃度為10拷貝·μL-1，而普通PCR僅能檢出104拷貝·μL-1(圖4-B)，表明CDV質粒熒光定量PCR比普通PCR的敏感性高1 000倍以上。

M，DL 2 000 Marker；1，重組質粒標準品；2，陽性對照；3，陰性對照M， DL 2 000 Marker; 1， Recombinant plasmid standard fragment; 2， Positive control; 3， Negative control圖1 CDV標準品目的片段的RT-PCR擴增Fig.1 Amplification of CDV standard fragment by RT-PCR

A: 1～7, CDV重組標準質粒等倍稀釋10～107A: 1-7, Serial 10-fold CDV standerd plasmid dilutions 10-107圖2 熒光定量PCR標準質粒動力學曲線(A)和標準曲線(B)Fig.2 The dynamic curves (A) and standard curves (B) of CDV standard plasmid by TaqMan fluorescent quantitative PCR

1，CDV核酸；2，犬細小病毒陽性株；3，犬腺病毒Ⅰ型陽性株；4，犬腺病毒Ⅱ型陽性株；5，犬狂犬病病毒陽性株；6，犬副流感陽性株1， CDV nucleic acids; 2， CPV nucleic acids; 3， CAV-1 nucleic acids; 4， CAV-Ⅱ nucleic acids; 5， RABV nucleic acids; 6， CPIV nucleic acids圖3 CDV熒光定量RT-PCR的特異性Fig.3 Specificity of the fluorescent quantitative RT-PCR for CDV detection

2.5 CDV標準質粒熒光定量PCR的重復性

取CDV標準質粒的3個不同梯度(4.2×106、4.2×104、4.2×102拷貝·μL-1)為模板進行批內及批間試驗，每個樣品重復3次。結果顯示，CDV批內及批間變異系數均小于1.2%(表1)，說明CDV熒光定量PCR重復性好，可進行穩(wěn)定、可靠的檢測。

A: 1～9分別為標準質粒等倍稀釋10～109；10，陰性對照。B: M，DL 2 000 DNA Marker；1～7，標準質粒等倍稀釋10～107；8，陰性對照A: 1-9， Serial 10-fold standard plasmid dilutions 10-109; 10， Negative control. B: M， DL 2000 Marker; 1-7， Serial 10-fold standard plasmid dilutions 10-107; 8， Negative control圖4 CDV標準質粒熒光定量PCR(A)和普通PCR(B)的敏感性Fig.4 Sensitivity of TaqMan fluorescent quantitative PCR (A) and ordinary PCR (B) for detecting CDV

表1CDV標準質粒熒光定量PCR的重復性

Table1Intra-batch and inter-batch coefficient variant (CV) of the TaqMan fluorescent quantitative PCR for CDV

樣品濃度Sampleconcentration/(copies·μL-1)批內重復Intra-batchCt平均值Average方差Variance變異系數CV/%批間重復Inter-batchCt平均值Average方差Variance變異系數CV/%4.20×10614.010.0241.1114.060.0211.024.20×10420.100.0230.7620.260.0240.774.20×10226.090.0260.6226.140.0140.45

2.6 CDV核酸及病毒原液熒光定量RT-PCR檢測比較

上述建立的CDV質粒熒光定量PCR檢測結果顯示，提取的CDV核酸濃度約為6.23×108拷貝·μL-1，CDV病毒原液濃度約為2.28×106拷貝·μL-1，提取核酸后其樣本中的有效cDNA濃度比直接使用病毒原液進行檢測提高了100倍。由圖5可知，CDV核酸的最低檢出濃度約為9.56×10拷貝·μL-1(稀釋107倍)，CDV病毒原液的最低檢出濃度約為7.77×10拷貝·μL-1(稀釋105倍)。結合CDV核酸與病毒原液濃度可知，采用本研究建立的方法，病毒原液的檢測靈敏度高于CDV核酸樣本。

