張 揚(yáng)，陳博雯，卞友慶，王兆山， 徐 琪，常國(guó)斌，陳國(guó)宏，*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇現(xiàn)代畜牧科技園，江蘇 泰州225300；3.江蘇益客食品有限公司，江蘇 宿遷 223800)

噪聲對(duì)肉鴨內(nèi)臟組織熱休克蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

張 揚(yáng)1，陳博雯1，卞友慶2，王兆山3， 徐 琪1，常國(guó)斌1，陳國(guó)宏1，*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇現(xiàn)代畜牧科技園，江蘇 泰州225300；3.江蘇益客食品有限公司，江蘇 宿遷 223800)

為闡明噪聲對(duì)肉鴨的生理影響，提高肉鴨的動(dòng)物福利，試驗(yàn)將60只北京鴨隨機(jī)分成3組，利用噪聲發(fā)生器進(jìn)行80 dB(處理組1)和100 dB(處理組2)的噪聲應(yīng)激，對(duì)照組不進(jìn)行應(yīng)激。應(yīng)激結(jié)束后采集肝臟、脾臟、肺和腎臟組織，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組織中HSP70、HSP90 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示：處理組鴨肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等4個(gè)組織中HSP70、HSP90 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組，且處理組2的HSP70、HSP90 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.01)高于處理組1。表明急性噪聲應(yīng)激會(huì)使得肉鴨內(nèi)臟組織的HSPs mRNA轉(zhuǎn)錄增加。

噪聲應(yīng)激；肉鴨；HSP70；HSP90

隨著集約化高密度飼養(yǎng)模式的廣泛應(yīng)用，家禽在飼養(yǎng)過(guò)程中對(duì)各種應(yīng)激的敏感性逐漸增強(qiáng)，加上近年來(lái)H7N9事件的發(fā)生，活禽市場(chǎng)紛紛關(guān)閉，肉鴨集中屠宰已成必然，而在屠宰場(chǎng)，往往伴隨著強(qiáng)烈的噪聲。噪聲對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)是一種潛在的應(yīng)激源。早在1978年已有噪聲對(duì)動(dòng)物健康有顯著的負(fù)面影響的報(bào)道[1]，并且有大量的研究已經(jīng)證實(shí)噪聲對(duì)于豬、牛和人等都有強(qiáng)烈的應(yīng)激[2-4]。從表面上來(lái)看噪聲會(huì)對(duì)家禽的生產(chǎn)性能和行為產(chǎn)生不利的影響，但關(guān)于噪聲作為應(yīng)激源在家禽(特別是水禽)上的研究卻很少。

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是細(xì)胞受到各種理化因素刺激后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的一組保護(hù)性蛋白，這些蛋白廣泛存在于生物界的原核及真核生物細(xì)胞中，具有高度保守性。在應(yīng)激狀態(tài)下HSPs的量發(fā)生劇烈變化，保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷，因此HSPs的表達(dá)水平可以作為一個(gè)潛在的環(huán)境應(yīng)激的生物標(biāo)志物[5]。HSP70是HSPs含量最多、最重要的分子之一，它具有分子伴侶作用、抗氧化作用、抗細(xì)胞凋亡、增加熱耐受和參與細(xì)胞周期調(diào)控等多種生物學(xué)功能[6]；HSP90也是HSP家族中重要成員之一，在應(yīng)激損傷、腫瘤、自身免疫性等疾病治療中發(fā)揮重要作用[7]。本研究以北京鴨為試驗(yàn)對(duì)象，模擬屠宰場(chǎng)急性噪聲強(qiáng)度，利用Real-time PCR技術(shù)測(cè)定噪聲應(yīng)激后鴨內(nèi)臟組織的HSP70、HSP90 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，探討急性噪聲應(yīng)激對(duì)HSPs mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，旨在為進(jìn)一步研究減少肉鴨屠宰應(yīng)激、提高動(dòng)物福利提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

選取1日齡健康的北京鴨60只，隨機(jī)分為3個(gè)組：80 dB的噪聲應(yīng)激20 min(處理組1)、100 dB的噪聲應(yīng)激20 min(處理組2)和對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只。試驗(yàn)肉鴨采用室內(nèi)圈養(yǎng)，飼養(yǎng)管理按《瘦肉型商品代北京鴨飼養(yǎng)管理規(guī)程》進(jìn)行。

1.2 噪聲應(yīng)激試驗(yàn)

42日齡出欄時(shí)進(jìn)行應(yīng)激，噪聲應(yīng)激前不禁食不禁水。利用噪聲發(fā)生器(型號(hào)TD0005，民泰儀器行)對(duì)處理組1、處理組2分別進(jìn)行80 dB和100 dB的噪聲應(yīng)激，應(yīng)激持續(xù)20 min。

1.3 樣品制備

應(yīng)激結(jié)束后采用頸部放血法屠宰肉鴨并迅速采取肝臟、脾臟、肺和腎臟等組織于液氮中冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)試劑