2.7 臨床樣品的檢測

用CDV原液熒光定量PCR方法對采集的97份臨床病料原液進行檢測，并且與膠體金快速檢測試紙板、普通RT-PCR以及核酸熒光定量RT-PCR進行比較。結果顯示，膠體金快速檢測試紙板、普通RT-PCR、核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR方法檢測CDV陽性結果分別為：31份(31.96%)、43份(44.33%)、60份(61.86%)、60份(61.86%)。由此可知，核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR均表現(xiàn)出較高的陽性檢出率。進一步分析發(fā)現(xiàn)，膠體金快速檢測試紙板檢測的31份陽性樣品，原液熒光定量RT-PCR均檢測為陽性；普通RT-PCR檢測的43份陽性樣品，原液熒光定量RT-PCR均檢測為陽性；核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR的檢測結果完全一致，60份樣品均檢測為陽性。膠體金快速檢測試紙板檢測的66份陰性樣品中，常規(guī)RT-PCR檢測出54份陰性，而核酸熒光定量RT-PCR和原液熒光定量RT-PCR均檢測出37份陰性，表明原液熒光定量RT-PCR和核酸熒光定量RT-PCR比膠體金快速檢測試紙板、常規(guī)RT-PCR的檢出率高，且結果準確可靠。

A: 1～9，CDV RNA等倍稀釋10～109；B: 1～7，CDV病毒原液等倍稀釋10～107A: 1-9， Serial 10-fold CDV RNA dilutions 10-109; B: 1-9， Serial 10-fold CDV viral stock dilutions 10-107圖5 CDV RNA(A)及CDV病毒原液(B)熒光定量RT-PCR的敏感性Fig.5 Sensitivity of CDV RNA (A) and CDV viral stock (B) by the TaqMan fluorescent quantitative RT-PCR

3 討論

CDV檢測方法眾多，既包括病毒的分離培養(yǎng)、電鏡觀察，也包括以膠體金快速檢測試紙板為代表的免疫學檢測技術，同時RT-PCR、斑點雜交技術[16，27]等分子生物學技術也在診斷中廣泛應用，然而這些技術存在操作不便、費時、靈敏性較低等問題[17]。因此，建立一種針對CDV的快速、簡便、準確的熒光定量RT-PCR檢測方法對CDV的診斷具有重要意義。與傳統(tǒng)RT-PCR相比，熒光定量RT-PCR具有特異性強、重復性好、定量準確、PCR產物污染小、自動化程度高等優(yōu)點[28]。熒光定量RT-PCR包括染料法和探針法，前者的原理是熒光染料結合雙鏈DNA分子，通過釋放熒光信號進行定量檢測[29]，它會非特異性地與雙鏈DNA分子結合，從而產生假陽性信號；而對于復雜的檢測環(huán)境，更加容易出現(xiàn)非特異性擴增，進一步增加假陽性的發(fā)生[30]。本試驗采用的是TaqMan探針法，該方法需要引物、探針特異地與模板結合，增加了探針的識別步驟，使其敏感性和特異性都得到了較大的提高，在病原檢測中已被廣泛應用[28，31-32]。

近年來，一種不提取病毒核酸的TaqMan熒光定量(RT-)PCR檢測病原的方法陸續(xù)被報道，該方法省時、易操作。Nakamichi等[33]采用不提取核酸的熒光定量PCR方法對JCV病毒(Johncunninghampolyomavirus)進行檢測，發(fā)現(xiàn)該方法可檢測的病毒含量為103拷貝·μL-1；Ihira等[34]采用不提取病毒DNA建立的環(huán)介導等溫擴增方法對人6型皰疹病毒(Human herpesvirus 6)進行檢測，結果表明，該方法可檢測的病毒量為10拷貝·tube-1；Baethgen等[23]使用不提取核酸PCR方法直接檢測腦膜炎球菌，結果顯示最小檢測量為2×102cfu·mL-1；Nishimura等[24]使用不提取核酸的熒光RT-PCR對諾如病毒(Norovirus)進行檢測，該方法可檢測的GII/4及基因型未定的GII病毒含量分別為106、105拷貝·g-1。以上研究均表明，不提取核酸的熒光定量(RT-)PCR用于臨床樣品中的病毒以及細菌的檢測是一種切實可行的方法。