RNA抽提試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；反轉(zhuǎn)錄與PCR試劑購(gòu)于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.5 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank中關(guān)于紹興鴨HSP70、HSP90的引物序列和鴨GAPDH(登錄號(hào)：AY436595.1)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物：

qHSP70 F: 5′-CCCCCAGATCGAGGTTACTTT-3′；

qHSP70 R: 5′-CTCCCACCCGATCTCTGTTG-3′。

qHSP90 F: 5′-CCTTCAGCTGCTGCACACA-3′；

qHSP90 R: 5′-CGCATCTGGTGATGAAATGG-3′。

β-actinF: 5′-ATGTCGCCCTGGATTTCG-3′；

β-actinR: 5′-CACAGGACTCCATACCCAAGAA-3′。

1.6 RT-PCR 反應(yīng)

采用Trizol法抽提各組織RNA，cDNA的合成總反應(yīng)體系：10×Fast RT Buffer 4 μL，RT Enzyme Mix 2 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 4 μL，Rnase-Free ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，4 ℃保存。將得到的cDNA模板按10倍梯度稀釋后，計(jì)算每對(duì)引物PCR擴(kuò)增效率，實(shí)時(shí)熒光定量操作參照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，并采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1噪聲應(yīng)激對(duì)HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖1可知，經(jīng)80 dB噪聲應(yīng)激20 min后，肝臟、脾臟、肺和腎臟等4個(gè)組織的HSP70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平都比空白組要極顯著提高(P<0.01)；100 dB噪聲應(yīng)激20 min后，上述4個(gè)組織的HSP70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于80 dB噪聲應(yīng)激組和對(duì)照組(P<0.01)。

2.2噪聲應(yīng)激對(duì)肉鴨內(nèi)臟組織HSP90 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖2可知，在80 dB的噪聲應(yīng)激下，處理組1與處理組2的肉鴨肝臟、脾臟、肺和腎臟4個(gè)組織中的HSP90 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平都極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且處理組2極顯著高于處理組1，即在100 dB的噪聲應(yīng)激下，4個(gè)組織的HSP90 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于80 dB噪聲應(yīng)激組。

**表示差異極顯著(P<0.01)。下同**showed extremely significant difference (P<0.01). The same as bellow圖1 噪聲應(yīng)激對(duì)肉鴨內(nèi)臟組織HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.1 Influence of noise on HSP70 mRNA transcription in internal organs of meat duck

圖2 噪聲應(yīng)激對(duì)肉鴨內(nèi)臟組織HSP90 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.2 Influence of noise on HSP90 mRNA transcription in internal organs of meat duck

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在80 dB和100 dB的噪聲應(yīng)激20 min后，肉鴨的肝臟、脾臟、肺和腎臟等4個(gè)組織的HSP70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.01)升高，這跟在肉雞上獲得的研究結(jié)果一致[8]。HSP70 mRNA的表達(dá)產(chǎn)物HSP70可作為抗原分子載體，也可誘導(dǎo)HSP的產(chǎn)生并協(xié)同參與抗原加工、呈遞，并利用自身的抗原特異性為T(mén)細(xì)胞免疫識(shí)別導(dǎo)航[9]?，F(xiàn)在一般認(rèn)為HSP70的高表達(dá)有利于動(dòng)物的自我保護(hù)機(jī)能，增強(qiáng)對(duì)外界不良刺激的抵抗力[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果充分表明，肉鴨經(jīng)急性噪聲應(yīng)激后可對(duì)組織產(chǎn)生一定影響，并引起HSP70表達(dá)量的變化。HSP90的高表達(dá)可維持機(jī)體應(yīng)激條件下細(xì)胞必需的蛋白質(zhì)構(gòu)象，對(duì)緩解應(yīng)激引起的細(xì)胞損害起著重要作用[12]。在本試驗(yàn)中，4個(gè)組織的HSP90 mRNA在應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)錄水平都極顯著上升，也與在肉雞的研究結(jié)果一致[13]。

綜上所述，急性噪聲應(yīng)激可對(duì)鴨內(nèi)臟組織細(xì)胞產(chǎn)生一定損傷，導(dǎo)致HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)水平的升高，噪聲強(qiáng)度越大，HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)水平越高，這提示我們?nèi)怿喸谠浊皯?yīng)避免高噪聲應(yīng)激，以免對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究減少肉鴨生產(chǎn)應(yīng)激、提高動(dòng)物福利提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

[1] ALGERS B， EKESBO I， SROMBERG S. The impact of continuous noise on animal health[J].ActaVeterinariaScandinavicaSupplementum， 1978， 19(67)：1-26.

[2] WAYNERT D F， STOOKEY J M， SCHWARTZKOPF-GENSWEIN K S， et al. The response of beef cattle to noise during handling[J].AppliedAnimalBehaviourScience， 1999， 62(1)：27-42.

[3] MOLINO， J A. Annoyance and noise [M]// HARRIS C M. Handbook of noise control [M]. [S.l.]: McGraw-Hill， 1979， 26(4)：41-51.

[4] MELAMED S， BRUHIS S. The effects of chronic industrial noise exposure on urinary cortisol， fatigue and irritability: a controlled field experiment[J].JournalofOccupational&EnvironmentalMedicine， 1996， 38(3):252-256.

[5] 王同國(guó)，史斌. 熱休克蛋白調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué)，2007，27(1)：73-76.

WANG T G， SHI B. The research progress of heat shock protein regulation[J].ModernImmunology， 2007， 27(1)：73-76. (in Chinese)

[6] 萬(wàn)莉莉，胡明華，史紹蓉，等. 運(yùn)動(dòng)應(yīng)激狀態(tài)下的心肌熱休克蛋白表達(dá)[J]. 中國(guó)組織工程研究，2014，18(38)：6216-6221.

WAN L L， HU M H， SHI S R， et al. Expression of myocardial heat shock protein under stress state[J].ChineseJournalofTissueEngineeringResearch， 2014， 18(38)：6216-6221. (in Chinese with English abstract)

[7] 羅靖旻，羅建新. 熱休克蛋白免疫作用的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2013，19(7)：1179-1181.

LUO J M， LUO J X.Research progress of the immunity of heat shock proteins[J].MedicalRecapitulate， 2013， 19(7)：1179-1181.(in Chinese with English abstract)

[8] 許生友，陳興勇，姜潤(rùn)深，等. 肉雞熱應(yīng)激下肝臟和下丘腦HSP70 mRNA的表達(dá)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，6(3)：112-116.

XU S Y， CHEN X Y， JIANG R S， et al. Expression of HSP70 mRNA in liver and hypothalamus in chicken under heat stress[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity， 2011， 6(3)：112-116. (in Chinese with English abstract)

[9] 計(jì)紅，吳永魁，胡仲明，等. 不同強(qiáng)度冷應(yīng)激下仔豬淋巴細(xì)胞HSP70 mRNA的轉(zhuǎn)錄規(guī)律[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13(4) ：507-509.

JI H， WU Y K， HU Z M， et al. HSP70 mRNA transcription in lymphocyte of piglets under cold stress with different intensities[J].ChineseJournalofAppliedandEnvironmentalBiology， 2007， 13(4) ：507-509. (in Chinese with English abstract)

[10] JI H， WU Y K， GUO J R， et al. Effects of cold stress on expression ofHsp70 gene in blood lymphocyte of piglets[J].JournalofAnimal&VeterinaryAdvances， 2012， 11(21)：3914-3920.

[11] MOSSER D D， CARON A W， BOURGET L， et al. Role of the human heat shock protein HSP70 in protection against stress-induced apoptosis[J].MolecularandCellularBiology， 1997， 17(9)：5317-5327.

[12] TANG M T， SUN M， LU M X， et al. Expression patterns of five heat shock proteins inSesamiainferens(Lepidoptera: Noctuidae) during heat stress[J].JournalofAsia-PacificEntomology， 2015， 18(3)：529-533.

[13] 雷蕾. 肉雞組織的熱應(yīng)激損傷與HSP90水平及其mRNA表達(dá)的變化 [D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008:9-15

LEI L. Corresponding mRNA in the heat-stressed broilers [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University， 2008:9-15. (in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯盧福莊)

InfluenceofnoiseonHSPsmRNAtranscriptionininternalorgansofmeatduck

ZHANG Yang1， CHEN Bowen1， BIAN Youqing2， WANG Zhaoshan3， XU Qi1， CHANG Guobin1， CHEN Guohong1，*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China; 2.JiangsuModernAnimalHusbandryScienceandTechnologyPark，Taizhou225300，China; 3.JiangsuEcoFoodCo.，Ltd，Suqian223800，China)

In order to clarify the physiological effects of noise on meat ducks and improve the animal welfare of meat ducks， 60 ducks were randomly divided into 3 groups. The 80 and 100 dB noise were applied by noise generator to establish stress model in experimental group 1 and 2， respectively. The control group did not apply noise stress. Liver， spleen， lung and kidney tissues were collected after the stress treatment. RT-PCR was used to detect the expression of HSP70 and HSP90 mRNA in each tissue. The results showed that transcription levels of HSP70 and HSP90 mRNA in the liver， spleen， lung and kidney of experimental group 1 and 2 were significantly higher than those in the control group (P<0.01)， and the transcription levels of HSP70 and HSP90 mRNA in experimental group 2 were significantly (P<0.01) higher than those in experimental group 1. Therefore， acute noise stress would increase the transcript of HSPs mRNA in the internal organs of meat ducks.

noise stress; meat duck; HSP70; HSP90

張揚(yáng)，陳博雯，卞友慶，等.噪聲對(duì)肉鴨內(nèi)臟組織熱休克蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(11): 1796-1799.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.04

2017-04-01

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[CX(15)1010;CX(14)2070]；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(16KJB230002)

張揚(yáng)(1986—)，男，山東臨沂人，博士，講師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：zyang@yzu.edu.cn

*通信作者，陳國(guó)宏，E-mail：ghchen@yzu.edu.cn

S834；X121

A

1004-1524(2017)11-1796-04