基于以上研究，本試驗首次采用病毒上清液直接對CDV進行熒光定量RT-PCR檢測。所建立的CDV質粒熒光定量PCR方法在相同稀釋濃度下敏感性和特異性更高，重復性好，敏感性可達10拷貝·μL-1，檢測靈敏度比普通PCR高1 000倍，并且對CPV、CAV-1、CAV-2、RABV以及CPIV無擴增，批內及批間變異系數均小于1.2%，表明檢測結果可靠穩(wěn)定。CDV核酸及病毒原液熒光定量RT-PCR比較結果顯示，提取核酸后樣本中有效cDNA濃度比直接使用病毒原液檢測高100倍，當樣本中病毒含量高于102拷貝·μL-1時，本試驗建立的方法能檢測出樣本中的CDV。CDV臨床樣本進行檢測結果表明，熒光定量RT-PCR在10～107拷貝·μL-1具有良好的線性關系，實用性較強。對97份臨床樣本的病毒原液進行病毒含量檢測，與標準曲線對比后發(fā)現(xiàn)，樣本原液中的CDV含量均高于103拷貝·μL-1，表明本試驗建立的CDV原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方便、省時且特異性高。當病毒含量高于102拷貝·μL-1時，本試驗所建立的CDV原液TaqMan熒光定量RT-PCR檢測與膠體金檢測法和普通RT-PCR法相比，具有更高的陽性檢出率，可用于臨床檢測和實驗室病毒鑒定。原液熒光定量RT-PCR與核酸熒光定量RT-PCR檢測結果完全一致，表明在CDV的定性檢測中可直接使用所采集的病料原液進行熒光定量RT-PCR檢測。

本試驗中，我們對臨床樣本或病毒培養(yǎng)液上清的CDV進行檢測。結果表明，對樣本原液或病毒培養(yǎng)液上清采用不提取核酸的熒光定量RT-PCR檢測CDV是可行的。筆者認為不提取核酸能直接檢測出CDV病毒，原因可能有以下幾種：首先，臨床采集的樣本或病毒培養(yǎng)液中存在從細胞中溢出的病毒核酸以及細胞死亡后釋放的病毒核酸；其次，樣本在處理過程中進行了高速離心5 min的步驟，此過程可能導致了病毒核酸的部分釋放；最后，TaqMan探針熒光定量RT-PCR具有非常高的檢測靈敏度，本試驗結果表明檢測靈敏度可達10拷貝·μL-1數量級。

綜上所述，與常規(guī)RT-PCR、膠體金快速檢測試紙板相比，本研究建立的不提取核酸熒光定量RT-PCR法檢測結果與提取核酸后進行RT-PCR檢測結果相一致。敏感性和特異性試驗表明，所建立的方法能用于臨床樣本的檢測，操作簡便省時，對于CDV的早期診斷、預防控制等具有重要意義。

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(責任編輯侯春曉)

EstablishmentofTaqManfluorescentquantitativeRT-PCRassayfordetectionofCaninedistemperviruswithoutnucleicacidextraction

WEI Bin1， TIAN Yi’nan1， LI Ping2， SHI Mei3， CAO Xuefeng1， XIAO Qicheng1， TU Rui1， DAN Jiaming1， YANG Tingyu1， PENG Guangneng1， ZHONG Zhijun1，*

(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.AgriculturalandForestryBureauofQionglai，Qionglai611530，China; 3.CenterforDiseaseControlandPreventionofMianyang，Mianyang621000，China)

To establish a direct TaqMan fluorescent quantitative RT-PCR (direct-qRT-PCR) method without extracting nucleic acid for detectingcaninedistempervirus(CDV). Specificity， sensitivity and reproducibility of the method were tested by using constructed recombinant plasmid. Fluorescence quantitative RT-PCR was used to compare the detection limitation in both the nucleic acid extraction and the viral stock. Clinical samples were also collected and applied for verification the established method. Our results showed that the sensitivity of this method was 1 000 times higher than ordinary PCR. Nucleic acid extraction and viral stock was detected by the established method， the minimum detectable dilution times were 107and 105， respectively， indicated that the effective cDNA concentration in the sample after nucleic acid extraction was 100 times higher than that using viral stock to test. Specificity and reproducibility results showed that the method had good specificity and reproducibility. 97 clinical samples were detected by this method， 60 samples showed positive. The detectable rate of this method was higher than those of ordinary RT-PCR and colloidal gold rapid detection plate. The positive detectable rate using nucleic acid extraction was perfectly matched with that using viral stock. Compared with ordinary RT-PCR and colloidal gold rapid detection plate， standard curve showed direct-qRT-PCR had high accuracy and positive detectable rate while the virus concentration was higher than 102copies·μL-1， and it was worthy of clinical application.

caninedistempervirus; viral stock; TaqMan quantitative RT-PCR; specificity; reproducibility

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.07

2017-04-26

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0501009)；國家自然科學基金項目(31000548)；成都大熊貓繁育研究基金會項目(CPF2015-4)

魏斌(1992—)，女，山西平遙人，碩士研究生，從事獸醫(yī)臨床病理學與分子診斷學。E-mail: 865360412@qq.com

*通信作者，鐘志軍，E-mail: zhongzhijun488@126.com

S855.3

A

1004-1524(2017)11-1819-08